Summary
Genombrottskurvor (BTCs) är effektiva verktyg för att studera transport av bakterier i porösa medier. Här introducerar vi verktyg baserade på fluidiska enheter i kombination med mikroskopi och flödescytometrisk räkning för att erhålla BTC.
Abstract
Att förstå mikroorganismers transport, spridning och nedfall i porösa medier är en komplex vetenskaplig uppgift som omfattar så skilda ämnen som hydrodynamik, ekologi och miljöteknik. Att modellera bakterietransport i porösa miljöer på olika rumsliga skalor är avgörande för att bättre förutsäga konsekvenserna av bakterietransport, men nuvarande modeller misslyckas ofta till att upp-skala från laboratoriet till fältförhållanden. Här introducerar vi experimentella verktyg för att studera bakterietransport i porösa medier i två rumsliga skalor. Syftet med dessa verktyg är att få makroskopiska observabler (såsom genombrottskurvor eller depositionsprofiler) av bakterier som injiceras i genomskinliga porösa matriser. I den lilla skalan (10-1000 μm) kombineras mikrofluidiska anordningar med optisk videomikroskopi och bildbehandling för att få genombrottskurvor och samtidigt spåra enskilda bakterieceller i porskalan. I större skala kombineras flödescytometri med en egentillverkad robotdispenser för att få genombrottskurvor. Vi illustrerar nyttan av dessa verktyg för att bättre förstå hur bakterier transporteras i komplexa porösa medier som hyporheic zon av strömmar. Eftersom dessa verktyg ger samtidiga mätningar över skalor, bana de väg för mekanism-baserade modeller, kritiskt viktigt för uppskalning. Tillämpning av dessa verktyg kan inte bara bidra till utvecklingen av nya bioremediering applikationer men också kasta nytt ljus över de ekologiska strategier mikroorganismer kolonisera porösa substrat.
Introduction
Studier som syftar till att förstå transport av mikrober genom porösa medier har främst drivits av oro förkontaminering 1, överföring avsjukdom 2 och bioremediering3. I detta avseende har bakterier mestadels behandlats som partiklar i transportmodeller4 och processer som filtrering, sila, gravitationell sedimentering eller remobilisering från biofilmer har identifierats som förare av retention eller transport av mikrober5. Men att studera transport av bakterier genom porösa landskap kan också informera oss om de ekologiska strategier som ligger till grund för deras framgång i dessa komplexa miljöer. Ändå kräver detta nya experiment och matematiska modeller som verkar på encell, befolkning eller mikrobiell gemenskap nivå.
Naturliga porösa miljöer, såsom de som finns i hyporézonen av bäckar och floder, är tätt koloniserade av olika samhällen av biofilmbildande mikrober6. Biofilmer bildar strukturer som modifierar flödet och därmed transport och spridning av bakterier ivätskefasen 7,8. Transport av bakterier i porskala beror på den begränsade utrymme tillgängligheten i den porösa matrisen och motility-relaterade spridning kan vara ett effektivt sätt att öka den individuella konditionen genom minskad konkurrens om resurser i mindre tätbefolkade områden. Å andra sidan kan motila bakterier också nå mer isolerade regioner i den porösa matrisen och den utökade utforskningen av sådana områden kan ge ekologiska möjligheter att motila populationer10. Vid större rumsliga skalor, avleder biofilm tillväxt flödet vägar också leder till (partiell) igensättning av porer och, därmed, till inrättandet av ännu mer kanaliseras och heterogena flödesförhållanden11. Detta får konsekvenser för näringstillförsel och spridningsförmåga, frekvens och avstånd. Förmånsflöde, till exempel, kan generera så kallade "fast-tracks" och motila bakterier kan uppnå ännu högre hastigheter än det lokala flödet längs dessa spår12. Detta är ett effektivt sätt att öka utforskningen av nya livsmiljöer.
En mängd olika verktyg begagar sig för studier av transport av motila och icke-motila bakterier (och partiklar) i porösa medier. Numeriska modeller har stora prediktiva kapaciteter som är viktiga för tillämpningar, dock ofta begränsas av inneboende antaganden4. Experiment i laboratorieskala13,14 i kombination med modellering av genombrottskurva (BTC) har gett viktiga insikter i betydelsen av bakteriella cellytegenskaper för att fastna effektivitet15. Vanligtvis erhålls BTCs (dvs. gånger serie av partikelkoncentration på en fast plats) via konstant-rate releaser och mätning av cellnummer vid utflödet av den experimentella enheten. I detta sammanhang, BTCs återspeglar advection-dispersion dynamiken hos bakterier i den porösa matrisen och kan förlängas med en diskbänk sikt redovisning av kvarstad. Modellering av BCC ensam inte lösa dock rollen av rumslig organisation av det porösa substrat eller biofilm för transportprocesser. Andra makroskopiska observables som dispersivity eller deposition profiler har visat sig ge viktig information om den rumsliga fördelningen eller de bevarade partiklar eller växande samhällen. Microfluidics är en teknik som gör det möjligt att studera transporter i porösa medier genom mikroskopi undersökning9,12,16, och utom en nyligen arbete10, experimentella system är vanligtvis begränsas till en enda längd skala av upplösning, det vill säga porskalan eller hela fluidic enhet skala.
Här introducerar vi en svit av kombinerade metoder för att studera transporten av motila och icke-motila bakterier i porösa landskap i olika skalor. Vi kombinerar observationer av bakterietransport i porskalan med information i större skala, med hjälp av BTC-analys. Mikrofluidiska anordningar byggda av mjuk litografi med hjälp av polydimetylsiloxan (PDMS) är biokompatibla, resistenta mot en rad kemikalier, möjliggör replikerbarhet till låga kostnader och ger utmärkt optisk transparens samt låg autofluorescens som är kritisk för mikroskopisk observation. Mikrofluidik baserad på PDMS har tidigare använts för att studera transport av mikrober i enkla kanaler17 eller i mer komplexa geometrier12. Men typiskt mikrofluidik experiment fokus på kortsiktiga horisonter och epi-fluorescens mikroskopisk observation av levande celler är vanligen begränsad till genetiskt modifierade stammar (t.ex. GFP-taggade stammar). Här presenterar vi verktyg för att studera bakteriell transport med hjälp av PDMS-baserade mikrofluidiska enheter i kombination med mikroskopi och större enheter som är tillverkade av poly(metylmetakrylat) (PMMA, även känd som plexiglas) i kombination med flödescytometri. PDMS och PMMA skiljer sig åt i gaspermeabilitet och ytegenskaper, vilket ger komplementära möjligheter att studera bakterietransport. Medan den mikrofluidiska enheten ger en mer kontrollerad miljö, den större enheten möjliggör experiment under längre tidsperioder eller med hjälp av naturliga bakteriesamhällen. Mikroskopi som räknar med hög temporal upplösning i ett dedikerat område används för att erhålla BTC i den PDMS-baserade mikrofluidiska enheten. För att erhålla cellantal för BTC-modellering från den PMMA-baserade enheten introducerar vi en egenkonstruerad automatiserad vätskedispenser i kombination med flödescytometri. I denna inställning passerar celler den fluidiska enheten och lämnas i följd ut i 96 brunnsplattor. Den tidsmässiga upplösningen begränsas av den minsta volym som kan avdistlades exakt och därmed medelflödet genom den fluidiska enheten. Fixativ i brunnarna förhindrar tillväxt och underlättar DNA-färgning för nedströms flödes-cytometrisk uppräkning. För att förhindra bakterietillväxt under transport experiment vi använder en minimal medium (termed motility buffert).
Eftersom protokoll för beredning av fluidiska enheter i olika skalor är lätt tillgängliga, vi bara kortfattat införa tekniker för att producera sådana enheter och snarare fokusera på experimentella förfaranden för att spela in BTCs. På samma sätt finns olika rutiner för flödet cytometric uppräkning av mikrober och användare kräver expertkunskap för att tolka resultat som erhållits genom flödescytometri. Vi rapporterar den nya användningen av mikrofluidiska enheter i kombination med mikroskopisk avbildning för att registrera BTCs av fluorescently-taggade celler. I porskalan erhålls lokala hastigheter och banor med hjälp av bildbehandling. Vidare visar vi användningen av en PMMA-baserade fluidic enhet i kombination med flöde-cytometric räkna att observera bakteriell transport av motila och icke-motila celler i porösa miljöer koloniseras av en native stream biofilm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteriekulturens villkor
- Arbeta under en laminär flöde huva, använd 100 μL av ett glycerol lager av GFP-taggade Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 mL-1, lagras vid -80 °C) att inokulera 5 mL Luria-Bertani (LB) medium. Inkubera vid 30 °C medan du skakar vid 250 rpm över natten.
- Nästa dag, återanvänd 100 μL av övernattningskulturen i 5 mL LB-medium och inkubera under samma förhållanden för 5h (exponentiell fas). Provsök en 1 mL alikvot i ett 2 mL-rör, låt svalna till rumstemperatur (~15 min) och centrifug (2300 x g i 5 min).
- Ta bort supernatanten och tillsätt 1 mL motilitetsbuffert till pelleten. Vortex kort för att homogenisera provet. Späd för att nå önskad cellkoncentration, t.ex.5 -1
- För experiment som involverar naturliga samhällen, såsom de som härrör från vattendrag, förbereda en icke-selektiv odling medium. Använd till exempel sterilt filtrerat och autoklaverat strömvatten eller ett vattenmedium för artificiell ström som ändrats med ett komplext kol-medium.
2. Beredning av en mikrofluidisk anordning i polydimetylsiloxan (PDMS)
- Utforma önskad porös geometri med hjälp av datorstödd utarbetande (CAD) programvara18, som består av en matris av cirklar (som är det ogenomträngliga hindret för flöde), beskrivs med radie storlek och centrum koordinater.
OBS: Ett exempel på en porös geometri med randomiserade korn- och porstorlekar tillhandahålls i figur 1A. En observationskanal utan hinder nära utloppet underlättar anskaffningen av BIC. - Baserat på den valda geometrin, förbereda en form med hjälp av standard SU-8-photolithography18.
OBS: Alternativt kan formar också beställas från dedikerad mikrofabrikationsanläggning. För att erhålla heterogent vätskeflöde i det horisontella planet är det viktigt att utforma tjockleken på mikrofluidikkammaren av samma storleksordning som den genomsnittliga porstrupsstorleken. Se dock till att den mikrofluidiska enhetens dimensioner är lämpliga för observation under mikroskopet (t.ex. arbete med mikroskopglas). - Förbered 50 g PDMS genom att lägga till 10% av cross linker (dimetyl, metylväte siloxan copolymer) till 90% av elastomer i vikt, med hjälp av en spruta utan nål. Arbeta under rena förhållanden och undvik damm så mycket som möjligt. Blanda de två reagenserna i en ren engångsbehållare och applicera vakuum (100 mbar) i 30 min för att avlägsna upplöst luft och bubblor från de viskösa PDMS.
- Placera formen i en petriskål (100 mm i diameter, 15 mm hög). Häll PDMS på formen till önskad höjd (t.ex. 2-5 mm). Täck petriskålen och håll den vid 60 °C i 4 h (över natten för tjockare lager) för att bota.
OBS: För visualisering ändamål, ljus ska kunna passera genom PDMS, alltså, ett tunt lager mellan 2 mm till 5 mm är önskvärt. Tjockare skikt (>5 mm) minskar enhetstransparensen och tunnare utsätts för deformationer vid applicering. - Ta bort formen från ugnen och låt den mikrofluidiska enheten svalna till rumstemperatur. När den är kyld, ta försiktigt bort den önskade delen av PDMS med en skalpell.
OBS: Starka tryck på formen resulterar i mögelfrakturer. Rör inte PDMS med bara händer, eftersom fingeravtryck kommer att påverka den optiska genomskinligheten. - Förslut tillfälligt PDMS-kanalens botten (där den önskade geometrin har graverats) med tejp. Med en biopsistanser med 0,5 mm diameter, piercera mikrofluidisk kanal för att skapa ett inlopp och ett utlopp som passar tubingen 0,5 mm (innerdiameter).
OBS: DEN MJUKA KARAKTÄREN AV PDMS kommer att säkerställa täthet när slangen kommer att införas. In- och utloppskanaler kan inte göras efter att PDMS har förseglats till glaset. - Försegla den mikrofluidiska kanalen via syreplasmabindning med hjälp av högfrekvensgeneratorn (plasmabindare, Tabell av material). För detta rengör en silikatglassglasrutschbana (25 mm x 75 mm) med etanol och låt den torka. Ta bort tejp från PDMS-kanalen och placera kanalen med den porösa sidan uppåt. Behandla silikatglassglaset och PDMS-ytorna med plasma i ca 45 s vid rumstemperatur.
- Placera PDMS-kanalen på silikatglassglaset och värm vid 100 °C i 30 min på en värmeplatta.
- Ta bort den mikrofluidiska enheten från värmeplattan och kyl den till rumstemperatur. Anslut PDMS-kanalinloppet med slangar. Applicera vakuum i 30 min för att avlägsna luft från PDMS, som är nästan ogenomtränglig för vätskor men genomsläpplig för gas.
- Förbered 100 mL motility buffert (10 mM kaliumfosfat, 0,1 mM EDTA, kompletterad med 1% w/v glukos, pH 7.0) och injicera 1 mL av det i den mikrofluidiska enheten med hjälp av en spruta pump som drivs vid 10 μL min-1.
OBS: Eftersom PDMS är under-mättad i gas (på grund av föregående vakuum steg), kommer bubblor försvinna inom ~ 30 min.
3. Beredning av en fluidisk anordning i poly (metylmetakrylat)
- Utforma önskad geometri med CAD-programvaran. Om tillämpligt, se till att måtten är lämpliga för observation under mikroskopet (t.ex. mått på en standard 96 brunnsplatta i kombination med en lämplig hållare). Den fluidiska enheten är sammansatt av en bas (127 × 127 × 12 mm) och ett lock (127 × 127 × 12 mm) pmma.
OBS: Expertis med CAD-programvara rekommenderas. En teknisk ritning med exempel levereras i figur 1A. - För att framställa porfacket, med hjälp av hög precisionsmikr fräsning (WF31SA, Mikron), avlägsna 0,5 mm från botten PMMA-skiktet och fräsa ett spår (1,1 × 1,1 mm) för en O-ring i gummi. Borra 12 gängade hål (M5). Detta kommer att fungera som basen för den fluidiska enheten.
OBS: Dimensionerna på den fluidiska enheten behöver justeras för att passa mikroskopstadiet och fokalavståndet. En teknisk ritning levereras i figur S1. - Borra två gängade hål (typ 1/4-28UNF) för in- och utlopp in i den övre delen av den fluidiska enheten, och 12 hål (5,5 mm) för skruvarna. Detta kommer att fungera som locket på den fluidiska enheten.
OBS: Expertis inom mikro-fräsning är tillrådligt; författarna använder stöd från en specialiserad verkstad. - För att rengöra och sterilisera den fluidiska enheten före och efter varje användning, blötlägg basen och locket på den fluidiska enheten i HCl 7% och skölj tre gånger med avjoniserat vatten.
- Skruva ihop bas och lock med hjälp av de 12 gängade hålen.
4. Installation av automatiserad dispenser
OBS: Kommersiellt tillgängliga vätskeautomater är kostsamma och erbjuder ofta inte flexibiliteten att dispensera direkt från utflödet av den fluidiska enheten. Därför rekommenderas montering av ett billigt och flexibelt system för robotautomat från en XY Plotter Robot (Table of Materials).
- För att dosera utflödet från den fluidiska anordningen i 96 brunnsplattor, montera robotautomaten på en PMMA-platta och kvarnhåligheter på 85,8 x 128 mm med ett djup på 1 mm för att hålla flera 96 brunnsplattor.
- Fäst utflödesröret för den fluidiska enheten på robotarmen på dispensern.
- Att driva robotautomaten hämta bCNC från github: https://github.com/vlachoudis/bCNC och följ instruktionerna för att installera programmet.
- Ladda dispenser.py från det stödjande materialet i denna artikel.
OBS: Denna python kod ger en plugin till bCNC för en enkel robot dispenser layout. - Anslut robotdispensern till datorn som kör bCNC och identifiera rätt COM-port.
- I bCNC klickar du på hemknappen för att återföra robotautomaten till hempositionen.
OBS: Homing återför robotdispensern till ett känt läge (x=0, y=0) och förbättrar därför precisionen hos dispensern. - Före försöket, preparera ett tillräckligt antal 96 brunnsplattor, med brunnar som innehåller en lämplig mängd fixativ (t.ex. slutlig koncentration 3,7% formaldehyd).
OBS: Till exempel, vid ett flöde på 0,2 mL min-1, 100 μL dispenseras i varje brunn var 30:e s. Tillsätt därför 10 μL av 37% formaldehyd till varje brunn för att nå en slutlig koncentration av Formaldehyd mellan 2 och 4%. Använda åtta 96 brunns plattor gör det möjligt att driva experimentet i mer än 6 h med totalt 768 datapunkter. Observera dessutom att GFP-taggade celler kan förlora sin fluorescerande signal efter fixering med hjälp av formaldehyd.
5. Analysera bakterietransport med hjälp av PDMS mikrofluidiska anordningar
- Placera PDMS mikrofluidiska enheten tidigare mättad med motilitetsbufferten på mikroskopstadiet. Använd tejp för att fixera slangen för att minimera störningen av flödet under stegrörelsen.
- Flytta mikroskopet scenen till observationskanalen nära utlopp. Med hjälp av ljusa fältmikroskopi eller faskontrast, fokusera till centrum av observation kanal och justera förstoringen för att visualisera enskilda bakterieceller.
- Växla ljusbanans inställningar till fluorescensmikroskopi och justera kamerans exponeringstid för att lösa enskilda bakterieceller (t.ex. 100 ms), eller sådant att cellernas fluorescenssignaler är minst 3x starkare än bakgrundsbrus.
- Därefter för in inloppslangen i ett 2 mL-rör som innehåller bakterieupphängningen. Omvänd pumpriktning och börja dra tillbaka suspensionen vid ett flöde på 1 μL min-1.
- Skanna tvärsnittet av hela observationskanalen inspelning en sammansatt bild varje 2 min, över hela varaktigheten av experimentet.
6. Grundläggande bildbehandling
OBS: Målet med dessa grundläggande rutiner bildbehandling är att räkna antalet bakterier i de inspelade bilderna. Optimala bearbetningsrutiner beror på de tekniska specifikationerna för mikroskopet och kameran, samt på fluorescensegenskaperna hos den bakteriestam som används i försöket och därför behöver justeras.
- Exportera först bilder i .tiff format.
- Importera bilder till en önskad programvaruplattform (t.ex. MATLAB, ImageJ, R eller Python).
- Ta bort kamerabrus, vilket är en slumpmässig variation av pixelintensitet i bilder och korrigera för optisk aberration. Detta kan göras tillämpa en Gaussisk filter till varje bild: storleken på filtret beror på kvaliteten på kamerans sensor (t.ex. CCD eller CMOS). Den optiska aberrationen kan tas bort genom att normalisera varje bild genom en referensbild som samlats in i frånvaro av preparatet med samma optiska konfiguration.
- Beskär bilderna till en region av intresse.
- Identifiera ett tröskelvärde (pixelintensitet), sådant att värden över tröskelvärdet inkluderar bakterieceller.
OBS: I fall bilder är ojämnt belysta (på grund av optisk aberration eller brus) kan det vara bra att tillämpa en adaptiv tröskel, som väljer ett tröskelvärde baserat på lokala medelintensiteter. - Subtrahera från varje bild tröskelvärdet som definieras ovan.
- Binarize den resulterande bilden, så att bakterieceller tar värdet 1, medan bakgrund tar värdet 0.
- Ta bort kluster med ett område som är mindre än den minsta bakteriecellstorleken.
- Summera den binarerade bilden för att få fram det totala antalet pixlar för de återstående klustren. Dividera antalet pixlar med den genomsnittliga storleken (i pixlar) för en bakteriecell: detta ger en uppskattning av det totala antalet celler.
- Att veta djup sikt och område för undersökningen, omvandla räknas till koncentration (partiklar mL-1).
- Det är grundläggande att identifiera koncentrationen av de injicerade bakterier suspensionen. För att göra detta, injicera med en spruta 1 mL bakteriekultur suspension i observationskanalen av en ren mikrofluidisk enhet. Antjäna bilden och beräkna den influenta bakteriekoncentrationen (C0) enligt ovan (6.1 till 6.10).
- Analysera BTC genom att normalisera exffluent bakteriekoncentration (C) med influent bakteriekoncentration (C0) och plot C/C0 kontra tid.
7. Analysera bakterietransport i porskalan
- För att analysera lokala hastigheter och banor av bakterier som transporteras genom den porösa matrisen, flytta mikroskopet scenen till regionen av intresse och justera fokus till centrum av den mikrofluidiska enheten.
- Ställ mikroskop till ljusa fält eller faskontrast.
OBS: Detta endast i fall fluorescenssignalen av bakteriecell inte tillåter inspelning av bilder vid exponeringstid kortare än den genomsnittliga bakterietiden, annars använder fluorescensmikroskopi. - Registrera timelapse-bilder, vid exponeringstid som fångar upp bakterieförskjutning (kortare än den genomsnittliga förskjutningen över ett antal pixlar som är mindre än objektstorleken), och som optimerar detektion av bakterieceller (t.ex. exponering på 20 ms och bilder som spelas in var 50 ms). Spela in bilder över en tillräcklig tid för att kunna registrera tillräckligt (för att vara statistiskt representativ) av de långsammaste banor (t.ex. 3 min).
OBS: Kontrollera att datorn har tillräckligt med diskutrymme. - Om du vill ta bort bakgrundsbruset subtraherar du från varje bild medelvärdet av alla inspelade bilder. För att göra det, skapa en matris vars resultat är summan av intensiteten av alla bilder, för varje pixel, och dividera den med antalet bilder.
- Från den bearbetade bilden (Im), bestäm modulus av den numeriska gradienten
och normalisera den genom sitt maximala värde (max), enligt definitionen nedan.
- Binarize matrisen B via intensitetströskning, se steg 6,7-6,8.
- För varje tidpunkt, registrera bakterier koordinater (x, y i pixel eller mm) och tid för bild förvärv i en tre-kolumn fil.
- Slutligen, tillämpa en partikel spårning skript för att bearbeta inspelade data och beräkna banor av bakterierna. Använd för att exempel det etableradeprotokollet 19, och den fritt tillgängliga Koden för partikelspårning av Matlab: (http://site.physics.georgetown.edu/matlab/).
och normalisera den genom sitt maximala värde (max), enligt definitionen nedan.
8. Studera bakteriell filtrering med hjälp av nedfallsprofiler
- För att få deposition profiler av GFP-taggade P. putida KT2440 celler genom fluorescens mikroskopi, spela in en sammansatt bild av hela porösa kanalen innan, som är bakgrunden, och efter injektion av bakteriell suspension genom den mikrofluidiska enheten. Använd en exponeringstid som tillåter förvärvande av bakteriell fluorescerande signal (t.ex. 100 ms), utan att signalen bleks.
- Exportera bilder och importera i önskad mjukvaruplattform (se 6.1-6.2).
- Ta bort bakgrund från de bilder som spelats in efter bakteriell injektion.
- Integrera den totala fluorescenssignalen av kvarstående bakterier längs tvärgående sektioner av den porösa kanalen.
- För att beräkna depositionsprofilen, rita den integrerade florescencesignalen kontra porös kanallängd.
9. Analysera bakterietransport med hjälp av PMMA fluidic enheter och flödescytometri
- Anslut peristaltisk pump med inloppet med hjälp av slangar med 50 cm (1 mm innerdiameter), och utflödet med den automatiserade dispensern med hjälp av samma slang (50 cm, se avsnitt 4).
OBS: Använd pumpen för att dosera odlingsmedia, och för att injicera bakterieceller. Använd Luer-lockkontakter och trevägsventiler för att skifta mellan medel- och bakterieupphängning under konstanthastighetsfrisättningen. - Pump odlingsmedium i den fluidiska enheten. Notera ankomsten av medium vid utloppsslangen fastst till robotautomaten.
- Börja injicera bakterieupphängningen genom PMMA-fluidisk apparat vid en flödeshastighet på 0,2 mL min-1,
- När bakterier når fluidic enheten inlopp slå på den automatiserade dispenser.
- För att göra en pulsinsprutning, injicera bakteriell suspension för vissa porvolymer (t.ex. 30), och sedan byta injektion till odlingsmedia tills experimentslutet.
OBS: porvolymen hos fluidisk enhet är ungefär 0,2 mL, alltså vid den prosade flödeshastigheten varje minut en hel porvolym utbyts. - När en 96 brunnsplatta är avslutad, täck plåten för att minska avdunstningen och förvara den vid 4 °C.
- Analysera bakteriell förekomst via flödescytometri, efter etablerade protokoll20.
OBS: Tillsätt till exempel 25 μL av den grön-fluorescerande nukleinsyrafläcken (Table of Materials) vid 0,025 mM (i ultrarent vatten) till varje brunn. Det fläckar bakterie-DNA, vilket gör det möjligt att kvantifiera genom flöde cytometri den bakteriella överflöd. Inkubera prover i 15 min i mörker och analysera sedan med hjälp av en flödescytometer utrustad med en 488 nm laser och detektorer vid 515 nm. - Före BTC-analys, beakta spädningen av provet på grund av tillsats av fixativ och fläck. Korrigera bakteriellt överflöd med en faktor 1,35 att redogöra för fixativ och fläck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att illustrera funktionaliteten i det presenterade arbetsflödet utförde vi experiment med hjälp av genetiskt modifierade Pseudomonas putida KT2440, en gramnegativ motilbakterie som är viktig för bioremediering och bioteknik. Genetiskt modifierade versioner av denna stam som uttrycker GFP-produktion är kommersiellt tillgängliga. En icke-motil stam av P. putida KT2440 som saknar de relevanta strukturella och reglerande gener för motilitet finns också. Använda båda, motila och icke-motil GFP taggade P. putida KT2440, utförde vi sekventiella experiment i PDMS mikrofluidiska enheter med en slumpmässig array av pelare (Figur 1B) och inspelade BTCs (Figur 2A). BTRO:er har normaliserats till koncentrationen av injicerade celler (C0). Samtidigt visualiserades bakteriebanor vid porskalan via bildbehandling och partikelspårning enligt ovan (Figur 2B).
Därefter utförde vi experiment med storskaliga fluidiska enheter frästa från PMMA (Bild 1A). Motil och icke-motil P. putida KT2440 (icke-fluorescerande) injicerades i en regelbundet fördelade porösa matris och BTCs erhölls med hjälp av flytande dispenser och flödescytometriräkning enligt ovan (Figur 3A). Påfallande, i en porös miljö saknar biofilm, motila och icke-motila P. putida KT2440 visade en markant olika transport beteende. I en porös matris koloniserade för 48h med en komplex ström biofilm gemenskap, dessa skillnader i BTC mellan motil och icke-motil P. putida KT2440 försvann (Figur 3B.)
Bild 1: Fluidiska anordningar för att studera mikrobiell transport i porösa medier (A) Illustration av en fluidisk anordning som slipats från PMMA. Den porösa matrisen fräss in i enhetens underställ, locket stängs med hjälp av skruvar. Ett tvärsnitt visar upplägget av pelarna inom den fluidiska anordningen. Skäret visar en porös matris med ett regelbundet mellanslag av pelare och respektive hastighetsflödesfält. (B) PDMS-enheten är monterad på en mikroskopiglassglas. Påvisas in- och utflödet, anslutet till medelbehållaren respektive sprutans pump. Observationskammaren för mikroskopisk räkning placeras som en separat kammare utan en porös matris på samma mikroskopsglas. Skäret visar en porös matris med en slumpmässig matris av pelare (i diameter och avstånd). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Bakterietransport vid kanal- och porskala i PDMS-fluidikapparaten (A) BTC av motil och icke motil P. putida KT2440 (GFP-taggad) erhållen med en PDMS-mikrofluidisk anordning och mikroskopisk räkning. (B) Banor av icke-motila celler i porskalan. Färger väljs för att förstärka differentiering av banor. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Bakterietransport i kanal- och porvåg i PMMA-fluidikapparaten (A) BTC av motil och icke motil P. putida KT2440 (ej taggad) som erhållits med hjälp av en PMMA-fluidisk apparat och flödes-cytometriräkning. (B) Den fluidiska enheten koloniserades av en naturlig ström gemenskap för 2 dagar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Tekniska ritningar av DEN FLUIDISKA ENHETEN PMMA. Enheten består av en basenhet som innehåller den porösa matrisen och en lockenhet med hålen för inloppet och utloppet. Enheten är förseglad med hjälp av 12 skruvar och en O-ring. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här föreslår vi två sätt att studera transport av mikrober genom porösa system på encells- och populationsnivå. Medan studiet av transportfenomen med hjälp av BTC-modellering har gett värdefulla insikter om spridningen av patogener eller föroreningar vid ekosystemskalorna, finns det fortfarande svårigheter att skala från laboratorieexperiment till fältförhållanden. De verktyg som beskrivs här gör det möjligt för forskare att experimentellt lösa de rumsliga och tidsmässiga skalorna för att bättre förstå de ekologiska strategier för mikrober som är relevanta för transport i porösa miljöer. Försöksledarna får använda eller ändra dessa system för att studera andra mikrobiella egenskaper än motilitet, såsom chemotaxis eller kvorumavkänning eller modifiera geometrin eller andra livsmiljöegenskaper hos den porösa matrisen. Dessutom, med hjälp av dessa system den bakteriella transport beteende kan lätt kopplas till deposition profiler, som ger viktiga insikter i kolonisering mönster och är avgörande för att förstå hur biofilmer ändra lokala flödesfält. Vi räknar med att en bättre förståelse av mikrobiella strategier för att skingra och kolonisera porösa medier kommer att förbättra modellen förutsägelser och därmed bidra till förvaltningen av patogen spridning eller föroreningar inneslutning. Ytterligare modifieringar av systemet kan också bidra till utvecklingen av nya filtreringsanordningar eller bioteknikverktyg där celler måste separeras fysiskt.
Vi rekommenderar PMMA-baserade enheter för stora och långsiktiga experiment och PDMS-baserade enheter för mindre, kortare sikt experiment eller när hög temporal upplösning är kritisk. Det måste hållas i minnet att de två materialen har olika egenskaper. Till exempel PDMS är genomsläpplig för gas som syre, medan PMMA är gas tight. Denna skillnad kan användas för att studera gasförbrukning i PMMA-scenariot, medan PDMS kan vara mer lämpliga för experiment där syrebegränsningar relaterade till bakteriell andning är oönskade.
I allmänhet är de protokoll som beskrivs här lätt reproducerbara och data som erhålls med hjälp av dessa verktyg avslöjar konsekvent skillnader i transport av motila och icke-motila bakterier. Den självtillverkade vätskedispensern får ersättas av ett kommersiellt tillgängligt alternativ. Men av mångsidighets- och kostnadseffektivitetsskäl rekommenderar vi den som beskrivs här. Kritiska steg i protokollet gäller främst hanteringen av de fluidiska enheterna och erfarenhet av bildbehandling. Kvaliteten på de data som erhålls genom bildanalys beror kritiskt på bildkvaliteten (huvudsakligen bestämd efter fokus och exponeringstid) och en lämplig tröskelstrategi. Datakvalitet som erhålls genom flöde-cytometric räkna kritiskt beror på effektiv fastställande och färgning av cellerna och expertis i tolkningen av flöde-cytometry resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi erkänner hjälp av Antoine Wiedmer med installationen av robotautomaten och dispenser.py skriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
- Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review. Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. Processes in microbial transport in the natural subsurface. Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).
- Tufenkji, N. Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).
- Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media. Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).
- Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. The ISME Journal. 1, (2019).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale. Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).
- Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review. Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).
- Creppy, A., Clément, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium. Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).
- Camesano, T. A., Logan, B. E. Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media. Environmental Science & Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).
- Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand. Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).
- Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).
- Long, T., Ford, R. M. Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor. Environmental Science & Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13. Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).
