Summary
3D multicolor DNA FISH representerar ett verktyg för att visualisera flera genomiska loci inom 3D bevarade kärnor, entydigt definiera deras ömsesidiga interaktioner och lokalisering inom kärnområdet på en enda cell nivå. Här beskrivs ett steg för steg protokoll för ett brett spektrum av mänskliga primära celler.
Abstract
En viktig fråga inom cellbiologi är genomisk organisation inom kärnområdet och hur kromatinarkitekturen kan påverka processer som genuttryck, cellidentitet och differentiering. Många metoder som utvecklats för att studera 3D-arkitekturen i genomet kan delas in i två kompletterande kategorier: kromosomkonformation fånga baserad teknik (C-teknik) och avbildning. Medan den förstnämnda bygger på att fånga kromosomkonformisering och proximala DNA-interaktioner i en population av fasta celler, möjliggör den senare, baserad på DNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) på 3D-konserverad kärnor, samtida visualisering av flera lokpå en enda cellnivå (multicolor), undersöka deras interaktioner och distribution inom kärnan (3D multicolor DNA FISH). Tekniken för 3D multicolor DNA FISH har en begränsning av att visualisera endast ett fåtal förutbestämda lok, inte tillåter en omfattande analys av kärnarkitekturen. Med tanke på robustheten i dess resultat är 3D multicolor DNA FISH i kombination med 3D-mikroskopi och bildrekonstruktion en möjlig metod för att validera C-teknikbaserade resultat och att entydigt studera position och organisation av specifika loki på en enda cellnivå. Här föreslår vi en steg för steg metod för 3D multicolor DNA FISH lämplig för ett brett spektrum av mänskliga primära celler och diskutera alla praktiska åtgärder, avgörande steg, föreställningar om 3D-bildframställning och dataanalys som behövs för att få en framgångsrik och informativ 3D multicolor DNA FISH i olika biologiska sammanhang.
Introduction
Högre eukaryoter måste systematiskt kondensera och komprimera en enorm mängd genetisk information i minuten 3D-rymden av kärnan1,2,3,4. Idag vet vi att genomet är rumsligt beställt i fack och topologiskt associerade domäner5 och att de många nivåerna av DNA-vikning generera kontakter mellan olika genomiska regioner som kan innebära kromatin loop formation6,7. Den dynamiska 3D-loopning av kromatin kan påverka många olika biologiska processer såsom transkription8,9, differentiering och utveckling10,11 , DNA reparation12,13, medan dess störning är inblandade i olika sjukdomar14,15,16 och utvecklingsdefekter15,17,18.
Många metoder har utvecklats för att studera 3D-genomorganisationen. Kromosomkonformation capture-baserad teknik (C-teknik, 3C, 4C, 5C, Hi-C och derivat) har utvecklats för att studera genomorganisation i fasta celler3,4,19,20. Sådana metoder bygger på förmågan att fånga kontaktfrekvenserna mellan genomisk loci i fysisk närhet. C-teknik, beroende på deras komplexitet, fånga den globala 3D-genomorganisationen och kärntopologi av en cellpopulation3,4,19,20. Ändå är 3D-interaktioner dynamiska i tid och rum, mycket varierande mellan enskilda celler som består av multiplexinteraktioner och är i stor utsträckning heterogena21,22.
3D multicolor DNA fluorescens in situ hybridisering (FISH) är en teknik som möjliggör visualisering av specifika genomiska lokus på en enda cell nivå, vilket möjliggör direkt undersökning av 3D nukleär arkitektur på ett kompletterande sätt till C-teknik. Det representerar en teknik som för närvarande används för att entydigt validera C-resultat. 3D multicolor DNA FISH använder fluorescerande märkta sonder som kompletterar den genomiska loci av intressen. Användningen av olika fluoroforer och lämplig mikroskopiutrustning möjliggör modern visualisering av flera mål inom kärnområdet23,24. Under de senaste åren har FISH kombinerats med tekniska framsteg inom mikroskopi för att få visualisering av finskaliga strukturer med hög upplösning25,26 eller med CRISPR-Cas metoder för visualisering av nukleinsyror i levande bildbehandling27,28. Trots bred användning anses 3D multicolor DNA FISH-metoden fortfarande vara svår i många laboratorier eftersom det biologiska material som används måste anpassas.
Här tillhandahåller vi ett omfattande protokoll för 3D multicolor DNA FISH (från cell / sond förberedelse till dataanalys) gäller för ett brett spektrum av mänskliga primära celler, vilket möjliggör visualisering av flera genomiska loci och bevara 3D-strukturen av kärnor. För att studera kärnarkitektur måste kärnkärnans 3D-struktur bevaras. Av denna anledning, kontrasterande från andra befintliga protokoll29,30,31,undviker vi användning av en alkoholgradient och lagring av täckslips i alkohol som kan påverka kromatin struktur32. Metoden är anpassad från konserverade 3D DNA FISH protokoll24,33 som skall tillämpas på ett brett spektrum av mänskliga primära celler, både isolerade ex vivo eller odlade in vitro. Det finns permeabiliserings- och deproteiniseringsparametrar för olika nukleärmorfologi och cytologiska egenskaper (t.ex. olika grader av kärnpackning, cytoskelettförekomst)34. Dessa parametrar beskrivs ofta allmänt i andra protokoll24,33, utan att ge en tydlig diskriminering av förfarandet inom olika celltyper. Dessutom utvecklade vi ett specifikt verktyg som heter NuCLεD (nukleära kontakter locator i 3D)16, som ger principer för dataanalys som kommer att förbättra 3D-närheten mellan olika lokoch deras nukleära topologiska distribution inom kärnområdet på ett automatiserat sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förfaranden och märkning av DNA-sond med nicköversättning
- Rena och rena bakteriella konstgjorda kromosomer (BACs), plasmider eller PCR-produkter med specifika satser (Materialförteckning), omfördelning i ddH2O, kontrollera genom elektrofores på en agarosgel och kvantifiering.
- Utför nicköversättning på 1,5−2 μg DNA från steg 1.1 i en slutlig volym på 50 μL genom att blanda alla reagenser i ett 0,5 ml lågbindande DNA-rör enligt tabell 1.
OBS: Direktmärkta sonder kan förbättra signalen till brusförhållandet. Kit för att producera indirekt och direkt märkta sonder med olika Alexa fluorochromes genom nick översättning är kommersiellt tillgängliga. - Inkubera nick översättningsmixen i en termisk mixer vid 16 °C under en tid beroende på längden på start-DNA-materialet: 45 min för PCR-produkter (en pool av PCR-produkter på 2 000 bp vardera) och upp till 4 timmar för BAC DNA och plasmider.
- Kontrollera storleken på de sonder som produceras i steg 1,3 genom elektrofores på en 2,2% agarose gel.
Den optimala sondstorleken är <200 bp (figur 1A).- Om DNA inte smälts tillräckligt, tillsätt 5 U DNA-polymeras I och 0,05 U DNase I till reaktionen och inkubera för 1−2 h vid 16 °C och därefter återkontrollera. Stoppa reaktionen med 0,5 mM EDTA (slutlig koncentration). Förvara sonder vid -20 °C.
- För varje DNA FISH experiment, fäller följande mängder av sonder beroende på start DNA-material från vilket sonderna produceras: 200 ng från nick översattPCR produkter, 100 ng från nick översatt ACs, eller 300 ng från nick översatt plasmid. Tillsätt ddH2O upp till 150 μL, 20 μg omärkt lax spermie-DNA, 3,5 μg artspecifikt Cot-1 DNA, 3 volymer om 100% EtOH och 1/10 volym 3 M natriumacetat pH 5.2. Fäll ut vid -80 °C i 1 tim.
- Centrifug med maximal hastighet i 1 h vid 4 °C och kassera supernatanten. Tvätta pelleten två gånger med 70% EtOH.
- Omdu återupphäver pelleten i 2 μL 100% formamid pH 7.0, skaka vid 40 °C i 30 min (kan ta upp till några timmar) och tillsätt sedan en lika stor volym av 4x saltlösning (SSC)/20% dextransulfat.
- Förbered 20x SSC genom att blanda 175,3 g NaCl och 88,2 g natriumcitrat i en slutlig volym av 1 L h2O. Autoklav, filtrera och förbereda alikvoter.
OBS: För multicolor DNA FISH, de olika sonderna kan fällas ihop med undantag för sonder som kan anneal med varandra. I dessa specifika fall, behandla dem separat, fäll ut och omfördela sonderna som delar reagenser som nämns i steg 1,5−1.7 med avseende på antalet sonder. Slå samman sonderna först efter resuspension i formamid. Om glasöverdrag som överstiger 10 mm eller mindre än 10 mm används, skala upp/ned volymen på de reagenser som används i steg 1,5−1,7 proportionellt mot glidstorleken. Hybridiseringsonder kan förvaras vid -20 °C under en längre tid (upp till två månader).
- Förbered 20x SSC genom att blanda 175,3 g NaCl och 88,2 g natriumcitrat i en slutlig volym av 1 L h2O. Autoklav, filtrera och förbereda alikvoter.
2. Cellfixering, förbehandling och genomträmang
OBS: Permeabilization och deproteinization passager är avgörande steg. Tiden för reaktion och koncentration av reagenser beror starkt på celltypen, cytoplasmans överflöd och nukleär morfologi.
- Cellfixering, förbehandling och genomföring för humana primära T-lymfocyter
OBS: Detta protokoll är lämpligt för små celler, med små kärnor och en låg mängd cytoplasma.- Använd glastäcken (10 mm, tjocklek nr 1,5H).
- Tvätta glaset med ddH2O, sedan med 70% EtOH och låt dem torka. Använd ett glas för varje brunn av en 24-brunnsplatta.
- Tillsätt 200 μL på 0,1% poly-L-lysin (w/v) (Materialförteckning) direkt på glaset för att bilda en droppe. Var uppmärksam när droppen måste finnas kvar på glasytan utan att vidröra brunnen i 2−5 min. Lämna ut droppen försiktigt och låt glaset torka i 30 min.
- Utför steg 2.1.3 två gånger till.
- Sätt 200 μL suspensionsceller (2 x 106/ml, PBS suspension av ex vivo primära T-lymfocyter) direkt på glaset, låt cellerna frö vid rumstemperatur (RT) i 30 min.
- Ta snabbt bort droppen. Tillsätt nygjord 4% PFA (beredd i PBS/0,1% TWEEN 20, pH 7.0, filtrerad) i 10 min och fixa de seedade cellerna vid RT.
- Tvätta tre gånger i 5 min vardera med 0,05% Triton X-100/PBS (TPBS) vid RT. Permeabilize med 0,5% TPBS i 10 min vid RT.
- Utför behandling med RNase genom att tillsätta 2,5 μL RNase-cocktail(Materialtabell)i 250 μL PBS/well i en 24-brunnsplatta i 1 h vid 37 °C.
- Skölj i PBS, tillsätt 20% glycerol/PBS och inkubera över natten (ON) vid 4 °C.
OBS: Detta steg kan variera från 1 h till ON. Diabilder kan förvaras i 20% glycerol/PBS vid 4 °C upp till 7 dagar. - Frys på torris (15−30 s), tina gradvis vid RT och blötlägg i 20% glycerol/PBS. Upprepa steg 2.1.9 ytterligare tre gånger.
- Tvätta i 0,5% TPBS i 5 min vid RT. Tvätta i 0,05% TPBS, två gånger i 5 min vid RT. Inkubera i 0,1 N HCl i 12 min vid RT. Skölj i 2x SSC.
- Inkubera i 50% formamid pH 7.0/2x SSC ON vid RT.
OBS: Inkubationstiden kan optimeras och så småningom minskas. Diabilder kan förvaras i 50% formamid/2x SSC i flera dagar.
- Cellfixering, förbehandling och genomföring för humana primära myoblaster
OBS: Detta protokoll är lämpligt för stora celler, med en stor mängd cytoplasma.- Odla humana primära myoblaster direkt på täckglasen i 24-brunnsplattor i tillväxtmedium (Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM), 20% fetalt nötkreatursserum (FBS), 25 ng/ml fibroblast tillväxtfaktor (FGF), 10 ng/ml epidermal tillväxtfaktor (EGF), 10 μg/ml humaninsulin, 1x glutamin, 1x penicillin/streptomycin) i minst 24 timmar (når 50−70% av sammanflödet).
OBS: För att underlätta vidhäftning, gelatin eller kollagen eller poly-L-lysin kan användas för att täcka täckslipen före sådd. - Skölj celler i 2−3-förändringar av PBS. Tillsätt nygjord 4% PFA och fixa cellerna i 10 min på RT.
- Tvätta tre gånger i 3 min vardera i 0,01% TPBS vid RT. Permeabilize i 0,5% TPBS i 10 min vid RT.
- Utför behandling med RNase genom att tillsätta 2,5 μL RNase-cocktail(Materialtabell)i 250 μL PBS/well i en 24-brunnsplatta i 1 h vid 37 °C.
- Skölj i PBS, tillsätt 20% glycerol/PBS, och inkubera PÅ RT.
OBS: Detta steg kan variera från 1 h till ON. Diabilder kan förvaras i 20% glycerol/PBS vid 4 °C upp till 7 dagar. - Frys på torris (15−30 s), tina gradvis vid RT och blötlägg i 20% glycerol/PBS. Upprepa det här steget tre gånger.
- Tvätta tre gånger i 10 min vardera i PBS. Inkubera i 0,1 N HCl i 5 min på RT. Skölj i 2x SSC.
- Inkubera i 50% formamid pH 7.0/2x SSC ON vid RT.
OBS: Tiden för inkubation kan optimeras och så småningom minskas. Diabilder kan förvaras i 50% formamid/2x SSC i flera dagar. - Ekvilibrera diabilder (hålls i 50% formamid/2x SSC) i 2x SSC i 2 min. Sedan, jämvikt i PBS i 3 min.
- Behandla med 0,01 N HCl/0,0025% pepsin från några sekunder upp till 5 min, beroende på celltyp. Observera under detta steg cellerna under ett optiskt mikroskop och stoppa reaktionen (steg 2.2.11) så snart kärnorna är fria från cytoplasman, samtidigt som deras struktur hålls intakt (t.ex. nuklolerna är fortfarande synliga och intakta).
- Inaktivera pepsin genom att tvätta två gånger i 5 min vardera i 50 mM MgCl2/PBS.
- Efter fix i 1% PFA/PBS i 1 min. Tvätta i 5 min i PBS. Tvätta två gånger i 5 min vardera i 2x SSC, och tillsätt sedan 50% formamid/2x SSC i minst 30 min.
- Odla humana primära myoblaster direkt på täckglasen i 24-brunnsplattor i tillväxtmedium (Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM), 20% fetalt nötkreatursserum (FBS), 25 ng/ml fibroblast tillväxtfaktor (FGF), 10 ng/ml epidermal tillväxtfaktor (EGF), 10 μg/ml humaninsulin, 1x glutamin, 1x penicillin/streptomycin) i minst 24 timmar (når 50−70% av sammanflödet).
3. 3D multicolor DNA FISH hybridisering
- Denature sonderna vid 80 °C i 5 min, och sedan sätta snabbt på is.
- Ladda hybridiseringssonderna på en ren mikroskopbild. Vänd täcksmen med celler upp och ner på droppen av hybridiseringssonder.
- Försegla täcksen med gummicement. Låt gummicementen torka helt. Placera sedan diabilder på ett värmeblock och denature r i 4 min.
OBS: Tidpunkten för denaturering och temperaturen på denmättnaden kan förstärkas, upp till 80 °C. - Hybridisera vid 37 °C ON i en metalllåda som flyter i ett vattenbad.
OBS: För att förbättra signalen till bullerförhållandet kan hybridiseringstemperaturen gå upp till 42 °C. - Skala av gummicement, sänk ned diabilderna i 2x SCC, ta bort glastäcken och överför den till 2x SSC i 6-brunnsplatta.
- Tvätta i 2x SSC tre gånger i 5 min vardera vid 37 °C, skaka vid 90 rpm i en inkubator shaker. Tvätta i 0,1 x SSC tre gånger i 5 min vardera vid 60 °C, skaka vid 90 varv/min i en inkubatorshaker. Skölj kort i 4x SSC/0,2% TWEEN 20.
4. 3D multicolor DNA FISK detektion
Obs! För direktmärkta sonder, hoppa över steg 4.1 och 4.2.
- Block i 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% bovint serum albumin (BSA) i 20 min vid 37 °C i en 24-brunnsplatta, skaka vid 20 varv/min i en inkubator shaker.
- Inkubera med lämplig koncentration av antidigoxygenin (1:150) och/eller streptavidin (1:1 000) (Materialtabell) utspädd i 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% BSA i 35 min i en mörk och våt kammare vid 37 °C.
- Tvätta i 4x SSC/0,2% TWEEN 20 tre gånger i 5 min vardera vid 37 °C, skaka vid 90 varv/min i en 6-brunnsplatta i en inkubatorshaker.
- Equilibrate i PBS och post-fix i 2% formaldehyd/PBS för 2 min vid RT i en 24-brunnsplatta.
Obs! Direkt märkta sonder behöver inte efterfixering. - Tvätta 5x kort i PBS. Fläck med 1 ng/mL DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)/PBS i 5 min vid RT.
- Tvätta 5x kort i PBS. Montera med antifadelösning (Materialtabell).
5. 3D multicolor DNA FISH mikroskopi och analys
- Skaffa 3D-bilder med mikroskopsystem.
OBS: Här används ett widefield mikroskop med ett axiellt avstånd på 0,2−0,25 μm mellan på varandra följande sektioner (figur 1B). - Analysera 3D-bildstackar med olika programvara och verktyg (här, NuCLεD eller Nuclear Contacts Locator i 3D).
OBS: Verktyget NuCLεD har utvecklats för att automatiskt analysera 3D multicolor DNA FISH i fluorescens cell bild z-stackar. NuCLεD rekonstruerar kärnorna från cellbildstackar i 3D samt upptäcker och lokaliserar fluorescerande 3D-fläckar. Den mäter den relativa placeringen av fläckar i kärnan (t.ex. avstånd från kärnor och/eller periferi av kärnorna) och den maximala radien för varje kärna och mellanplatser avstånd. Verktyget och den algoritm som används beskrivs fullständigt i Cortesi et al.16. - Analysera data (t.ex. 3D-avstånd mellan specificerad genomisk lokus och kärncentroid- och kontaktfrekvenserna) som hämtats av NuCLεD.
OBS: För 3D-avstånd mellan specificerad genomisk loci och kärncentroid, normalisera avstånden på den maximala radien för varje kärna och representera dessa data som frekvensfördelningar av normaliserade avstånd från kärncentroid. För interaktionsstudier med lång räckvidd ska kontaktfrekvenser ligga inom intervallet 10−20%21 med ett tröskelavstånd som kan variera och kan placeras runt 2 μm35.- För att utföra statistisk analys, analysera cirka 100 kärnor per biologisk replika. Representera 3D-avstånd mellan specificerad genomisk loci som kumulativa frekvensfördelningar av avstånd som ligger under det valda tröskelvärdet och använd ett t-testför att bedöma betydelsen av skillnader i fördelningarna. Beräkna också andelen kärnor som är positiva för de interaktioner som ligger under det valda tröskelvärdet och använd Fishers exakta test för att bedöma betydelsen av skillnader i procentsatserna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden för 3D multicolor DNA FISH beskrivs i denna artikel tillåter samtida visualisering av olika genomiska loci inom konserverad 3D-kärnor(figur 1B). Detta protokoll tillåter mätning av avstånd mellan alllerar och olika genomisk lokus för att utvärdera deras rumsliga närhet och att bedöma deras läge inom kärnområdet (t.ex. lokavstånd från centroid eller periferin av kärnorna)16. Det finns dock många viktiga steg som måste ställas in korrekt och specifikt för varje celltyp som används. Det rekommenderas starkt att ägna särskild uppmärksamhet åt följande steg för framgång för 3D multicolor DNA FISH.
För DNA-sondberedning, kontrollera att sondstorleken är <200 bp (figur 1A). Denna storlek säkerställer ett framgångsrikt förfarande för 3D-multifärgs-DNA FISH(figur 1B). Suboptimala DNA FISKsonder som produceras genom nicköversättning kan delvis smältas(figur 2A) eller över smälta(figur 2B). Med delvis smälta sonder, kommer förfarandet har ingen signal i cellerna, på grund av oförmågan hos sonden att komma in i kärnan och korrekt hybridisera till den kompletterande genomiska loci. Över smälta sonder kommer att resultera i en ospecifik signal, på grund av en förlust av specificitet i hybridiseringen och en därav följande ökning av bakgrunden. Ett representativt exempel på översmälta sonder visas i figur 3A jämfört med en optimal smält sond i figur 3B.
För deproteinisering och pepsinisering, följ dessa steg enligt celltypen. I synnerhet ta hänsyn till kärnstorlek och cytoplasma överflöd. För mänskliga primära ex vivo isolerade T-lymfocyter och celler med små, mycket kompakta kärnor och låg riklig cytoplasma, HCl deproteinization är avgörande. Behandling med 0,1 N HCl i 5 min är inte tillräcklig för DNA FISH visualisering. 0.1 N HCl-behandling i 12 min rekommenderas för att främja kärnors tillgänglighet till DNA-sonder och bevara nukleär integritet(figur 4A). Pepsinmation av cytoplasman behövs inte för att få en bra signal om DNA FISH(figur 4B).
För mänskliga primära myoblaster och celler som har stora kärnor och riklig cytoplasma, pepsinization steg är grundläggande. En kort och suboptimal pepsinisering av cytoskelettet kommer att hindra sondens inträde i kärnorna (figur 4C), som slutar i avsaknad av dna-fisksignal. Men om cellerna är över pepsiniserade, kärnor kommer inte att förbli intakt(figur 4D), förlora sin 3D-struktur. Ett exempel på framgångsrika 3D multicolor DNA FISH finns i figur 4E.
Under hybridisering, försegla täcksen korrekt; Annars kommer sonden att skingra och torka. Denaturation och hybridisering steg måste utföras snabbt så att sonden och genomiska DNA inte kommer reanneal. Denaturationens varaktighet kan ökas.
Figur 1: Representativa DNA-sonder och 3D-multifärgs-DNA-FISKAR. (A)Nick översatta DNA-sonder av optimal storlek körs på en 2,2% agarose gel (körfält 1, 2), 50 bp markör (M). (B)Representativ3D multicolor DNA FISH kärna med hjälp av sonder kartläggning till 3q11.2 region (grön), 10q26.3 region (röd) och 8q24.13 region (magenta) i mänskliga primära myoblaster. Nuclei är motfärgade med DAPI (blå). 63x förstoring. Skalbar = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Exempel på inte optimalt smälta DNA-FISKARsonder. (A)Inte smält (körfält 1, 2) eller delvis smält (lane 3) nick översatta DNA-sonder körs på en 2,2% agarose gel, 2log markör (M). (B)Över smälta nick översatta DNA-sonder körs på en 2,2% agarose gel, 2log markör (M). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Jämförelse av 3D-multifärgs-DNA-FISK med suboptimala eller optimala DNA-FISKARsonder. (A)Representativa 3D multicolor DNA FISH kärnor med över smält sond kartläggning till 8q24.13 region (magenta) i mänskliga primära myoblaster. Nuclei är motfärgade med DAPI (blå). 63x förstoring. Skalstång = 10 μm. (B) Representativ 3D multicolor DNA FISH kärnor med optimalt smält sond kartläggning till 8q24.13 region (magenta) i mänskliga primära myoblaster. Nuclei är motfärgade med DAPI (blå). 63x förstoring. Skalbar = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Möjliga resultat av suboptimaldeproteinisering och pepsinisering steg på 3D multicolor DNA FISH resultat. (A)Representativa 3D multicolor DNA FISH kärnor av mänskliga primära T-lymfocyter behandlas i 5 min (vänster) eller 12 min (höger) med 0,1 N HCl, med hjälp av sond kartläggning till 8q24.13 region (grön). Nuclei är motfärgade med DAPI (blå). 100x förstoring. Skala bar = 10 μm. (B) Representativ 3D multicolor DNA FISH kärnor av mänskliga primära T-lymfocyter behandlas i 12 min med 0,1 N HCl (vänster) eller tillsammans med 0,01 N HCl/0,0025% pepsin i 2 min (höger), med hjälp av sondkartläggning till 8q24.13 region (grön). Nuclei är motfärgade med DAPI (blå). 100x förstoring. Skalstång = 10 μm. (C) Representativ 3D multicolor DNA FISH kärnor av mänskliga primära myoblaster behandlas med kort och suboptimal pepsinization, med hjälp av sond kartläggning till 8q24.13 region (magenta). Nuclei är motfärgade med DAPI (blå). 63x förstoring. Skalstång = 10 μm. (D) Representativ 3D multicolor DNA FISH kärnor av mänskliga primära myoblaster behandlas med långvarig pepsinization steg, med hjälp av sond kartläggning till 8q24.13 region (magenta). Nuclei är motfärgade med DAPI (blå). 63x förstoring. Skalstång = 5 μm. (E) Representativ 3D multicolor DNA FISH kärnor av mänskliga primära myoblaster behandlas med optimala HCl/ pepsin villkor med hjälp av sond kartläggning till 8q24.13 region (magenta). Nuclei är motfärgade med DAPI (blå). 63x förstoring. Skalbar = 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Nick översättning reagenser | Ursprunglig koncentration | Slutlig koncentration |
| dNTPs (C-G-A) | 0,5 mM | 0,05 mM |
| dTTP (dTTP) | 0,1 mM | 0,01 mM |
| Biotin/Gräv/Cy3 dUTP | 1 mM (mM) | 0,02 mM |
| Tris HCl pH 7,8 | 1 M (1 M) | 50 mM (mm) |
| Mgcl2 (sidan kan vara på 48 8 | 100 mM (på 100 m) | 5 mM (mM) |
| β-mercaptoetanol | 100 mM (på 100 m) | 10 mM (på 10 m) |
| Bsa | 100 ng/μL | 10 ng/μL |
| DNA Pol I | 10 U/μl | 0,1 U/μl |
| Johan I | 1 U/μl | 0,002 E/μL |
| DNA 2 μg | X | X |
| ddH 2 O(sidan kanvara på 1888) | Upp till 50 μl |
Tabell 1: Nick Översättning. Tabell som beskriver alla reagenser, deras koncentration och föreslog timing för nick översättning reaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuvarande metoden beskriver ett steg för steg protokoll för att utföra 3D multicolor DNA FISH på ett brett spektrum av mänskliga primära celler. Även om DNA FISH är en teknik i stor användning, 3D multicolor DNA FISH på konserverad 3D interfas kärnor är fortfarande svårt att utföra i många laboratorier, främst på grund av egenskaperna hos de prover som används23,24.
Sond nick översättning är ett grundläggande steg för framgångsrika 3D multicolor DNA FISH; många olika substrat (BAC, fosmid, plasmid, PCR-produkter) kan användas för denna reaktion, och tidpunkten för reaktions- och enzymkoncentrationen kan justeras i enlighet med substratets längd. En korrekt sondmatsmältning är grundläggande (figur 1), eftersom icke-optimala sonder (figur 2) inte kommer att resultera i någon signal eller en ospecifik signal (figur 3A). Permeabilization, deproteinization och pepsinization steg är avgörande passager som starkt beror på den celltyp som används. Celler med små kärnor och lågt cytoskelett överflöd, såsom ex vivo isolerade T-lymfocyter, kräver deproteinisering med en långvarig 0,1 N HCl behandling. Dessutom tvättar i PBS med högre procentsatser av Triton X-100 kan hjälpa sonden posten i kärnan av dessa celler. Tvärtom, in vitro odlade mänskliga primära myoblaster som presenterar större kärnor, med ett högt innehåll av cytoskelett, behöver matsmältningav cytossolic strukturer med pepsin. Dessa allmänna roller kan tillämpas på ett brett spektrum av celler, så småningom kombinera de olika stegen beroende på de specifika cellulära egenskaperna.
Användning av nyberedd biologiskt material, färska lösningar (särskilt lösningar med tvättmedel) och fluorescerande reagenser föreslås starkt: filtrerad PFA vid pH 7.0; autoklaveras och filtreras 20x SSC vid pH 7.0; filtrerad formamid vid pH 7.0; nuclease fritt vatten; och engångsalikvoter för modifierad utp. Långvarig inkubation med 20% glycerol/PBS, eller 50% formamid/2x SSC kan underlätta hybridiseringen. Behandling med HCl och/eller pepsin kan ökas ytterligare. Tidpunkten för hybridisering, mängden sonder, koncentrationen och tidpunkten för inkubation av anti-digoxigenin och streptavidin kan alla justeras ytterligare för att förbättra signalen till bullerförhållandet.
3D multicolor DNA FISH representerar ett kompletterande verktyg för C-teknik, standardmetoden för att validera C-baserade resultat. Om det kombineras med 3D-mikroskopi och analys kan 3D-multicolor DNA FISH övervaka närheten mellan genomisk loci och deras topologiska fördelning inom kärnområdet på encellig nivå. 3D multicolor DNA FISH kan integreras ytterligare med andra metoder såsom RNA FISH och immunofluorescens för en omfattande översikt över dynamiken och samspelet mellan genomisk loci, RNAs (messenger RNA eller regulatorisk icke-kodning RNA) och ett brett spektrum av proteiner, vilket ger en unik möjlighet att visualisera den nukleära strukturen och undersöka de epigenetiska mekanismer som subtend cellulär identitet.
Trots den enorma förbättringen av FISK-teknik med super upplösning25,26, levande cell avbildning27,28,36, enda molekyl detektion37, och samtida visualisering av flera mål med oligonukleotid matriser såsom Oligopaint37,38 med 3D hög genomströmning närmar sig39, en begränsning av tekniken är fortfarande det diskreta antalet förutbestämda genomiska loci som kan visualiseras. Detta förhindrar en omfattande analys av kärnarkitektur. Flera studier har nyligen beskrivit sekventiella metoder för hybridisering för att ta itu med genomorganisation i enstaka celler såsom streckkod DNA FISH40,41,42,43. Ytterligare ansträngningar kommer att behövas för att koppla encelliga karaktär 3D multicolor DNA FISH att genoma breda funktioner för att i stort sett visualisera kärnarkitektur heterogenitet med bildteknik, eftersom antalet loksom kan testas i taget kommer att öka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner det tekniska biståndet av INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milano, Italien), särskilt C. Cordiglieri, för hjälp under 3D multicolor DNA FISH bilder Förvärv. Detta arbete har stötts av följande bidrag till B.B.: EPIGEN italienska flaggskeppsprogram, Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) och Giovani Ricercatori, italienska hälsoministeriet (GR-2011-02349383). Detta arbete har fått stöd av följande bidrag till M.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
- van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
- Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
- Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
- Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
- Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
- Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
- Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
- Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
- Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
- Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
- Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, Pt 2 64-72 (2015).
- de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
- Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
- Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
- Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
- Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
- Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
- Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , Chapter 4, Unit 4 15 (2013).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
- Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
- Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
- Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
- Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
- Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
- Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
- Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
- Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).
