Summary
我们描述了一种免疫荧光和定量PCR方法，用于昆虫组织中果子病毒的定位和定量。免疫荧光方案可用于共定病毒和载体蛋白。定量PCR协议可以扩展，以量化整个白蝇体内和受病毒感染的植物中的病毒。
Abstract
贝戈莫病毒（贝戈莫病毒属，家族双子病毒）由贝米西亚塔巴奇复合物的白蝇以持续、循环的方式传播。考虑到果虫病毒对全世界作物生产造成的广泛损害，必须了解果蝇病毒与其白蝇载体之间的相互作用。为此，在病媒组织中定位和定量病毒至关重要。在这里，以番茄黄叶卷曲病毒（TYLCV）为例，我们描述了一个详细的方案，通过免疫荧光在白蝇中肠道、原发唾液腺和卵巢中本地化果子病毒。该方法基于对病毒涂层蛋白、染料标记的二级抗体和共聚焦显微镜使用特定抗体。该协议还可用于共同本地化果病毒和白蝇蛋白。我们进一步描述了通过定量PCR（qPCR）对白蝇中肠、原发性唾液腺、淋巴和卵巢中的TYLCV进行定量的一个方案。使用专为TYLCV设计的引基，定量协议允许比较白蝇不同组织中的TYLCV量。所述协议对于白蝇和受病毒感染植物体内的果子病毒的定量可能有用。这些协议可用于分析白蝇中贝戈病毒的循环途径，或作为研究白蝇-白蝇-白蝇病毒相互作用的其他方法的补充。
Introduction
在过去的几十年里，贝戈莫病毒（贝戈莫病毒属，家族双子病毒）已经给全世界许多蔬菜、纤维和观赏作物的生产造成了严重损害。贝戈莫病毒由白蝇贝米西亚·塔巴奇（赫米特拉：阿莱罗迪达）持续传播，这是一种复杂的物种，包含超过35个神秘的物种2，3。白蝇病毒可能直接或间接地影响白蝇的生理和行为，如粪便4、长寿4和宿主偏好5、6。此外，即使在相同的实验条件下，在相同的实验条件下，特定白蝇病毒物种/菌株的传播效率也因不同的白蝇神秘物种而异，这表明白蝇与白蝇之间存在复杂的相互作用。为了更好地了解白蝇-白蝇病毒相互作用背后的机制，在白蝇组织中对病毒进行定位和定量至关重要。
番茄黄叶卷曲病毒（TYLCV）是一种在以色列首次报告的果子病毒，但如今对全世界番茄生产造成了严重破坏。由于其经济重要性，它是研究最好的贝戈病毒13之一。像其他单部分体细胞病毒一样，TYLCV是一种单链圆形DNA病毒，其基因组大小约为2，800个核苷酸14。虽然仍在争论中，几行证据支持在白蝇15，16，17复制TYLCV。此外，TYLCV粒子和白蝇蛋白的相互作用已经报告6，18，19，20。对于病毒传播，白蝇通过喂食受病毒感染的植物获得TYLCV，病毒通过食物管到达食道，穿透中肠道壁到达溶血区，然后转移到主要的唾液腺（PSG）。最后，病毒通过唾液管沿着唾液管道进入植物噬菌体21。此外，几项研究表明，TYLCV能够从雌性白蝇的转传传给它们的后代22，23。换句话说，为了实现生产性传播，病毒必须克服白蝇体内的细胞屏障，才能从一个组织转移到另一个组织。在跨越这些障碍期间，白蝇和病毒蛋白之间很可能发生相互作用，这可能决定病毒的传播效率。
免疫荧光是蛋白质分布分析常用技术。抗体与其抗原结合的特异性是免疫荧光的基础。由于TYLCV的经济意义，针对TYLCV涂层蛋白的单克隆抗体已经开发出来，为病毒24的局部化提供了一种高度敏感的方法。定量PCR（qPCR）允许对核酸进行敏感和具体的定量。该技术最常基于水解探针（例如，TaqMan）或荧光染料（如SYBR绿色）检测。对于基于水解探针的qPCR，需要特定的探头，从而增加了成本。荧光染料qPCR更简单，更具成本效益，因为标记的放大里昂特异性杂交探头不需要25。到目前为止，一些研究已经使用免疫荧光和qPCR以及其他方法来研究复杂的果子病毒-白蝇相互作用。例如，Pan等人对白蝇组织中的病毒进行了qPCR和免疫荧光分析，发现白蝇物种亚洲II 1和东亚小1（MEAM1）之间传播烟草卷曲病毒的能力差异是由于该病毒能够有效地穿过亚洲的中肠道壁，而不是MEAM18。同样，虽然地中海（MED）白蝇可以轻易传播TYLCV，但它们不能传播番茄黄叶卷曲中国病毒（TYLCCNV）。使用PSG中病毒的免疫荧光检测对选择性传播进行了研究，结果表明TYLCCNV不容易穿过MED白蝇26的PSG。TYLCV CP和白蝇中古的自噬标记蛋白ATG8-II的免疫荧光共定位表明，自噬在抑制白蝇27的TYLCV感染中起着关键作用。
在这里，我们以TYLCV为例，描述了一种通过免疫荧光技术在白蝇中肠道、PSG和卵巢中定位的果子病毒的协议。该技术包括用原抗体和染料标记的二级抗体进行解剖、固定和孵育。荧光信号显示病毒蛋白在白蝇组织中的位置，然后可以在共聚焦显微镜下检测到。更重要的是，该协议可用于共同地化果病毒和白蝇蛋白。我们进一步描述了在白蝇中古、PSG、淋巴和卵巢中使用SYBR绿色qPCR对TYLCV进行定量的协议，该协议可用于比较不同白蝇组织样本中的病毒量。
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Protocol
1. 白蝇、病毒、植物和病毒的获取
- 棉花上的后白蝇 （MEAM1）在温室的防虫笼中，温度为 26 ° 1 °C，相对湿度为 14：10：黑暗循环，60 ± 10% 相对湿度。
- 基于白蝇线粒体细胞色素氧化酶I基因执行常规PCR，以确定白蝇种群的纯度。
- 收集20只成年白蝇，并把它们单独转移到含有30μL的发合缓冲液（10 mM Tris，pH = 8.4，50 mM KCl，0.45%[wt/vol] 补间-20，0.2% [wt/vol] 明胶，0.45% [vol/vol] 诺尼德 P 40，60 g/mLl。
- 在每个 PCR 管中加入 5⁄7 个陶瓷珠子（直径 2 mm），并研磨样品以进行组织莱沙。
- 在65°C孵育所有样品1小时，然后在100°C下孵育10分钟，然后短暂离心。使用此上清液作为 PCR 扩增的模板。
注：如有必要，可在65°C处增加孵育时间。 - 按如下方式制备PCR反应：1 U的Taq DNA聚合酶，2μL的10x缓冲液（含Mg2+），1.6μL的dNTP混合物（2.5 mM），每引物0.5μL（每个引物10μM），2μL的白蝇组织上液，以及双蒸馏水，总体积为20μL每次反应。正向引基序列为 5' - TTATTTATATATCAAAGT-3' 和反向引基序列为 5' - TAATATGGATATATATATATATATATG-3'。
注：应包括DNA被无核酸酶水替代的阴性对照，以及先前验证的MEAM1白蝇DNA的阳性对照。 - 使用以下循环参数执行 PCR：在 95°C 下初始变性 3 分钟，随后在 95°C 下进行 35 次变性 30 秒，在 50-55°C 下退火 30 秒，在 72°C 下延长 1 分钟，然后 72°C 10 分钟。
- 用限制性酶Taq I消化扩增产物。为此，用0.1 μL（1 U）酶、1μL 10x Taq I缓冲液、1 μL BSA、5 μL扩增产物和双倍蒸馏水制备消化混合物，总体积为10μL。在 65°C 的热循环器中孵育 1 小时。
- 将每个消化产物的5~7μL和DNA阶梯（100-2，000 bp）装入1%的甘蔗凝胶的井中，对样品进行抗胶凝胶电泳。然后，使用紫外光在凝胶记录机中通过凝胶红色染色来观察DNA带的大小。将消化产物的带大小与正对照进行比较，以确定白蝇种群的纯度。
- 将TYLCV的传染性克隆（GenBank加入编号AM282874.1）（pBINPLUS-SH2-1.4A）接种成3⁄4个真正的叶级番茄植物（索兰姆番茄石L.cv.Hezuo 903）。
- 接种10 mL的卢里亚-贝尔塔尼（LB）介质，含有卡那霉素（50微克/升）和利夫霉素（50微克/mL），具有单一菌落。在 28°C 下孵育，在 200 rpm 下摇动，直到 OD600达到 ±1.5。
- 以4000 x g离心10分钟收获农业细菌。丢弃上清液。
- 在10 mL的渗透缓冲液中重新悬浮颗粒，包括200 μM醋酮、10 mM 2-（N-变形）乙酸硫酸（MES）和10 mM MgCl2。在室温 （RT） 下孵育 1⁄2 小时。
- 使用步骤 1.3.3 中的混合物与 1 mL 无针注射器混合 2⁄3 植物叶。将温室中的植物保持在26~1°C。
- 大约1个月后，进行目视检查，选择出现黄色卷曲叶和特技症状的植物。
- 将非病毒性白蝇成人转移到TYLCV感染的番茄植物上48小时，用于病毒采集。
2. 中古人、主要唾液腺（PSG）、卵巢和雌性白蝇的淋巴的解剖和收集
- 收集白蝇使用渴望，然后把它们放在冰上，使他们处于昏迷状态。将 1x PBS（磷酸盐缓冲盐水）缓冲液添加到显微镜幻灯片上，然后将白蝇放入 1x PBS 缓冲液中，在立体显微镜下进行解剖。
- 对于中肠道解剖，打破白蝇的腹部，并使用精细的针灸针（直径0.25毫米）拉出中腹。转移到清洁，1x PBS。
- 对于PSG解剖，从背侧打破靠近头部的胸腔中的白蝇的身体。接下来，将针插入胸腔以修复白蝇，并用另一根针摇动白蝇，直到两个唾液腺从身体中分离出来。然后，将 PSG 转移到清洁的 1x PBS。
- 对于卵巢解剖，完全打破白蝇的腹部，并使用针将卵巢与其他组织分离。然后，通过移液去除多余的组织。
- 对于淋巴收集，将 10 μL 的 1x PBS 缓冲液添加到显微镜幻灯片上，然后将白蝇放入缓冲液中。为了获得淋巴，使用精细的针灸针轻轻撕开腹部的孔，并稍微按压腹部，将淋巴释放到缓冲液中。收集8μL的液体作为淋巴样品。
3. 通过免疫荧光在白蝇米德古特、主要唾液腺和卵巢中定位TYLCV
注： TYLCV 在中段的本地化过程作为示例提供。该方法可用于PSG和卵巢。
- 如步骤 2.2.1 所述，在 TBS 缓冲液中分离中古物（10 mM Tris-HCl，150 mM 氯化钠，pH = 7.5）。收集15-20只白蝇中古，将它们转移到玻璃培养皿（直径3.5厘米），然后去除多余的TBS缓冲液。
- 加入1 mL的4%的甲醛，在室温下将中古液固定2小时，然后去除固定溶液。移液器缓慢地在 TBS 中清洗中游3倍，每次2分钟。
- 在 1 mL 的 0.5% Triton X-100 中孵育中古人 30 分钟以渗透。然后，如步骤 3.2 所述，取出渗透溶液，用 TBST 清洗中古3倍（1x TBS，带0.05%补间20）。
- 加入1mL的1%BSA（在TBST中制备的牛血清白蛋白），以阻止中古人。在 RT 处执行 2 小时的阻滞步骤，然后取出阻塞溶液，并在 TBST 中清洗中肠 3 倍。
- 用TBST24在1：400稀释原抗体（MAb 1C4对TYLCV涂层蛋白），并将溶液加入培养皿中，以浸没中腹。在黑暗中在4°C孵育过夜。丢弃原抗体溶液，在TBST中洗涤3倍。
- 用TBST在1：400稀释二级抗体（抗小鼠），并将溶液加入培养皿中，浸入中古肠。在黑暗中在RT孵育2小时。丢弃二级抗体溶液，在TBST中清洗中古3倍。
- 将中端转移到清晰的显微镜幻灯片上。尽可能多地从幻灯片上吸出 TBST。加入1滴DAPI（4'，6-二酰胺-2-苯胺，二盐）染色核，然后放置盖玻片和密封与指甲油。在共聚焦显微镜下检查。
4. 在白蝇米德古特，主要唾液腺，淋巴和卵巢与qPCR的TYLCV的定量
- 如上文所述，在 1x PBS 中解剖白蝇中古、PSG、淋巴和卵巢。
- 提取中肠道、PSG、淋巴和卵巢的DNA。
- 解剖后，用干净的1xPBS缓冲液2-3x清洗中肠道、PSG和卵巢。
- 在 5 μL 的 1x PBS 中收集 20 个中古或 20 个 PSG，并将其转移到 25 μL 解液中。将每个卵巢在 5 μL 的 1x PBS 中转移，然后单独转移到 25 μL 解液中。
- 如步骤 1.2.2 中所述，研磨中古、PSG 和卵巢样本。
- 收集8 μL的溶量与1xPBS到PCR管，然后加入10μL的溶化溶液。彻底混合。
- 如 1.2.3 所述，从所有样品中提取 DNA。
- 为TYLCV和内部控制（β-actin基因）准备两个单独的qPCR主混合物（每个18μL），如下所示：10 μL的SYBR绿色混合物，每引物0.8μL（每个10μM），以及每次反应6.4μL的双蒸馏水。对于TYLCV，正向引基序列为5°-GAAGACCAGAGGGATATATATA-3+，反向引基序列为5°-GGACATCAGGCGATAtA-3°。对于β-actin，正向引物序列为5°-TCTCCAGCCATCTTTTTTTG-3+，反向引物序列为5°-CGGTATTCTCTTATT-3°。
- 将主混合物的 18 μL 分配到 qPCR 带管或 96 孔板小瓶中。然后，将2μL的DNA样本加入每个小瓶中。使用至少三个技术复制和三个生物复制执行所有反应。
注：应在冰上执行步骤 4.5。 - 用粘合板密封关闭 qPCR 管或密封 96 孔板。
- 离心机收集qPCR管底或96孔板的液体。
- 将管或板放入实时热循环器中，执行 qPCR。
- 使用以下循环参数执行 qPCR：95 °C 表示 30 s，随后为 40 个循环，即 95°C 的 5 s 和 60°C 的引漆退火和伸长，1 个循环在 95°C 下为 15 s，结束熔化曲线步长为 60°C 至 95°C，带每 15 s 增加 0.5 °C。
- 选择SYBR作为荧光染料，未知作为样品类型。
- 将定量数据导出到电子表格格式，并通过 2+CT方法28分析病毒 DNA 的相对数量。
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Representative Results
此处使用B. tabaci复合体和 TYLCV 的 MEAM1 白蝇作为示例来描述这些过程。本手稿中描述的免疫荧光和病毒定量程序概述如图1所示。图2显示了PSG、中肠和卵巢中TYLCV和DAPI染色免疫荧光检测的代表性结果，表明TYLCV在PSG和中肠道中积累较多，卵巢中积累较少。图3显示了白蝇PSG、中古、淋巴和卵巢中24、48和72小时在TYLCV感染番茄上喂食后病毒的相对数量，表明随着采集期的增加，不同白蝇组织中病毒的数量增加。
图 1：本文中介绍的协议概述。（A） 白蝇中肠、PSG 和卵巢免疫荧光的实验程序.从感染TYLCV的成年雌性白蝇身上采集组织，然后进行一系列固定、渗透、阻断、与TYLCV涂层蛋白结合的原抗体的孵育，以及与原抗体结合的氟铬结合二级抗体。最后，在共聚焦显微镜下对样品进行分析，从而获得图像。（B） 白蝇中肠、PSG、卵巢和淋巴病毒定量的实验程序。从感染TYLCV的成年雌性白蝇中采集组织，然后进行DNA提取。qPCR在实时PCR仪器上执行，允许采集随后可以分析的数据。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：48小时病毒采集期后，女性成年白蝇的初发唾液腺、中肠和卵巢的TYLCV免疫荧光检测。白蝇被允许在TYLCV感染的番茄植物上喂食48小时，然后解剖和采集20个PSG、20个中古人和20个卵巢。接下来，样品固定在4%甲醛中，渗透在0.5%Triton X-100中，阻断在1%BSA中，然后用小鼠抗TYLCV单克隆抗体（MAb 1C4对TYLCV涂层蛋白）孵育24，山羊抗小鼠二次抗体与红色荧光染料（即Dylight 549）结合。核被DAPI（蓝色）弄脏了。免疫荧光信号在共聚焦显微镜下被检查。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：MEAM1白蝇中度、淋巴、原发性唾液腺和卵巢中的TYLCVDNA定量。成人喂食受TYLCV感染的番茄植物24、48和72小时，然后对白蝇中肠、淋巴、PSG和卵巢进行解剖和收集。接下来，对中古人（A）、淋巴（B）、PSG（C）和卵巢（D）进行DNA和qPCR的提取。数据首先归化为白蝇β-actinDNA，然后获得的病毒的相对数量再次归化为24 h.NV：非病毒性。数据以相对病毒量的平均值 = SEM 表示。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里，我们描述了一种方案，用于通过免疫荧光和qPCR在其白蝇载体的组织中定位和定量果蝇病毒。解剖是白蝇组织中对病毒进行本地化和量化的第一步。白蝇的身体长约1毫米，这意味着组织非常小，很难解剖它们。此外，组织之间有很强的联系。例如，卵巢与细菌紧密结合，使其难以分离。在这里，考虑到不同组织的特点和位置，我们描述了不同的解剖方法。然而，需要大量的实践来快速准确地解剖这些组织。此外，最好使用新鲜的白蝇，因为死昆虫会增加解剖的难度。此外，解剖后，必须清洁组织，以避免污染。
免疫荧光技术基于特定抗体的使用。每个抗体的合适工作浓度在成像中非常重要，因为高浓度的抗体会降低信背景比，低浓度可能无法提供足够的信号。在这里，我们使用稀释1：400的初级抗体和第二抗体。这些抗体应分成小等分，并保持在-20°C，以避免反复冻结和解冻。抗体稀释应在使用前准备。当此处描述的方案用于共同地化病毒和白蝇蛋白时，对病毒和白蝇蛋白的主要抗体产生于不同物种的动物中非常重要。此外，应仔细选择二级抗体的荧光道，以防止通道之间出血。此外，鉴于白蝇组织体积小，应始终在显微镜下清洗，以避免损失。虽然免疫荧光是高度敏感的，但与其他病毒定位方法（如荧光原位杂交 （FISH））相比，它相对来说更耗时，成本也更高。此外，针对果病毒的抗体可能不能购买。
qPCR在白蝇组织中成功应用的关键在于设计合适的引物和选择内源参考基因。Rodríguez等人详细描述了qPCR引材设计的标准，这也适用于病毒引材的设计。本研究选择β-actin作为白蝇组织中病毒定量的参考基因。然而，在某些情况下（例如RNA基因），其他内源性基因如果适合实验设计29，则应作为参考基因。此外，为了获得稳定和准确的结果，应使用相同的发展阶段的白蝇，因为不同发展阶段的白蝇具有获取和传播病毒的差别能力22。此外，当我们使用20个PSG或中古人作为一个样本时，我们使用从一只白蝇中收集的淋巴作为qPCR分析的样本。这是因为，收集淋巴是费时和淋巴样本的DNA很容易降解，如果不及时处理。该协议还可用于量化白蝇全身和受病毒感染植物中的病毒数量。
总之，我们描述了一种高效而敏感的方案，分别通过免疫荧光和qPCR对白蝇组织中的贝戈病毒进行本地化和量化。该协议也可以适应其他果曲病毒的定位和定量。此外，免疫荧光的修饰方案可用于共定病毒和白蝇蛋白。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家重点研究与发展计划（赠款号：2017YFD0200600）、中国农业研究系统专项资金（赠款号：CARS-23-D07）和比尔和梅林达·盖茨基金会（投资IDOPP1149777）的支持。).我们感谢吴建祥教授提供TYLCV CP抗体。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
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