Summary
3D 다색 DNA FISH는 3D 보존 핵 내에서 다중 게놈 궤시를 시각화하는 도구를 나타내며, 단일 세포 수준에서 핵 공간 내에서 상호 상호 작용 및 국소화를 명확하게 정의합니다. 여기서, 단계별 프로토콜은 인간 1차 세포의 광범위한 스펙트럼에 대해 기재된다.
Abstract
세포 생물학에 있는 중요한 질문은 핵 공간 내의 게놈 조직 및 어떻게 염색질 건축이 유전자 발현, 세포 정체성 및 분화와 같은 프로세스에 영향을 미칠 수 있는지입니다. 게놈의 3D 건축을 연구하기 위하여 개발된 많은 접근은 염색체 형성 포착 기지를 둔 기술 (C 기술) 및 화상 진찰의 2개의 상보적인 종류로 분할될 수 있습니다. 전자는 고정 된 세포의 집단에서 염색체 형태와 근위 DNA 상호 작용을 캡처에 기초하는 동안, 후자는, 3D 보존 핵에 대한 체형 혼성화 (FISH)의 DNA 형광에 기초하여, 현대 시각화를 허용 단일 세포 수준에서 다중 위치 (다중 색), 핵 내에서 그들의 상호 작용 및 분포를 검사 (3D 다색 DNA FISH). 3D 다색 DNA FISH의 기술은 핵 아키텍처의 포괄적 인 분석을 허용하지 않고 몇 개의 미리 결정된 궤위만 시각화하는 데 한계가 있습니다. 그러나, 그 결과의 견고성을 감안할 때, 3D 다색 DNA FISH는 3D 현미경 검사법 및 심상 재구성과 결합하여 C 기술 기반 결과를 검증하고 특정 로시의 위치와 조직을 명확하게 연구할 수 있는 방법입니다. 단일 셀 수준에서. 여기서, 우리는 광범위한 인간 1 차 세포에 적합한 3D 다색 DNA FISH의 단계별 방법을 제안하고 성공적이고 유익한 3D 다색을 얻기 위해 필요한 모든 실용적인 행동, 중요한 단계, 3D 이미징 및 데이터 분석에 대한 개념을 논의합니다. 다른 생물학적 맥락 내에서 DNA 물고기.
Introduction
더 높은 진핵생물은 체계적으로 응축하고 핵1,2,3,4의 분 3D 공간에서 유전 정보의 엄청난 양을 압축할 필요가있다. 오늘, 우리는 게놈이 구획 및 위상으로 연관된 도메인5에서 공간적으로 주문되고 DNA 접기의 다중 수준이 염색질 루프 대형6,7을관련시킬 수 있는 다른 게놈 지구 사이 접촉을 생성한다는 것을 알고 있습니다. 염색질의 3D 동적 루핑은 전사8,9,분화 및 개발10,11,DNA 수리12,13,다양한 질병에 관여하는 동안14,15, 16 및 발달 결함15,17,18과같은 다양한 생물학적 과정에 영향을 미칠 수 있습니다.
3D 게놈 조직을 연구하기 위해 많은 접근법이 개발되었습니다. 염색체 형성 포획 기반 기술(C-기술, 3C, 4C, 5C, Hi-C 및 유도체)은 고정 세포3,4,19,20에서게놈 조직을 연구하기 위해 개발되었다. 이러한 접근법은 물리적 근접에서 게놈 궤위 사이의 접촉 주파수를 포착하는 능력에 기초한다. C-기술은 그 복잡성에 따라, 세포 집단의 글로벌 3D 게놈 조직 및 핵 토폴로지를잡는다 3,4,19,20. 그럼에도 불구하고, 3D 상호작용은 시간과 공간에서 동적이며, 멀티플렉스 상호작용으로 구성된 개별 세포 들 사이에서 매우 가변적이며, 광범위하게 이질적인21,22이다.
3D 다색 DNA 형광을 현장에서 혼성화(FISH)는 단일 세포 수준에서 특정 게놈 궤변을 시각화할 수 있는 기술로, C-기술에 대한 보완적인 방식으로 3D 핵 아키텍처에 대한 직접 적인 조사가 가능합니다. 현재 C-결과의 유효성을 명확하게 확인하는 데 사용되는 기술을 나타냅니다. 3D 다색 DNA FISH는 관심 있는 게놈 성소에 상보적인 형광 표지 프로브를 사용합니다. 상이한 형광단 및 적합한 현미경 장비의 사용은 핵 공간23,24내의 여러 표적의 현대 시각화를 가능하게 한다. 최근, FISH는 고해상도25,26 또는 CRISPR-Cas 접근법과 함께 정밀한 스케일 구조의 시각화를 얻기 위해 현미경 검사법의 기술적 진보와 결합되어 라이브 이미징27,28에서핵산의 시각화를 위한접근법을가지고 있다. 광범위한 채택에도 불구하고, 사용되는 생물학적 물질이 적응되어야하기 때문에 3D 다색 DNA FISH 접근법은 여전히 많은 실험실에서 어려운 것으로 간주됩니다.
여기에서는 광범위한 인간 1차 세포에 적용할 수 있는 3D 다색 DNA FISH(세포/프로브 준비에서 데이터 분석까지)를 위한 포괄적인 프로토콜을 제공하여 다중 게놈 궤적의 시각화를 가능하게 하고 핵의 3D 구조를 보존합니다. 핵 건축을 연구하기 위해서는 핵의 3D 구조를 보존해야 한다. 이러한 이유로, 다른 기존프로토콜(29,30,31)과는 대조적으로, 우리는 크로마틴구조에영향을 미칠 수 있는 알코올의 구배 및 커버슬립의 저장을 피한다. 상기 방법은 보존된 3D DNA FISH프로토콜(24,33)으로부터 적응되어 광범위한 인간 1차 세포에 적용될 수 있으며, 둘 다 생체외에서 분리된 생체내 또는 배양된다. 상이한 핵 형태 및 세포학적 특성(예를 들어, 다른 정도의 핵 다짐, 세포골격 풍부)에 대한 투과 및 탈백인 매개변수가있다 34. 이들 파라미터는 일반적으로 상이한 세포 유형 내에서 절차의 명확한 차별을 제공하지 않고, 다른 프로토콜24,33에서설명된다. 또한 NuCLθD(3D의 핵 접촉 로케이터)라는 특정도구를 개발하여 자동화된 방식으로 핵 공간 내의 다른 동위층과 핵 위상 분포 사이의 3D 근접성을 개선하는 데이터 분석 원칙을 제공합니다.
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Protocol
1. 닉 번역을 가진 DNA 탐사기 준비 및 표지 절차
- 정화 하고 깨끗한 세균성 인공 염색체 (BACs), 플라스미드 또는 PCR 제품을 특정 키트(재료 표)로재중단하고 ddH2O로 재중단하고 아가로즈 젤에 전기 영동으로 확인하고 정량화하십시오.
- 표 1에따라 모든 시약을 0.5 mL 저결합 DNA 튜브에 혼합하여 50 μL의 최종 부피로 1.1 단계로부터 1.5-2 μg의 DNA에 닉 번역을 수행한다.
참고: 직접 라벨이 부착된 프로브는 신호 대 잡음 비를 향상시킬 수 있습니다. 닉 번역에 의해 다양한 알렉사 플루오로크롬을 사용하여 간접및 직접 라벨이 부착된 프로브를 생산하는 키트가 시판되고 있습니다. - 시작 DNA 물질의 길이에 따라 한 동안 16°C에서 열 믹서에 닉 번역 믹스를 배양합니다: PCR 제품(각각 2,000 bp의 PCR 제품 풀)의 경우 45분, BAC DNA 및 플라스미드의 경우 최대 4시간.
- 2.2% 아가로즈 겔에 전기 동공에 의해 1.3 단계에서 생성 된 프로브의 크기를 확인합니다.
참고: 최적의 프로브 크기는 <200bp(그림 1A)입니다.- DNA가 충분히 소화되지 않으면, 반응에 DNA 폴리머라제 I 및 0.05 U의 5 U를 첨가하고 16°C에서 1-2시간 동안 배양한 후 다시 확인한다. 0.5 mM EDTA (최종 농도)로 반응을 중지합니다. 프로브를 -20°C로 저장합니다.
- 각 DNA FISH 실험에 대해, 프로브가 생성되는 시작 DNA 물질에 따라 다음과 같은 양의 프로브를 침전시: 닉 번역 PCR 제품에서 200 ng, 닉 번역 BACs에서 100 ng, 또는 닉 번역 플라스미드에서 300 ng. ddH2O 최대 150 μL, 20 μg의 라벨이 없는 연어 정자 DNA, 3.5 μg의 종별 Cot-1 DNA, 3 부피 100% EtOH, 1/10 부피 3 M 아세테이트 pH 5.2를 추가합니다. 1 시간 동안 -80 °C에서 침전.
- 4 °C에서 1 시간 동안 최대 속도로 원심 분리기를 폐기하고 상한체를 폐기하십시오. 펠릿을 70% EtOH로 두 번 씻으십시오.
- 펠렛을 100% 포마미드 pH 7.0의 2 μL로 다시 일시 중단하고, 40°C에서 30분 동안 흔들어 (몇 시간 걸릴 수 있음) 4x 식염수-나트륨 구연산염(SSC)/20% 덱란 황산염의 동일한 부피를 추가합니다.
- 175.3 g의 NaCl과 88.2 g의 구연산나트륨을 H2O. 오토클레이브의 최종 부적에 혼합하여 20x SSC를 준비하고, 알리쿼트들을 걸과 준비한다.
참고 : 다색 DNA FISH의 경우 서로 어닐로 할 수있는 프로브를 제외하고 다른 프로브를 함께 침전 시킬 수 있습니다. 이러한 특정 한 경우에, 그들을 별도로 치료, 침전 및 프로브의 수에 대하여 단계 1.5-1.7에 언급 된 시약을 분할 하는 프로브를 다시 일시 중단. 포르마미드에서 재서스펜션 후에만 프로브를 풀합니다. 유리 커버가 10mm 이하또는 10mm 미만인 경우 슬라이드 크기에 비례하여 1.5-1.7 단계에 사용된 시약의 부피를 확장/축소합니다. 혼성화 프로브는 오랜 기간(최대 2개월)동안 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
- 175.3 g의 NaCl과 88.2 g의 구연산나트륨을 H2O. 오토클레이브의 최종 부적에 혼합하여 20x SSC를 준비하고, 알리쿼트들을 걸과 준비한다.
2. 세포 고정, 전처리 및 투과
참고: 투과 및 탈백통로는 중요한 단계입니다. 시약의 반응 및 농도는 세포 유형, 세포질 풍부 및 핵 형태에 따라 크게 달라집니다.
- 인간의 1 차 적인 T 림프구에 대 한 세포 고정, 전처리 및 투과
참고 :이 프로토콜은 작은 핵과 적은 양의 세포질이있는 작은 세포에 적합합니다.- 유리 커버슬립(10mm, 두께 1.5H)을 사용하십시오.
- ddH2O로 유리를 씻은 다음 70 % EtOH로 씻고 건조시십시오. 24웰 플레이트의 각 우물에 한 잔을 사용하십시오.
- 0.1% 폴리-L-리신(w/v)의 200 μL을 유리에 직접 추가하여 한 방울을형성합니다. 드롭은 2-5 분 동안 우물을 건드리지 않고 유리 표면에 남아 있어야합니다.
- 단계 2.1.3을 두 번 더 수행합니다.
- 200 μL의 현탁액 세포(2 x 10 6/mL, PBS 현탁액의 생체 내 1차 T 림프구)를 유리에 직접 놓고, 세포가 실온(RT)에서 30분 동안 종자화할 수 있도록 한다.
- 드롭을 빠르게 제거합니다. 갓 만든 4% PFA(PBS/0.1% TWEEN 20, pH 7.0, 여과)를 10분 동안 추가하고 RT에서 시드 세포를 고쳤다.
- RT에서 0.05% 트리톤 X-100/PBS(TPBS)로 5분 동안 3회 세척하고 RT에서 10분 동안 0.5% TPBS로 페메라빌화합니다.
- 2.5 μL의 RNase 칵테일(재료표)을PBS/웰 250 μL에 37°C에서 1시간 동안 24웰 플레이트에 추가하여 RNase 처리를 수행합니다.
- PBS에서 헹구고, 글리세롤/PBS 20%를 추가하고, 4°C에서 밤새 배양(ON)합니다.
참고: 이 단계는 1시간에서 ON까지 다양합니다. 슬라이드는 4 °C에서 최대 7 일까지 20 % 글리세롤 / PBS로 보관 할 수 있습니다. - 드라이 아이스(15−30s)에 얼린 후 RT에서 서서히 해동하고 글리세롤/PBS 20%에 담가세요. 2.1.9단계를 세 번 반복합니다.
- RT에서 0.5% TPBS로 0.5% TPBS를 0.05% TPBS로 세척하고, RT에서 5분 동안 2회, RT. 인큐베이트에서 0.1 N HCl에서 2x SSC에서 12분 동안 2회 동안 세척하십시오.
- RT에서 50% 포름아미드 pH 7.0/2x SSC ON으로 인큐베이션합니다.
참고: 인큐베이션 시간을 최적화하고 결국 줄일 수 있습니다. 슬라이드는 며칠 동안 50 % 포름 아미드 / 2 x SSC에 보관 할 수 있습니다.
- 인간 1차 근세포에 대한 세포 고정, 전처리 및 투과
참고 :이 프로토콜은 세포질의 높은 금액과 큰 세포에 적합합니다.- 성장 배지 (덜베코의 변형 된 독수리 배지 (DMEM), 20 % 태아 소 혈청 (FBS), 25 ng / mL 섬유 아세포 성장 인자 (FGF), 10 ng / mL 표피 성장 인자 (EGF), 10 μg / mL 인간에서 24 웰 플레이트에서 커버 슬립 안경에 직접 인간의 기본 근세포 성장, 1x 글루타민, 1 x 페니실린 / 스트렙 토마이신) 적어도 24 시간 (합류의 50-70 %에 도달).
참고: 밀착을 용이하게 하기 위해, 젤라틴 또는 콜라겐 또는 폴리-L-리신은 시딩 전에 커버슬립을 코팅하는데 사용될 수 있다. - PBS의 2−3 변경에서 세포를 헹구. 갓 만든 4 % PFA를 추가하고 RT에서 10 분 동안 세포를 고정하십시오.
- RT에서 0.01% TPBS에서 3분 동안 3회 세척하십시오.
- 2.5 μL의 RNase 칵테일(재료표)을PBS/웰 250 μL에 37°C에서 1시간 동안 24웰 플레이트에 추가하여 RNase 처리를 수행합니다.
- PBS에서 헹구고, 글리세롤/PBS 20%를 추가하고, RT에서 ON을 배양하십시오.
참고: 이 단계는 1시간에서 ON까지 다양합니다. 슬라이드는 4 °C에서 최대 7 일까지 20 % 글리세롤 / PBS로 보관 할 수 있습니다. - 드라이 아이스(15−30s)에 얼린 후 RT에서 서서히 해동하고 글리세롤/PBS 20%에 담가세요. 이 단계를 세 번 반복합니다.
- PBS에서 각각 10분 동안 세 번 세 번 씻으시고. RT. 린스에서 0.1 N HCl에서 2x SSC로 5분 동안 배양합니다.
- RT에서 50% 포름아미드 pH 7.0/2x SSC ON으로 인큐베이션합니다.
참고: 인큐베이션 시간을 최적화하고 결국 줄일 수 있습니다. 슬라이드는 며칠 동안 50 % 포름 아미드 / 2 x SSC에 보관 할 수 있습니다. - 평형 슬라이드(50% 포름아미드/2x SSC에 보관)를 2x SSC에서 2분 동안 유지합니다. 그런 다음 PBS에서 3 분 동안 평형화하십시오.
- 세포 유형에 따라 몇 초에서 최대 5 분까지 0.01 N HCl / 0.0025 % 펩신으로 치료하십시오. 이 단계에서, 광학 현미경의 밑에 세포를 관찰하고 핵이 세포질에서 자유로이 되는 즉시 반응 (단계 2.2.11)을 중단하고, 그들의 구조를 그대로 유지하면서 (예를 들어, 핵소체는 여전히 가시적이고 손상되지 않음).
- 50 mM MgCl 2/PBS에서 각각 5분동안 2회 세척하여 펩신을 비활성화합니다.
- 1% PFA/PBS에서 1분 동안 사후 수정하십시오. 2x SSC에서 5분 동안 두 번 씻은 다음 50% 포름아미드/2x SSC를 30분 이상 추가합니다.
- 성장 배지 (덜베코의 변형 된 독수리 배지 (DMEM), 20 % 태아 소 혈청 (FBS), 25 ng / mL 섬유 아세포 성장 인자 (FGF), 10 ng / mL 표피 성장 인자 (EGF), 10 μg / mL 인간에서 24 웰 플레이트에서 커버 슬립 안경에 직접 인간의 기본 근세포 성장, 1x 글루타민, 1 x 페니실린 / 스트렙 토마이신) 적어도 24 시간 (합류의 50-70 %에 도달).
3. 3D 다색 DNA 물고기 혼성화
- 프로브를 80°C에서 5분 동안 변성한 다음 얼음위에 빠르게 올려 놓습니다.
- 깨끗한 현미경 슬라이드에 혼성화 프로브를 로드합니다. 혼성화 프로브의 드롭에 거꾸로 셀커버 슬립을 켭니다.
- 커버 슬립을 고무 시멘트로 밀봉합니다. 고무 시멘트를 완전히 건조시키십시오. 그런 다음 가열 블록에 슬라이드를 놓고 75 °C에서 4 분 동안 변성하십시오.
참고: 변성 타이밍과 변성 온도는 최대 80°C까지 증강할 수 있습니다. - 수조에 떠있는 금속 상자에 37 °C ON에서 혼성화하십시오.
참고: 신호 대 잡음 비율을 향상시키기 위해 하이브리드화 온도는 최대 42°C까지 올라갈 수 있습니다. - 고무 시멘트를 벗기고 슬라이드를 2x SCC에 담그고 유리 커버 슬립을 제거하고 6 웰 플레이트에서 2 x SSC로 옮깁니다.
- 2x SSC를 37°C에서 5분 동안 3회 3회 세척하고, 인큐베이터 셰이커에서 90 rpm에서 흔들어 줍니다. 인큐베이터 셰이커에서 90 rpm에서 흔들어, 60°C에서 각각 5분 동안 0.1x SSC로 3회 세척합니다. 4x SSC/0.2% 트위넨 20으로 간략하게 헹시다.
4. 3D 다색 DNA 물고기 검출
참고: 직접 레이블이 지정된 프로브의 경우 4.1 단계와 4.2단계를 건너뜁니다.
- 4x SSC/0.2% TWEEN 20/4% 소 혈청 알부민(BSA)에서 24웰 플레이트에서 37°C에서 20분 동안 블록하고, 인큐베이터 셰이커에서 20 rpm에서 흔들어 줍니다.
- 반 디갈산소인 (1:150) 및 / 또는 스트렙타비딘 (1: 1,000)(재료 표)의적절한 농도로 배양하여 4 x SSC / 0.2 % TWEEN 20 / 4 % BSA에서 37 °C의 어둡고 습한 챔버에서 35 분 동안 희석하십시오.
- 4x SSC/0.2% TWEEN 20을 37°C에서 5분 동안 3회 세척하고, 인큐베이터 셰이커에서 6웰 플레이트에서 90 rpm에서 흔들어 줍니다.
- 24웰 플레이트에서 RT에서 2%의 포름알데히드/PBS로 PBS와 사후 수정을 평형화합니다.
참고: 직접 라벨이 부착된 프로브는 사후 고정이 필요하지 않습니다. - PBS에서 5배 간세척합니다. RT에서 5 분 동안 1 ng / mL DAPI (4,6-디아미디노-2-페니 린들)/PBS로 얼룩.
- PBS에서 5배 간세척합니다. 안티 페이드 솔루션(재료 표)와함께 마운트합니다.
5. 3D 다색 DNA 물고기 현미경 검사법 및 분석
- 현미경 시스템으로 3D 이미지를 수집합니다.
참고: 여기서, 연속적인 단면 사이 0.2−0.25 μm의 축 거리를 가진 광시야 현미경이 사용된다(그림 1B). - 다양한 소프트웨어 및 도구를 사용하여 3D 이미지 스택을 분석합니다(여기, NuCLθD 또는 핵 접촉 로케이터(3D).
참고 : 도구 NuCLθD는 형광 세포 이미지 z 스택에서 3D 다색 DNA FISH를 자동으로 분석하기 위해 개발되었습니다. NuCLθD는 세포 이미지 스택에서 핵을 3D로 재구성하고 형광 3D 반점을 감지하고 국소화합니다. 핵의 반점(예: 핵의 중심으로부터의 거리 및/또는 핵의 주변으로부터의 거리)과 각 핵 및 중간 반점 거리의 최대 반경을 측정합니다. 사용된 도구와 알고리즘은 Cortesi 등16에완전히 설명되어 있습니다. - NuCLθD에서 검색한 데이터(예: 지정된 게놈 로시와 핵 중심 및 접촉 주파수 사이의 3D 거리)를 분석합니다.
참고: 지정된 게놈 궤체와 핵 중심 사이의 3D 거리의 경우 각 핵의 최대 반지름에서 거리를 정규화하고 이러한 데이터를 핵 중심에서 정규화된 거리의 주파수 분포로 나타냅니다. 장거리 상호 작용 연구의 경우, 접촉 주파수는 변화할 수 있고 약 2 μm35를넣을 수 있는 임계값 인터-거리와 함께 10-20%21의 범위에 있어야 한다.- 통계 분석을 수행하려면 생물학적 복제당 약 100개의 핵을 분석합니다. 지정된 게놈 궤변 사이의 3D 거리를 선택한 임계값 간 거리 미만의 거리의 누적 주파수 분포로 나타내고 t-test를 사용하여 분포의 차이의 유의성을 평가합니다. 또한 선택한 임계값 간 거리 미만의 상호 작용에 대해 핵 양성 비율을 계산하고 Fisher의 정확한 테스트를 사용하여 백분율차이의 유의성을 평가합니다.
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Representative Results
이 문서에서 기술된 3D 다색 DNA FISH의 방법은 보존된 3D 핵 내의 다른 게놈 성소의 현대 시각화를 허용합니다(그림 1B). 이 프로토콜은 그들의 공간 근접성을 평가하고, 핵 공간 내의 위치(예를 들어, 핵의 중심 또는 주변으로부터의 좌위 거리) 16내에서 그들의 위치를 평가하기 위해 대두, 및 상이한 게놈 좌위 사이의 거리를 측정할 수 있도록한다 16. 그러나 사용되는 각 셀 유형에 대해 정확하고 구체적으로 설정해야 하는 많은 중요한 단계가 있습니다. 3D 다색 DNA FISH의 성공을 위해 다음 단계에 특히주의를 기울이는 것이 좋습니다.
DNA 프로브 준비의 경우 프로브 크기가 <200bp(그림 1A)인지확인합니다. 이 크기는 3D 다색 DNA FISH의 성공적인 절차를 보장합니다(그림 1B). 닉 번역에 의해 생성된 최적이 아닌 DNA FISH 프로브는 부분적으로 소화될 수있다(도 2A)또는 과다 소화(도2B). 부분적으로 소화된 프로브를 사용하면 프로브가 핵에 진입하고 상보적 게놈 로치에 적절하게 혼성화되지 못하기 때문에 세포에 신호가 없습니다. 과다 소화된 프로브는 혼성화의 특이성 손실 및 결과적으로 배경의 증가로 인해 비특이적 신호를 초래할 것이다. 도 3B에서 최적의 소화된 프로브와 비교하여 과소화된 프로브의 대표적인 예가 그림 3A에 나와있습니다.
탈단백질화 및 펩시니화의 경우 세포 유형에 따라 이 단계를 따르십시오. 특히 핵 크기와 세포질 풍부를 고려하십시오. 인간 1차 생체외 염실선 T 림프구 및 작고, 고도로 압축된 핵 및 낮은 풍부한 세포질세포를 가진 세포의 경우, HCl 탈단백질화는 매우 중요하다. 5 분 동안 0.1 N HCl로 치료하는 것은 DNA FISH 시각화에 충분하지 않습니다. 0.1 1 N HCl 치료는 DNA 프로브에 대한 핵 접근성을 촉진하고 핵 무결성을 보존하는 것이 좋습니다(그림 4A). 세포질의 펩신 소화는 DNA FISH의 양호한 신호를 얻기 위해 필요하지않다(도 4B).
큰 핵과 풍부한 세포질이있는 인간 1 차 근세포 및 세포의 경우 펩시니화 단계는 근본적입니다. 세포골격의 짧고 최적이 아닌 펩시니화는 DNA FISH 신호의 부재에서 끝나는핵(그림 4C)에서프로브의 진입을 방해할 것이다. 그러나 세포가 펩시니화되면 핵은 그대로 유지되지 않습니다(그림 4D),그들의 3D 구조를 잃고. 성공적인 3D 다색 DNA FISH의 예는 도 4E.
혼성화 하는 동안, 커버 슬립을 정확 하 게 밀봉; 그렇지 않으면 프로브가 분산되고 건조됩니다. 분뇨 및 혼성화 단계는 프로브 및 게놈 DNA가 다시 안절부절되지 않도록 신속하게 수행되어야 합니다. 변성 기간을 늘릴 수 있습니다.
그림 1: 대표적인 DNA 프로브 및 3D 다색 DNA FISH. (A)닉은 2.2% 아가로즈 겔(레인 1, 2), 50 bp 마커(M)에서 최적의 크기의 DNA 프로브를 번역하였다. (B)대표적인 3D 다색 DNA FISH 핵은 인간 1차 근세포에서 3q11.2 영역(녹색), 10q26.3 영역(적색) 및 8q24.13 영역(마젠타)에 매핑되는 프로브를 이용하여. 핵은 DAPI (파란색)로 반염색됩니다. 63배 배율. 배율 표시줄 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 최적으로 소화되지 않은 DNA FISH 프로브의 예. (A)소화되지 않음(레인 1, 2) 또는 부분적으로 소화(레인 3) 닉 번역된 DNA 프로브는 2.2% 아가로즈 겔, 2log 마커(M)에서 실행된다. (B)이상 소화된 닉 번역 된 DNA 프로브는 2.2 % 아가로즈 겔, 2 log 마커 (M)에서 실행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 최적이 아닌 또는 최적의 DNA FISH 프로브를 사용한 3D 다색 DNA FISH의 비교. (a)대표적인 3D 다색 DNA FISH 핵을 인간 1차 근세포에서 8q24.13 영역(magenta)으로 과소화된 프로브 매핑을 이용하여. 핵은 DAPI (파란색)로 반염색됩니다. 63배 배율. 스케일 바 = 10 μm.(B)대표적인 3D 다색 DNA FISH 핵을 사용하여 인간 1차 근세포에서 8q24.13 영역(magenta)으로 최적으로 소화된 프로브 매핑을 사용한다. 핵은 DAPI (파란색)로 반염색됩니다. 63배 배율. 배율 표시줄 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 3D 다색 DNA FISH 결과에 대한 최적이 아닌 단백 탈백 및 펩시니화 단계의 가능한 결과. (a)대표적인 3D 다색 DNA FISH 핵인간 1차 T 림프구는 0.1 N HCl로 5분(왼쪽) 또는 12분(오른쪽)으로 처리되었으며, 프로브 매핑을 사용하여 8q24.13 영역(녹색)으로 처리하였다. 핵은 DAPI (파란색)로 반염색됩니다. 100배 배율. 스케일 바 = 10 μm.(B)대표적인 3D 다색 DNA FISH 핵을 0.1 N HCl(왼쪽)으로 12분 동안 처리하거나 0.01 N HCl/0.0025% 펩신과 결합하여 2분 동안 8q24.13 영역(녹색)으로 프로브 매핑을 사용하였다. 핵은 DAPI (파란색)로 반염색됩니다. 100배 배율. 스케일 바 = 10 μm.(C)대표적인 3D 다색 DNA FISH 핵을 8q24.13 영역(magenta)으로 프로브 매핑을 사용하여 짧고 최적이 아닌 펩시네화로 처리한 인간 1차 심세포체의 핵. 핵은 DAPI (파란색)로 반염색됩니다. 63배 배율. 스케일 바 = 10 μm.(D)대표적인 3D 다색 DNA FISH 핵을 8q24.13 영역(magenta)으로 프로브 매핑을 사용하여 장기간 펩시네화 단계로 처리한 인간 1차 심세포체의 핵. 핵은 DAPI (파란색)로 반염색됩니다. 63배 배율. 스케일 바 = 5 μm.(E)대표적인 3D 다색 DNA FISH 핵을 8q24.13 영역(magenta)으로 프로브 매핑을 사용하여 최적 HCl/펩신 조건으로 처리하였다. 핵은 DAPI (파란색)로 반염색됩니다. 63배 배율. 배율 표시줄 = 25 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 닉 번역 시약 | 초기 농도 | 최종 농도 |
| DNTP (C-G-A) | 0.5 mM | 0.05 mM |
| dTTP | 0.1 mM | 0.01 mM |
| 비오틴/디그/사이3 dUTP | 1 mM | 0.02 mM |
| 트리스 HCl pH 7.8 | 1 M | 50 mM |
| MgCl2 | 100 mM | 5 mM |
| β-메르카포에탄올 | 100 mM | 10 mM |
| Bsa | 100 ng/μL | 10 ng/μL |
| DNA 폴 I | 10 U/μL | 0.1 U/μL |
| DNase I | 1 U/μL | 0.002 U/μL |
| DNA 2 μg | Ⅹ | Ⅹ |
| ddH2O | 최대 50 μL |
표 1: 닉 번역. 모든 시약을 설명하는 테이블, 그들의 농도 및 닉 번역 반응에 대한 제안 된 타이밍.
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Discussion
현재의 방법은 광범위한 인간 1차 세포에서 3D 다색 DNA FISH를 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 설명한다. DNA FISH는 광범위하게 사용되는 기술이지만, 보존된 3D 상간 핵에 대한 3D 다색 DNA FISH는 주로 사용되는 시료의 특성으로 인해 많은 실험실에서 수행하기가 여전히 어렵다23,24.
프로브 닉 번역은 성공적인 3D 다색 DNA FISH를 위한 기본적인 단계입니다. 많은 상이한 기질(BAC, 포스미드, 플라스미드, PCR 제품)이 이러한 반응에 사용될 수 있으며, 반응 및 효소 농도의 타이밍은 기판의 길이에 대하여 그에 따라 조절될 수 있다. 적절한 프로브 소화는 근본적이다(그림1)비최적 프로브로서(도2)신호 또는 비특이적 신호가 발생하지 않을 것이다(그림3A). 투과, 탈단백질화 및 펩시니화 단계는 사용된 세포 유형에 강하게 의존하는 중요한 통로입니다. 작은 핵과 낮은 세포 골격 풍부를 가진 세포, 예 : 생체 외 분리 T 림프구, 장기간 0.1 N HCl 치료와 탈단백질이 필요합니다. 또한, 트리톤 X-100의 높은 비율을 가진 PBS에 있는 안식은 이 세포의 핵에 있는 탐사선 입력을 도울 수 있습니다. 반대로, 시험관 내에서 더 큰 핵을 제시하는 인간 1 차 근세포는 세포 골격의 함량이 높으며 펩신과 함께 세포 질 구조의 소화가 필요합니다. 이러한 일반적인 역할은 광범위한 세포에 적용될 수 있으며, 결국 특정 세포 특성에 따라 상이한 단계를 결합할 수 있다.
갓 제조 된 생물학적 물질, 신선한 용액 (특히 세제용 용액) 및 형광 시약의 사용은 강력하게 제안됩니다 : pH 7.0에서 여과 된 PFA; pH 7.0에서 20x SSC를 오토클레이브 및 필터링; pH 7.0에서 여과된 포름아미드; 뉴클레아제 자유물; 수정 된 UTP의 일회용 알리쿼트. 20% 글리세롤/PBS, 또는 50% 포름아미드/2x SSC로 장기간 배양하면 혼성화를 촉진할 수 있습니다. HCl 및 펩신 치료는 더 증가 될 수있다. 혼성화의 타이밍, 프로브의 양, 항 디곡시게닌 및 스트렙타비딘의 배양 의 농도 및 타이밍은 모두 신호 대 잡음 비를 개선하기 위해 더 조정할 수 있습니다.
3D 다색 DNA FISH는 C 기반 결과를 검증하는 표준 방법인 C-기술에 대한 보완적인 도구를 나타낸다. 3D 현미경 검사법 및 분석과 결합하는 경우에, 3D 다색 DNA FISH는 단 하나 세포 수준에 있는 핵 공간 내의 게놈 성 소시와 그들의 위상 분포 사이 근접을 감시할 수 있습니다. 3D 다색 DNA FISH는 게놈 로시, RNA (메신저 RNA 또는 조절 비 코딩 RNA) 및 광범위한 사이의 역학 및 상호 작용에 대한 포괄적 인 개요를 위해 RNA FISH 및 면역 형광과 같은 다른 방법론과 더 통합 될 수 있습니다. 핵 구조를 시각화하고 세포 정체성을 섭감시키는 후생 유전학 메커니즘을 조사 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다.
초고해상도25,26,라이브 셀 이미징27,28,36,단일 분자 검출37,올리고뉴클레오티드 어레이를 가진 여러대상의 현대 시각화와 3D 고처리량 접근법39,기술의 한계는 소정의 유성 중계엽의 이산 수로 남아 있음에도 불구하고, 기술의 한계는 여전히 소정의 게장 성엽의 이산 수로남아 있다. 시각화할 수 있습니다. 이것은 핵 아키텍처의 광범위한 분석을 방지합니다. 몇몇 연구는 최근 바코드 DNA FISH40,41,42,43과같은 단일 세포에서 게놈 조직을 해결하기 위한 혼성화의 순차적 방법을 기술하였다. 한 번에 테스트할 수 있는 궤적의 수가 증가함에 따라 3D 다색 DNA FISH의 단세포 특성을 게놈 넓은 특징에 결합하여 핵 아키텍처 이질성을 이미징 기술로 광범위하게 시각화하는 데 더욱 많은 노력이 필요할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 INGM 이미징 시설 (이스티투토 나치오날레 디 유게코콜라 몰레콜라 "로미오 에드 엔리카 인버니치"(INGM), 밀라노, 이탈리아, 특히 C. Cordiglieri의 기술 지원을 인정, 3D 다채 DNA FISH 이미지 동안 도움 수집. 이 작품은 B.B.에 다음과 같은 보조금에 의해 지원되고있다: EPIGEN 이탈리아어 주력 프로그램, 협회 프랑수아즈 콘트 레 Myopathies (AFM-텔레톤, 그랜트 nr 18754) 및 조바니 Ricercatori, 건강의 이탈리아 정부 (GR-2011-02349383). 이 작품은 F.M.에 다음과 같은 보조금에 의해 지원되고있다: 폰다지오네 카리플로 (반도 조바니, 부여 nr 2018-0321).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
- van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
- Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
- Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
- Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
- Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
- Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
- Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
- Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
- Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
- Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
- Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, Pt 2 64-72 (2015).
- de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
- Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
- Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
- Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
- Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
- Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
- Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , Chapter 4, Unit 4 15 (2013).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
- Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
- Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
- Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
- Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
- Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
- Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
- Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
- Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).
