Summary
Мы описываем иммунофлуоресценцию и количественный метод ПЦР для локализации и количественной оценки бегомовирусов в тканях насекомых. Протокол иммунофлуоресценции может быть использован для колокализации вирусных и векторных белков. Количественный протокол ПЦР может быть распространен на количественную оценку вирусов в целых телах белокрылок и зараженных вирусом растениях.
Abstract
Бегомовирусы (род Begomovirus,семейство Geminiviridae) передаются белокрылками комплекса Bemisia tabaci в стойком, циркулятивном порядке. Учитывая значительный ущерб, наносимый бегомовирусами сельскохозяйственному производству во всем мире, крайне важно понять взаимодействие между бегомовирусами и их вектором белокрылки. Для этого крайне важно ею является локализация и количественная оценка вируса в векторных тканях. Здесь, используя томатный желтый лист локон вируса (TYLCV) в качестве примера, мы описываем подробный протокол для локализации begomoviruses в белокрыль midguts, первичных слюнных желез, и яичников иммунофлуоресценции. Метод основан на использовании специфических антител против белка вирусного пальто, красителя помечены вторичные антитела, и конфокальный микроскоп. Протокол также может быть использован для колокализации белок бегомовир и белокрылки. Мы далее описываем протокол для количественной оценки TYLCV в белокрылых мидгутах, первичных слюнных железах, гемолимфе и яичниках количественным ПЦР (qPCR). Используя праймеры, специально разработанные для TYLCV, протоколы количественной оценки позволяют сравнивать количество TYLCV в различных тканях белокрылки. Описанный протокол потенциально полезен для количественной оценки бегоговирусов в организме белокрылки и зараженного вирусом растения. Эти протоколы могут быть использованы для анализа путей циркуляции begomoviruses в белокрылки или в качестве дополнения к другим методам для изучения белокрыль-бегомовирусных взаимодействий.
Introduction
В последние десятилетия, begomoviruses (род Begomovirus, семья Geminiviridae) нанесли серьезный ущерб производству многих овощей, клетчатки и декоративных культур во всем мире1. Begomoviruses передаются в постоянной манере белокрыли Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), который является сложным видом, содержащим более 35 загадочных видов2,3. Begomoviruses может прямо или косвенно повлиять на белокрыль физиологии и поведения, таких как плодовитость4, долговечность4, и хост предпочтения5,6. Кроме того, эффективность передачи данного вида бегоговируса /деформации варьируется для различных белокрылок загадочных видов даже при тех же экспериментальных условиях7,8,9,10, что свидетельствует о том, что существует сложное взаимодействие между begomoviruses и белокрылки. Чтобы лучше понять механизмы, лежащие в основе белокрыль-бегомовирусных взаимодействий, важное значение имеют локализация и количественная оценка вируса в тканях белокрылки.
Томатный желтый лист локон вирус (TYLCV) является begomovirus, который был впервые зарегистрирован в Израиле, но в настоящее время вызывает серьезный ущерб производству томатов во всем мире11,12. Благодаря своей экономической значимости, это один из наиболее изученных бегомовирусов13. Как и другие монопартитные бегомовирусы, TYLCV является одноцепочным круговым вирусом ДНК с размером генома около 2800 нуклеотидов14. Хотя все еще обсуждается, несколько линий доказательств подтверждают репликации TYLCV в белых мух15,16,17. Кроме того, взаимодействие частиц TYLCV и белокрылых белков было зарегистрировано6,18,19,20. Для передачи вируса, белые мухи приобретают TYLCV путем подачи на зараженных вирусом растений, virions проходят вдоль пищевода, чтобы достичь пищевода, проникнуть в середине гут стены для достижения гемолимфы, а затем трансопределить в первичных слюнных желез (PSGs). Наконец, virions egested со слюной вдоль слюнного протока в флома21растений . Кроме того, несколько исследований показывают, что TYLCV может быть трансovarially передается от женщин белокрылки их потомство22,23. Другими словами, для достижения продуктивной передачи, вирус должен преодолеть клеточные барьеры в белокрылке, чтобы перенести из одной ткани в другую. Во время пересечения этих барьеров, взаимодействия между белокрыльи и вирус белков, вероятно, происходит, вероятно, определение эффективности, с которой вирусы передаются.
Иммунофлуоресценция является широко используемым методом для анализа распределения белка. Специфика связывающихся с их антигеном антител является основой иммунофлуоресценции. В связи с экономической значимостью TYLCV, моноклональные антитела против белка покрытия TYLCV были разработаны, предлагая очень чувствительный способ локализации вируса24. Количественный ПЦР (qPCR) позволяет чувствительной и специфической количественной оценки нуклеиовых кислот. Этот метод чаще всего основан на использовании гидролизного зонда (например, TaqMan) или флуоресцентного красителя (например, SYBR Green) обнаружения. Для гидролизового зонда на основе qPCR, конкретные зонды необходимы, что, следовательно, увеличение стоимости. Флуоресцентный краситель на основе qPCR проще и более экономически эффективным, потому что помеченные ампликон-специфические гибридизации зонды не требуется25. До сих пор, несколько исследований использовали иммунофлуоресценции и qPCR наряду с другими методами для исследования сложных взаимодействия begomovirus-whitefly. Например, Pan et al. провели qPCR и иммунофлуоресценцию анализа вируса в белокрыльных тканях и обнаружили, что разница в способности передавать вирус вьющихся табачных изделий (TbCSV) между видами белокрылок AsiaII 1 и Middle East Asia Minor 1 (MEAM1) была обусловлена тем, что вирус способен эффективно пересекать стену мидгута АзииII1, но не MEAM18. Аналогичным образом, в то время как средиземноморские (MED) белые мухи могут легко передавать TYLCV, они не передают томатный желтый лист завивка Китай вирус (TYLCCNV). Селективная передача была исследована с помощью иммунофлуоресценции обнаружения вируса в PSGs, который показал, что TYLCCNV не легко пересечь PSGs МЕД белокрылки26. Иммунофлуоресценция солокализации TYLCV CP и аутофагии маркер белка ATG8-II в белокрыль midguts показывает, что аутофагия играет важную роль в подавлении инфекции TYLCV в белокрыль27.
Здесь, используя TYLCV в качестве примера, мы описываем протокол для локализации begomoviruses в белокрыль midguts, PSGs, и яичников с помощью иммунофлуоресценции техники. Техника включает в себя вскрытие, фиксация и инкубация с первичными и красителя этикетки вторичных антител. Сигналы флуоресценции, показывающие расположение вирусных белков в тканях белокрылки, могут быть обнаружены под конфокальный микроскоп. Что еще более важно, этот протокол может быть использован для колокализации begomoviral и белокрылки белков. Мы далее описываем протокол для количественной оценки TYLCV с использованием SYBR Зеленый основе qPCR в белокрыль midguts, PSGs, гемолимфы, и яичники, которые могут быть использованы для сравнения количества вируса в различных образцов белокрылки ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Whitefly, Вирус, Растения, и приобретение вируса
- Задние белокрылки (MEAM1) на хлопке (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) в насекомых-доказательных клетках в теплице при 26 и 1 кв с 14:10 светлым:темным циклом и 60 и 10% относительной влажностью.
- Выполните обычные ПЦР на основе белокрыльми митохондриальной цитохромной оксидазы i гена для определения чистоты популяции белокрылки.
- Соберите 20 взрослых белых мух и перенесите их индивидуально в трубку ПЦР, содержащую 30 л люсис-буфера (10 мм Трис, рН, 8,4, 50 мМ KCl, 0,45% «wt/vol» Tween-20, 0.2% «wt/vol» желатин, 0,45%
- Добавьте 5–7 керамических бусин (2 мм в диаметре) в каждую трубку ПЦР и измельчите образцы для выполнения лиза ткани.
- Инкубировать все образцы при 65 градусах по Цельсию в течение 1 ч, а затем 10 мин при 100 градусах По цельсии, а затем центрифуги кратко. Используйте этот супернатант в качестве шаблона для усиления ПЦР.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости время инкубации может быть увеличено на уровне 65 градусов по Цельсию. - Подготовьте реакцию ПЦР следующим образом: 1 U из полимеразы ДНК Така, 2 л 10-х буфера (с Mg2),1,6 л смеси dNTP (2,5 мМ), 0,5 л каждой грунтовки (10 км каждый), 2 л лизатального супернатанта ткани белокрылки и двойная дистиллированная вода в общей сложности 20 л реакции. Последовательность переднего грунта 5'-TTGATTTTGGTCATCATAGAAGT-3', а обратная последовательность грунтовки 5'-TAATATCAGATTGCGATTGGGA-3'.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательный контроль, где ДНК заменяется нуклеазой воды и положительный контроль с ранее проверенных MEAM1 белокрылка ДНК должны быть включены. - Выполните ПЦР с использованием следующих параметров цикла: начальная денатурация при 95 градусах в течение 3 мин, затем 35 циклов денатурации при 95 градусах по Цельсию на 30 с, аннулирование при 50-55 градусов по Цельсию в течение 30 с и расширение на 72 градуса х в течение 1 мин, а затем 72 градуса по Цельсию в течение 10 мин.
- Дайджест усиленного продукта с ограничением фермента Taq I. Для этого приготовьте пищеваренную смесь с 0,1 л (1 У) фермента,1 л 10x Taq I Buffer, 1 Зл БСА, 5 л усиленного продукта и двойную дистиллированную воду общим объемом 10 зл. Инкубировать при 65 градусах по Цельсию на 1 ч в термоцикле.
- Выполните электрофорус агарозного геля образцов, загрузив 5-7 л каждого переваренных продуктов и ДНК-лестницу (100-2000 вр) в скважины 1% агарозного геля. Затем наблюдайте за размерами группы ДНК, гель-красные окрашивания в гель документации машины с использованием УФ-излучения. Сравните размеры полосы переваренных продуктов с положительным контролем, чтобы определить чистоту популяции белокрылок.
- Агро-прививать инфекционный клон TYLCV (GenBank присоединения номер AM282874.1) (pBINPLUS-SH2-1.4A) в 3-4 истинных листьев стадии томатных растений(Solanum lycopersicum Л. cv. Hezuo 903).
- Прививать 10 мл среды Лурия-Бертани (LB), содержащей канамицин (50 мкг/мл) и рифампицин (50 мкг/мл) с одной колонией. Инкубировать при 28 градусах Цельсия при встряхивании при 200 об/мин до тех пор, пока OD600 не достигнет 1,5 евро.
- Урожай агробактерий при центрифугации при 4000 х г в течение 10 мин. Отбросьте супернатант.
- Resuspend гранулы в 10 мл инфильтрации буфера, состоящий из 200 мкм ацетосирингон, 10 мМ 2-(N-морфино) этановая сульфоновая кислота (MES), и 10 мм ММ MgCl2. Инкубировать при комнатной температуре (RT) по 1-2 ч.
- Проникают 2-3 растительных листьев, используя смесь со ступени 1.3.3 с 1 мл шприца без иглы. Поддерживайте растения в теплице при 26 и 1 градусе По Цельсию.
- Около 1 месяца спустя, выполнить визуальный осмотр и выбрать растения, показывающие желтый лист локон и симптомы трюка.
- Передача невируевых белокрылок взрослых на TYLCV-инфицированных томатных растений для 48 ч для приобретения вируса.
2. Рассечение и коллекция Мидгутов, Первичных Слюнных Гландов (PSG), Яичников и гемолиммы женщин-белых мух
- Соберите белых мух с помощью устремления, а затем поместите их на лед, чтобы положить их в коме. Добавьте 1x pbS (фосфат-буферный солен) буфер на слайд микроскопа, а затем поместите белых мух в буфер 1x PBS для вскрытия под стерео микроскопом.
- Для вскрытия мидгута, сломать живот белокрылки и вытащить midgut с помощью тонкой иглоукалывания иглы (0,25 мм в диаметре). Передача midgut для очистки, 1x PBS.
- Для вскрытия PSG, сломать тело белокрылки в грудной клетке возле головы со стороны доза. Затем вставьте иглу в грудную клетку, чтобы исправить белокрылку, и использовать другую иглу, чтобы встряхнуть белокрылку, пока две слюнные железы отделены от тела. Затем, передача PSGs для очистки, 1x PBS.
- Для вскрытия яичников, полностью сломать живот белокрылки, и использовать иглу, чтобы отделить яичники от других тканей. Затем удалите лишние ткани путем пипетки.
- Для сбора гемолимфы добавьте 10 кл.л. 1x PBS буфера на слайд микроскопа, а затем поместите белокрылку в буфер. Чтобы получить гемолимф, осторожно разорвать отверстие в животе с помощью тонкой иглоукалывание иглы, и слегка нажмите живот, чтобы освободить гемолимфы в буфер. Соберите 8 зл жидкости в качестве гемолимфы образца.
3. Локализация TYLCV в Whitefly Мидгут, Первичный Слюнные земли, и яичники по иммунофлуоресценции
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера приводится процедура локализации TYLCV в мидгутах. Метод может быть использован для PSGs и яичников.
- Вскрыть мидгуты в буфере TBS (10 мм Tris-HCl, 150 мМ хлористого натрия, рН 7,5), как описано в шаге 2.2.1. Соберите 15–20 мигутов белокрылки, перенесите их в стеклянную чашку Петри (3,5 см в диаметре), а затем удалите лишний буфер TBS.
- Добавить 1 мл 4% параформальдегида, чтобы исправить мидгутов в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем удалить фиксаторский раствор. Пипетка медленно мыть midguts 3x в TBS в течение 2 минут каждый.
- Инкубировать мидгуты в 1 мл 0,5% Triton X-100 за 30 минут для пермяки. Затем удалите раствор пермяки и смойте мидгуты 3x с помощью TBST (1x TBS с 0,05% Tween 20), как описано в шаге 3.2.
- Добавить 1 мл 1% BSA (бувинный сывороточный альбумин, приготовленный в TBST), чтобы заблокировать мидгуты. Выполните блокирующий шаг на RT в течение 2 ч, а затем удалить блокирующий раствор и мыть midguts 3x в TBST.
- Разбавить первичные антитела (MAb 1C4 против белка tYLCV пальто) в 1:400 с TBST24 и добавить раствор в чашку Петри, чтобы погрузить midguts. Инкубировать при 4 градусах Цельсия на ночь в темноте. Откажитесь от первичного раствора антитела и вымойте 3x в TBST.
- Разбавить вторичные антитела (анти-мышь) в 1:400 с TBST и добавить раствор в чашку Петри, чтобы погрузить мидгутов. Инкубировать блюдо в течение 2 ч на RT в темноте. Откажитесь от вторичного раствора антитела и мыть мидгуты 3x в TBST.
- Перенесите мидгуты на четкий слайд микроскопа. Аспирируйте как можно больше TBST от слайда, как это возможно. Добавьте 1 каплю DAPI (4', 6-диамидино-2-фенилиндинол, дигидрохлорид) для окрашивания ядра, а затем поместите крышку и печать с лаком для ногтей. Изучите под конфокальный микроскоп.
4. Количественная оценка TYLCV в Уайтфлай Мидгут, Первичный Слюнный Гландс, Гемолимф и Яичники с qPCR
- Вскрыть белокрыль midguts, PSGs, гемолимфы, и яичников в 1x PBS, как описано выше.
- Извлеките ДНАД midguts, PSGs, гемолимфы, и завязей.
- После вскрытия, мыть мидгуты, PSGs, и яичники в чистом, 1x PBS буфер 2-3x.
- Соберите 20 мидгутов или 20 ПГВ в 5 Л 1x PBS и перенесите их в 25 л лиза раствора. Перенесите каждый яичников в 5 Л 1x PBS, а затем перенесите в 25 Л люизис решение по отдельности.
- Измельчить мидгуты, PSGs, и яичников образцы, описанные в шаге 1.2.2.
- Соберите 8 зл гемолимф с 1x PBS в трубку ПЦР, а затем добавьте 10 зл иссыпания раствора. Тщательно перемешайте.
- Извлеките ДНК из всех образцов, описанных в 1.2.3.
- Подготовьте две отдельные мастер-миксы qPCR (по 18 л каждый) для TYLCV и внутренний контроль (гена-актина) следующим образом: 10 зл и l sYBR Green mix, 0,8 л каждой грунтовки (10 км/ и 6,4 л двойной дистиллированной воды на реакцию. Для TYLCV, передняя последовательность грунтовки 5 "-GAAGCGAGGCGATAtAA-3" и обратная последовательность грунтовки 5 "-GGAACATCAGGGCTCGATA-3". Для q-actin, передняя последовательность грунтовки 5 '-TCTTCCAGCCCTCtTTTG-3" и обратная последовательность грунтовки 5 '-CGGTGATTCCTCTCTCTCTATT-3 ..
- Распределить 18 зл и мгновения мастер смесь во флаконы qPCR полосы труб или 96 хорошо пластины. Затем добавьте в каждый флакон 2 злиц образца ДНК. Выполните все реакции, по крайней мере три технических репликации и три биологических репликации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 4.5 должен быть выполнен на льду. - Закройте трубки qPCR или запечатайте 96 колодцев с клеевым уплотнением пластины.
- Центрифуга для сбора жидкости в нижней части трубки qPCR или 96 хорошо пластины.
- Поместите трубки или пластины в тепловой цикл в режиме реального времени и выполните qPCR.
- Выполните qPCR с использованием следующих параметров цикла: 95 градусов по Цельсию на 30 с, а затем 40 циклов 95 c для 5 s и 60 C для 34 s для грунтовки annealing и удлинения, 1 цикл при 95 C для 15 s, заканчивая шагом плавильной кривой от 60 до 95 c с приращение 0,5 градуса Цельсия на 15 с.
- Выберите SYBR в качестве флюорофора красителя и неизвестных как тип образца.
- Экспортировать количественные данные в формат электронной таблицы и анализировать относительное количество вирусной ДНК методом 2«CT 28».
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В качестве примера были использованы белокрылки MEAM1 комплекса B. tabaci и TYLCV. Обзор процедур иммунофлуоресценции и вирусной количественной оценки, описанный в данной рукописи, показан на рисунке 1. На рисунке 2 показаны репрезентативные результаты обнаружения иммунофлуоресценции TYLCV и DAPI окрашивания в PSGs, midguts, и яичники, что свидетельствует о том, что TYLCV накопил больше в PSGs и midguts, и меньше в яичниках. На рисунке 3 показано относительное количество вируса в белокрыльных PSGs, midguts, гемолимф, и яичники после whiteflies кормили на TYLCV-инфицированных помидоров для 24, 48 и 72 ч, что свидетельствует о том, что количество вируса увеличилось в различных тканей белокрылки с увеличением периода доступа приобретения.
Рисунок 1: Обзор протоколов, представленных в настоящем документе. (A) Экспериментальные процедуры для иммунофлуоресценции в белокрыль midguts, PSGs, и яичники. Ткани были собраны из TYLCV-инфицированных взрослых женщин белокрылки, а затем ряд фиксации, permeabilization, блокирование, инкубации с первичными антителами, которые связываются с tYLCV пальто белка, и фторхром-конъюгированных вторичных антител, которые связываются с первичными антителами. Наконец, образцы были проанализированы под конфопальный микроскоп, что позволяет приобретение изображений. (B) Экспериментальная процедура для количественной оценки вируса в белокрыль midguts, PSGs, яичники, и гемолимфа. Ткани были собраны из TYLCV-инфицированных взрослых женщин-белокрылок, а затем экстракция ДНК была проведена. qPCR был выполнен на инструменте ПЦР в режиме реального времени, что позволило приобрести данные, которые впоследствии могут быть проанализированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Иммунофлуоресценция обнаружения TYLCV в первичных слюнных желез, midguts, и яичников женщин взрослых белых мух после 48 h вирус приобретения периода доступа. Белому мухе было разрешено питаться TYLCV-инфицированных томатных растений в течение 48 ч, а затем 20 PSGs, 20 midguts, и 20 яичников были вскрыты и собраны. Далее, образцы были зафиксированы в 4% формальдегида, пронизанный в 0,5% Triton X-100, заблокирован в 1% BSA, а затем инкубируется мышью анти-TYLCV моноклональных антител (MAb 1C4 против белка пальто TYLCV)24 и коза анти-мышь вторичных антител, спряженных с красным флуорезором dye (i.e.9). Ядра были окрашены DAPI (синий). Сигналы иммунофлуоресценции были исследованы под конфопическим микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Количественная оценка ДНК TYLCV в мидгутах, гемолимфе, первичных слюнных железах и яичниках у белокрылок MEAM1. Взрослый кормили TYLCV-инфицированных томатных растений для 24, 48 и 72 ч, а затем белокрыль midguts, гемолимфа, PSGs, и яичники были расчленены и собраны. Далее, экстракция ДНК и qPCR были выполнены для midguts (A), гемолимф (B), PSGs (C), и яичников(D). Данные были во-первых нормализованы к белой муляж й-актина ДНА, и после этого относительное количество полученного вируса снова было нормализовано к тому на 24 h. NV: Non-viruliferous. Данные представлены в качестве среднего И SEM относительного количества вируса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем протокол для локализации и количественной оценки бегомовируса в тканях его белокрыльного вектора иммунофлюоресценцией и qPCR. Рассечение представляет собой первый шаг к локализации и количественной оценки вируса в тканях белокрылки. Тело белокрылки около 1 мм в длину, что означает, что ткани очень малы, и трудно вскрыть их. Кроме того, между тканями существуют прочные связи. Например, яичники тесно связаны с бактериоцитами, что затрудняет их изоляцию. Здесь, учитывая характеристики и расположение различных тканей, мы описываем различные подходы к вскрытию. Тем не менее, много практики необходимо быстро и точно вскрыть эти ткани. Кроме того, лучше всего использовать свежих белокрылок, так как мертвые насекомые увеличивают сложность вскрытия. Кроме того, постдиссекция, ткани должны быть очищены, чтобы избежать загрязнения.
Метод иммунофлуоресценции основан на использовании специфических антител. Подходящая рабочая концентрация для каждого антитела очень важна в визуализации, потому что высокая концентрация антител снижает соотношение сигнала к фону и низкая концентрация не может обеспечить достаточный сигнал. Здесь мы использовали разбавление 1:400 как для первичных антител, так и для вторых антител. Эти антитела должны быть разделены на мелкие аликвоты и храниться при температуре -20 градусов по Цельсию, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания. Разбавления антител должны быть подготовлены прямо перед использованием. Когда описанный здесь протокол используется для колокализации вирусных и белокрылых белков, важно, чтобы первичные антитела против вирусных и белокрылых белков вырабатывались у животных различных видов. Кроме того, фторофоры вторичных антител должны быть выбраны тщательно, чтобы предотвратить кровотечение через между каналами. Кроме того, с учетом небольшого размера тканей белокрылки, они всегда должны быть вымыты под микроскопом, чтобы избежать потери. Хотя иммунофлуоресценция является высокочувствительной, она является относительно более трудоемкой и дорогостоящей по сравнению с другими методами определения местонахождения вируса, такими как флуоресценция на месте гибридизации (FISH). Кроме того, антитела против бегоговирусов могут быть недоступны для покупки.
Ключк к успешному применению qPCR для количественной оценки вируса в тканях белокрылки заключается в разработке подходящих грунтовок и выборе эндогенных эталонных генов. Родригес и др. описал критерии для разработки qPCR праймеры в деталях25, который также применяется в разработке вирусгрунтов. В этом исследовании, З-актин был выбран в качестве эталонного гена для количественной оценки вируса в тканях белокрылки. Однако в некоторых случаях (например, гены РНК) другие эндогенные гены следует использовать в качестве эталонных генов, если они подходят для экспериментального проекта29. Кроме того, для получения стабильных и точных результатов следует использовать белокрылки одной и той же стадии развития, так как белокрылки различных стадий развития обладают дифференциальными возможностями для приобретения и передачи вирусов22. Кроме того, в то время как мы использовали 20 PSGs или midguts в качестве одного образца, мы использовали гемолимфу, собранные из одной белокрылки в качестве одного образца для анализа qPCR. Это связано с тем, что сбор гемолимфы занимает много времени, а ДНК образцов гемолимфы уязвима для деградации, если не обработана своевременно. Этот протокол также может быть использован для количественной оценки количества вируса в белокрыль все тело и вирус-инфицированных растений.
Таким образом, мы описываем эффективный и чувствительный протокол для локализации и количественной оценки бегоговирусов в тканях белокрылки с помощью иммунофлуоресценции и qPCR, соответственно. Этот протокол также может быть адаптирован для локализации и количественной оценки других бегоговирусов. Кроме того, протокол иммунофлуоресценции может быть использован для колокализации вирусных и белокрылых белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальной ключевой программой исследований и разработок (Грант номер: 2017YFD0200600), целевой фонд для Китая сельскохозяйственной исследовательской системы (грант номер: CARS-23-D07) и Билл и Мелинда Гейтс Фонд (Инвестиционный ID OPP11497777 ). Мы благодарим профессора Цзянь-Сян Ву за предоставление антител TYLCV CP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
References
- Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
- Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
- Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
- Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
- Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
- Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
- Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
- Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
- Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
- Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
- Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
- Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
- Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
- Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
- Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
- Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
- Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
- Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
- Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
- Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
- Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
- Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).
