Lokalisering och kvantifiering av begomovirus i Whitefly Vävnader av Immunofluorescens och kvantitativ pcr
Summary
Vi beskriver en immunofluorescens och kvantitativ PCR-metod för lokalisering och kvantifiering av begomovirus i insektsvävnader. Immunofluorescensprotokollet kan användas för att kolokalisera virus- och vektorproteiner. Det kvantitativa PCR-protokollet kan utvidgas till att kvantifiera virus i hela whitefly-kroppar och virusinfekterade växter.
Abstract
Begomovirus (släktet Begomovirus, familj Geminiviridae) överförs av whiteflies av Bemisia tabaci komplex på ett ihållande, cirkulerande sätt. Med tanke på de omfattande skador som orsakas av begomovirus att beskära produktionen över hela världen, är det absolut nödvändigt att förstå samspelet mellan begomovirus och deras whitefly vektor. För att göra detta är lokalisering och kvantifiering av viruset i vektorvävnaderna avgörande. Här, med hjälp av tomatgula blad curl virus (TYLCV) som ett exempel, beskriver vi ett detaljerat protokoll för att lokalisera begomovirus i whitefly midguts, primära salivary körtlar, och äggstockar genom immunfluorescens. Metoden är baserad på användning av specifika antikroppar mot ett virusskiktprotein, färgmärkta sekundära antikroppar och ett konfokalmikroskop. Protokollet kan också användas för att kolokalisera begomovirala och whitefly proteiner. Vi beskriver vidare ett protokoll för kvantifiering av TYLCV i whitefly midguts, primära salivary körtlar, hemolymph och äggstockar av kvantitativpcr (qPCR). Med hjälp av primers speciellt utformade för TYLCV, protokollen för kvantifiering möjliggör jämförelse av mängden TYLCV i olika vävnader i whitefly. Det beskrivna protokollet är potentiellt användbart för kvantifiering av begomovirus i kroppen av en whitefly och en virusinfekterad växt. Dessa protokoll kan användas för att analysera spridningsvägen för begomovirus i whitefly eller som ett komplement till andra metoder för att studera whitefly-begomovirus interaktioner.
Introduction
Under de senaste decennierna har begomovirus (släktet Begomovirus, familj Geminiviridae) orsakat allvarliga skador på produktionen av många vegetabiliska, fibrer och prydnadsgrödor över hela världen1. Begomovirus överförs på ett ihållande sätt av whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), som är en komplex art som innehåller över 35 kryptiska arter2,3. Begomovirus kan direkt eller indirekt påverka whitefly fysiologi och beteende, såsom fruktsamhet4,livslängd4, och värd preferens5,6. Dessutom varierar överföringseffektiviteten hos en viss begomovirusarter/stam för olika vitfluga kryptiska arter även under samma experimentella förhållanden7,8,9,10, vilket tyder på att det finns en komplex interaktion mellan begomovirus och vitflugor. För att bättre förstå de mekanismer som ligger bakom whitefly-begomovirus interaktioner, lokalisering och kvantifiering av viruset i whitefly vävnader är viktiga.
Tomat gult blad curl virus (TYLCV) är en begomovirus som först rapporterades i Israel men numera orsakar allvarliga skador på tomatproduktion över hela världen11,12. På grund av dess ekonomiska betydelse är det en avde bäst studerade begomovirus13 . Liksom andra monopartite begomovirus, tylCV är en enda sträng cirkulärDNA-virus med en genomstorlek på ca 2.800 nukleotider14. Även om fortfarande under debatt, flera rader av bevis stöder replikering av TYLCV i whiteflies15,16,17. Dessutom har interaktionen mellan TYLCV-partiklar och vitfluga proteiner rapporterats6,18,19,20. För virusöverföring förvärvar whiteflies TYLCV genom att livnära sig på virusinfekterade växter, virions passerar längs matkanalen för att nå matstrupen, penetrera midgutväggen för att nå hemolymph, och sedan flytta in i de primära salivary körtlar (PSGs). Slutligen, virions egested med saliv längs spottatid i växt phloem21. Dessutom visar flera studier att TYLCV kan överföras transovarially från kvinnliga vitflugor till deras avkomma22,23. Med andra ord, för att uppnå produktiv överföring, måste viruset övervinna cellulära hinder inom whitefly att flytta från en vävnad till en annan. Under korsningen av dessa hinder, interaktioner mellan whitefly och virusproteiner kommer sannolikt att uppstå, förmodligen bestämma den effektivitet med vilken virusöverförs.
Immunofluorescens är en vanlig teknik för proteindistribution analys. Specificiteten hos antikroppar som är bindande för deras antigen utgör grunden för immunfluorescens. På grund av den ekonomiska betydelsen av TYLCV, monoklonala antikroppar mot TYLCV päls protein har utvecklats, erbjuder ett mycket känsligt sätt att lokalisera viruset24. Kvantitativ PCR (qPCR) möjliggör känslig och specifik kvantifiering av nukleinsyror. Denna teknik baseras oftast på användning av hydrolyssond (t.ex. TaqMan) eller fluorescerande färgämne (t.ex. SYBR Green) detektion. För hydrolys sondbaserad qPCR behövs specifika sonder, vilket därmed ökar kostnaden. Fluorescerande färgämnesbaserad qPCR är enklare och mer kostnadseffektivt, eftersom märkta ampliconspecifika hybridiseringssonder inte krävs25. Hittills har flera studier använt immunofluorescens och qPCR tillsammans med andra metoder för att undersöka komplexa begomovirus-whitefly interaktioner. Pan et al. utförde till exempel qPCR- och immunfluorescensanalys av viruset i vitfluga vävnader och fann att skillnaden i förmåga att överföra tobakslockfritt skjuta virus (TbCSV) mellan vitfluga arter AsiaII 1 och Mellanöstern Asien Mindre 1 (MEAM1) berodde på att viruset effektivt kunde korsa midgut väggen i AsiaII1 men inte MEAM18. På samma sätt, medan Medelhavet (MED) whiteflies lätt kan överföra TYLCV, misslyckas de med att överföra tomatgula blad curl Kina virus (TYLCCNV). Selektiv överföring undersöktes med hjälp av immunofluorescens detektion av virus i PSGs, som visade att TYLCCNV inte lätt korsar PSGs av MED whiteflies26. Immunofluorescens colocalization av TYLCV CP och autofagi markör protein ATG8-II i whitefly midguts visar att autofagi spelar en avgörande roll för att undertrycka infektionen av TYLCV i whitefly27.
Här, med tylcv som exempel, beskriver vi ett protokoll för lokalisering av begomovirus i whitefly midguts, PSGs och äggstockar genom en immunofluorescens teknik. Tekniken innehåller dissekering, fixering och inkubation med primära och färgmärkta sekundära antikroppar. Fluorescenssignaler som visar placeringen av virusproteiner i whitefly vävnaderna kan sedan upptäckas under ett konfokalmikroskop. Ännu viktigare är att detta protokoll kan användas för att kolokalisera begomovirala och whitefly proteiner. Vi beskriver vidare ett protokoll för kvantifiering av TYLCV med SYBR Green-baserade qPCR i whitefly midguts, PSGs, hemolymph och äggstockar, som kan användas för att jämföra mängden virus i olika whitefly vävnad prover.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för lokalisering och kvantifiering av ett begomovirus i vävnaderna i sin whitefly vektor av immunofluorescens och qPCR. Dissekering representerar det första steget för att lokalisera och kvantifiera viruset i whitefly vävnader. Den whitefly kroppen är ca 1 mm i längd, vilket innebär att vävnaderna är extremt små, och det är svårt att dissekera dem. Dessutom finns det starka kopplingar mellan vävnaderna. Äggstockarna är till exempel tätt kopplade till bakteriocyterna, vilke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Key Research and Development Program (Bidragsnummer: 2017YFD0200600), den öronmärkta fonden för China Agriculture Research System (bidragsnummer: CARS-23-D07) och Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP11497777 ). Vi tackar professor Jian-Xiang Wu för att ge TYLCV CP antikroppar.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
References
- Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. Emerging virus diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).
- Liu, J., et al. Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly. Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).
- Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics. PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).
- Fang, Y., et al. Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 3, 2876 (2013).
- Guo, T., et al. Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex. Scientific Reports. 5, 15432 (2015).
- Pan, L. L., et al. Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors. Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).
- Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector. Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).
- Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species. Phytopathology. , (2019).
- Cohen, S., Nitzany, F. E. Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus. Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).
- Moriones, E., Navas-Castillo, J. Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide. Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. Tomato yellow leaf curl virus – a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component. Virology. 185 (1), 151-161 (1991).
- Sanchez-Campos, S., et al. Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci. Scientific Reports. 6, 30942 (2016).
- Pakkianathan, B. C., et al. Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci. Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).
- Rodriguez-Negrete, E. A., et al. A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses. Scientific Reports. 4, 6438 (2014).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).
- Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus. Virology. 535, 210-217 (2019).
- Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).
- Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector. Viruses. 9 (10), 273 (2017).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Virology. 240 (2), 295-303 (1998).
- Xie, Y., et al. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies. Virology Journal. 10, 142 (2013).
- Arya, M., et al. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).
- Wei, J., et al. Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses. Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).
- Wang, L. L., et al. The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies. Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).
- Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts. Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).
- Li, R., et al. Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).
