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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Caractérisation des changements conformationnels à molécule unique sous le flux de cisaillement avec microscopie fluorescence

Published: January 25, 2020 doi: 10.3791/60784
Automatic Translation
1, *2, *3, 3, 1,2, 1,4
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons un protocole pour immobiliser les macromolécules simples dans les dispositifs microfluidiques et quantifier les changements dans leurs conformations sous le flux de cisaillement. Ce protocole est utile pour caractériser les propriétés biomécaniques et fonctionnelles des biomolécules telles que les protéines et l'ADN dans un environnement de flux.

Abstract

Le comportement d'une seule molécule sous perturbation mécanique a été caractérisé largement pour comprendre beaucoup de processus biologiques. Cependant, des méthodes telles que la microscopie de force atomique ont une résolution temporelle limitée, tandis que le transfert d'énergie de résonance (FRET) ne permet que d'inférer des conformations. La microscopie de fluorescence, d'autre part, permet la visualisation in situ en temps réel de molécules uniques dans diverses conditions de débit. Notre protocole décrit les étapes pour capturer les changements conformationnels des biomolécules simples sous différents environnements de flux de cisaillement utilisant la microscopie de fluorescence. Le flux de cisaillement est créé à l'intérieur des canaux microfluidiques et contrôlé par une pompe à seringues. Comme démonstrations de la méthode, le facteur von Willebrand (VWF) et l'ADN lambda sont étiquetés avec de la biotine et du fluorophore, puis immobilisés sur la surface du chenal. Leurs conformations sont surveillées en permanence sous le flux variable de cisaillement à l'aide d'une réflexion interne totale (TIRF) et d'une microscopie à fluorescence confocale. La dynamique réversible de démêler de VWF sont utiles pour comprendre comment sa fonction est régulée dans le sang humain, tandis que la conformation de l'ADN lambda offre un aperçu de la biophysique des macromolécules. Le protocole peut également être largement appliqué pour étudier le comportement des polymères, en particulier les biopolymères, dans des conditions d'écoulement variables et pour étudier la rhéologie des fluides complexes.

Introduction

Les mécanismes de la façon dont les biomolécules réagissent aux stimuli environnementaux ont été largement étudiés. Dans un environnement d'écoulement en particulier, les forces de cisaillement et d'allongement régulent les changements conformationnels et potentiellement la fonction des biomolécules. Les exemples typiques incluent le dénouement induit par le cisaillement de l'ADN lambda et du facteur von Willebrand (VWF). Lambda DNA a été utilisé comme un outil pour comprendre la dynamique conformationnelle des chaînes individuelles et flexibles polymères et la rhéologie des solutions polymères1,2,3,4. VWF est un capteur d'écoulement naturel qui agrége les plaquettes sur les sites de plaies des vaisseaux sanguins avec des taux de cisaillement anormaux et des schémas de débit. Le dénouement de la VWF est essentiel pour activer la reliure des plaquettes au domaine A1 et la liaison au collagène au domaine A3. En outre, le déploiement du domaine A2 induit par le cisaillement élevé permet le clivage de VWF, qui régule sa répartition du poids moléculaire en circulation5,6. Ainsi, la visualisation directe de la façon dont ces molécules se comportent sous le flux peut grandement améliorer notre compréhension fondamentale de leur biomécanique et de leur fonction, ce qui peut permettre de nouvelles applications diagnostiques et thérapeutiques.

Les méthodologies typiques pour caractériser les conformations d'une seule molécule comprennent les pinces optiques/magnétiques, la microscopie de force atomique (AFM) et le transfert d'énergie de résonance à molécule unique (FRET)7. La spectroscopie de force à molécule unique est un outil puissant pour étudier la force et le mouvement associés aux changements conformationnels des biomolécules. Cependant, il n'a pas la capacité de cartographier les conformations moléculaires globales8. L'AFM est capable d'imagerie avec une haute résolution spatiale, mais est limitée dans la résolution temporelle9,10. De plus, le contact entre la pointe et l'échantillon peut confondre la réponse induite par le débit. D'autres méthodes comme le FRET et l'analyse des nanopores déterminent le pliage et le développement des protéines monomolécules en fonction de la détection de la distance intramoléculaire et des volumes exclus. Cependant, ces méthodes sont encore à leurs balbutiements et limitées dans leur observation directe des conformations monomolécules11,12,13,14.

D'autre part, l'observation directe des macromolécules à haute résolution temporelle et spatiale sous microscopie fluorescence a amélioré notre compréhension de la dynamique d'une seule molécule dans de nombreux processus biologiques15,16. Par exemple, Fu et coll. ont récemment réalisé la visualisation simultanée de l'allongement de la VWF et de la liaison des récepteurs plaquettaires pour la première fois. Dans leur travail, les molécules de VWF ont été immobilisées à la surface d'un canal microfluidique par des interactions biotin-streptavidin et représentées sous la microscopie de fluorescence interne totale (TIRF) à des environnements de flux de cisaillement variables17. En appliquant une méthode similaire à celle de Fu, nous démontrons ici que les conformations de l'ADN de VWF et de lambda peuvent être directement observées sous la microscopie de fluorescence de TIRF et de fluorescence confocale. Comme le montre la figure 1, des dispositifs microfluidiques sont utilisés pour créer et contrôler le flux de cisaillement, et les biomolécules sont immobilisées à la surface du chenal. Lors de l'application de différents taux de cisaillement, des conformations d'une même molécule sont enregistrées pour mesurer la longueur d'extension, également indiquée à la figure 1. La méthode pourrait être largement appliquée pour explorer d'autres comportements polymères dans des environnements d'écoulement complexes pour des études rhéologiques et biologiques.

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Protocol

1. Préparation de la VWF

  1. Reconstituer le plasma humain VWF pour le préparer aux réactions d'étiquetage. Ajouter 100 l'eau déionisée (DI) à 100 g de VWF lyophilisé pour créer une solution de stock VWF de 1 mg/mL.
  2. Dialyez la solution de stock VWF afin d'éliminer l'excès de glycine, augmentant ainsi l'efficacité d'étiquetage de la biotine et du fluorophore.
    1. Transférer 50 L de solution de bouillon VWF dans une unité de dialyse de 0,1 ml avec un seuil de poids moléculaire de 10 000 et sceller avec un bouchon. Conserver la solution de stock restante à -20 oC. Le stock de VWF sera stable jusqu'à 1 an à -20 oC.
    2. Exécuter la dialyse en 500 ml de saline 1x phosphate-tamponné stérile (PBS) (0,01 M de phosphate disodium, 0,0018 phosphate monopotassium, 0,0027 M de chlorure de potassium, 0,137 M de chlorure de sodium, pH 7,4 à 25 oC) pour 1 h à 4 oC avec agitation lente. Répéter la dialyse pendant une heure supplémentaire en utilisant 500 ml de PBS frais.
  3. Démarrer la réaction d'étiquetage de la biotine. Préparer une solution de 2 mM de NHS-PEG4-biotine en dissolvant le solide dans l'eau DI immédiatement avant la réaction. Permettre au NHS-PEG4-biotine de rester dans l'eau pendant une période prolongée entraînera l'hydrolysme du groupe NHS-ester, diminuant ainsi l'efficacité de l'étiquetage.
    1. Ajouter 2,5 L de 2 mM NHS-PEG4-biotine à l'unité de dialyse contenant la solution de stock VWF. Cela se traduira par un excès de biotine 20 fois plus molaire par rapport aux monomères VWF. Les amines primaires de VWF réagiront avec les groupes NHS-ester, liant ainsi covalentement aux groupes PEG4-biotinepar l'intermédiaire des liens amide.
    2. Placer l'unité de dialyse à l'intérieur d'un tube microcentrifuge de 1,5 ml. Scellez l'unité de dialyse avec son bouchon correspondant. Sécurisez l'assemblage tube-dialyse avec Parafilm. Maintenez la verticale et laissez reposer à température ambiante pendant 40 min.
  4. Commencez la réaction d'étiquetage du fluorophore. Préparer une solution de 2,8 mM de colorant fluorescent Alexa 488 tétrafluorophenyl (TFP-ester) (excitationmaximale de 498 nm, émissionmaximale de 519 nm) en dissolvant le fluorophore solide dans l'eau DI. Faites ceci immédiatement avant la réaction pour empêcher le groupe de TFP-ester d'hydrolyser.
    1. Ajouter 2,9 L du fluorophore de 2,8 mM 488 à l'unité de dialyse. Cela se traduira par un excès de molaire 34 fois plus de fluorophore par rapport aux monomères VWF. Les amines primaires restantes de VWF réagiront avec les groupes DePF-Ester, se liant ainsi de façon covalente aux fluorophores par l'intermédiaire des liaisons amide.
    2. Ajouter 2,0 L de bicarbonate de sodium de 1 M (dissous dans l'eau DI) à l'unité de dialyse. Cela ajuste le pH de la réaction plus près de 8.0, ce qui augmente l'efficacité de la réaction TFP-ester et primaire amine.
    3. Fixer l'unité de dialyse dans un tube de microcentrifuge comme dans l'étape 1.3.2. Conserver dans l'obscurité pour éviter le photoblanchiment et laisser à température ambiante pendant 1 h et 30 min.
  5. Placer l'unité de dialyse dans 900 ml de 1x PBS stérile et dialyser toute la nuit à 4 oC. Cela donnera environ 70 L de VWF étiqueté à une concentration de 0,71 mg/mL ou 2,84 M (concentration monomère).
  6. Transfert étiqueté VWF dans un tube de microcentrifuge. Couvrir le tube de papier d'aluminium et protéger de la lumière. Conserver à 4 oC. Pour le stockage à long terme, ajouter l'azide de sodium d'agent antimicrobien à une concentration finale de 0,02 % (w/v).
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

2. Préparation de l'ADN Lambda

  1. Biotinylate linéaire lambda ADN en remplissant ses sites finaux cohésifs (cos sites) avec des nucléotides de biotine-14-dCTP selon les protocoles standard, répétéicien à l'étape 2.118. Remplissez le reste des sites cos avec des nucléotides dATP, dTTP et dGTP.
    1. Préparer 1 mM de dATP, dTTP, dGTP et biotine-14-dCTP dans un tampon de réaction 10x (500 mM de chlorure de sodium, 100 mM d'hydrochlorure Tris, 100 mM de chlorure de magnésium, 10 mM dithiothreitol, pH 7,9 à 25 oC).
    2. Placer 48 oL de 500 ng/L d'ADN lambda dans un tube PCR et chauffer pendant 5 min à 65 oC. Les sites cos de l'ADN lambda circulaire se sépareront sous la chaleur, lilinisant la molécule et rendant les surplombs à brin unique prêts pour la biotinylation. Immédiatement après, placez-les sur la glace pour empêcher les sites de cos de se ré-annexer.
    3. Ajouter 5 mL de 1 mM de dATP, dTTP et dGTP et 4 oL de 1 mM de biotine-14-dCTP à l'ADN lambda. Ajoutez également 2,5 L de 5 U/L Klenow Fragment (3'à5' exo-) pour catalyser la synthèse de l'ADN.
    4. Incuber le mélange de réaction pendant 1 h à 37 oC.
    5. Ajouter 1,2 L de 0,5 M EDTA. Chauffer ensuite le mélange de réaction pendant 5 min à 70 oC. Cela désactivera le fragment de Klenow et la réaction de biotinylation.
  2. Enlever l'excès de nucléotides de l'ADN lambda à l'aide d'une colonne de spin qui peut contenir 10-70 L et a un seuil de poids moléculaire de 6 000.
    1. Placer la colonne à l'intérieur d'un tube microcentrifuge de 2 ml. Centrifuger la colonne et le tube à 1000 x g pendant 2 min. Disposer de l'écoulement qui s'accumule dans le tube.
    2. Remplacez le tampon de colonne par une solution 1x du même tampon de réaction de l'étape 2.1.1. Pour ce faire, en ajoutant 500 l de 1x tampon à la colonne. Centrifugeuse pour 1 min à 1000 x g. Disposer de l'écoulement à travers. Répétez ces 2 fois de plus afin qu'un total de 1500 L ait été ajouté à la colonne.
    3. Placer la colonne dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml. Ajoutez soigneusement la solution de l'étape 2.1.5 à la couche supérieure de la colonne. Centrifugeuse de 4 min à 1000 x g.
    4. Recueillir le flux à travers (40-70 L) du tube de microcentrifuge et placer dans un tube PCR. Il contient l'ADN d'agneda purifié et biotinylated.
  3. Étiquetez l'ADN lambda avec colorant fluorescent YOYO-1 (excitationmaximale de 490 nm,émission maximale de 509 nm) selon les protocoles standard, répété ici à l'étape 2.3.120.
    1. Préparer une solution de colorant YOYO-1 et d'ADN lambda avec un rapport molaire de 1:10. Supposons qu'aucun ADN n'a été perdu dans l'étape de purification pour calculer la concentration de paire de base de l'ADN lambda. L'ADN lambda complet compte 48 502 paires de base.
      REMARQUE : Par exemple, si 50 l de solution ont été récupérées à partir de l'étape 2.2.4, ajoutez 7,4 l de 500 m DE colorant YOYO-1.
    2. Chauffer la solution pendant 2 h à 50 oC dans l'obscurité pour compléter la réaction.
    3. Couvrir le tube de papier d'aluminium et protéger de la lumière. Conserver à 4 oC. La solution est maintenant prête à être injectée dans des dispositifs microfluidiques.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

3. Création de moules microfluidiques dans la plaquette de silicium

  1. Utilisez la photolithographie pour créer des canaux microfluidiques avec des dimensions appropriées (Figure 2) sur une plaquette de silicium maître selon les protocoles standard19.

4. Préparation de l'appareil microfluidique polydiméthylsiloxane (PDMS)

  1. Ajouter 5 parties de base d'élastomère de silicone à 1 agent de durcissement en partie (par masse) dans un bateau de pesée. Remuer le contenu à fond pendant 1 min pour créer une solution PDMS pré-durcie.
  2. Placer la plaquette de silicium maître dans un plat Petri en plastique. Verser la solution PDMS sur la plaquette pour créer une couche de 5 mm. Couvrir le plat et laisser dans un dessiccateur sous vide pendant 1 h pour enlever les bulles d'air.
  3. Incuber le plat Petri couvert à 60 oC pendant la nuit pour guérir le PDMS en un solide souple. Le durcissement se traduira par des canaux microfluidiques moulés dans le PDMS à l'interface PDMS-wafer.
  4. Couper des rectangles de 20 x 10 mm dans le PDMS, autour de chaque canal microfluidique, à l'aide d'un rasoir. Retirez les blocs pDMS rectangulaires à l'égard d'une pince à épiler.
  5. Utilisez une aiguille d'extrémité émoussée de 25 G avec des bords aiguisés pour percer un trou de 0,5 mm de diamètre à une extrémité du chenal, en s'assurant que le trou passe complètement à travers le bloc PDMS (Figure 2). Utilisez une fine aiguille pour percer le PDMS du trou. Répétez cette opération à l'autre extrémité du canal. Cela créera une entrée et une sortie pour le flux à travers le canal.
  6. Nettoyez la surface du bloc PDMS avec du ruban adhésif en vinyle. Soufflez le gaz d'azote comprimé au-dessus d'un bordereau d'azote no 1 1/2, 22 x 50 mm pour enlever les débris.
  7. Placez le bloc PDMS avec le côté du canal vers le haut et le couvercle dans la chambre d'une machine de liaison plasma. Commencez le traitement.
  8. Lorsque le traitement est terminé, placez rapidement le bloc PDMS sur un bordereau de couverture afin que le canal soit en contact avec le glissement. Appliquer la pression le long des bords du bloc. Placer l'assemblage coverslip-PDMS sur une plaque chauffante à 115 oC pendant 15 min pour renforcer le lien permanent.
  9. Insérez un tube de 10 cm de long et de 0,25 mm de diamètre intérieur dans le trou de sortie au sommet du bloc PDMS. Cela permet au fluide de s'écouler facilement hors du canal. L'appareil est maintenant terminé.

5. Traitement de la surface de l'appareil microfluidique

  1. Injecter de l'albumine de sérum bovin biotinylated (BSA-biotine) dissous dans le 1x PBS stérile dans l'entrée d'un dispositif microfluidique pour les expériences VWF. Injecter 10 ll de 1 mg/mL de BSA-biotine pour des expériences d'ADN lambda. Retenir quelques microlitres de BSA-biotine dans la pointe de pipette après l'injection et laisser la pointe rester encastrée dans l'inlet.
    1. Gardez toujours une goutte d'eau DI autour de la pointe. Cela empêchera les bulles d'air d'entrer dans le canal. Appliquez cette technique chaque fois qu'une nouvelle solution est injectée dans le canal.
    2. Laisser la BSA-biotine incuber dans l'appareil pendant 2 h. La BSA se liera de la surface de couverture(figure 3A).
  2. Retirez la pointe de la pipette. Injecter la solution de blocage de caséine dans le canal et lui permettre d'incuber pendant 30 min. La caséine bloquera tout site libre, réduisant la liaison non spécifique des biomolécules à la surface (figure 3B).
  3. Retirez la pointe et injectez 10 ll de streptavidin dissous dans le canal pour les expériences VWF. Utilisez 100 streptavidins de 100 g/mL pour des expériences d'ADN lambda. Incuber pendant 10 min. La streptavidine se liera aux groupes de biotine de la BSA-biotine (figure 3C).
  4. Retirez la pointe et injectez la solution détergente 1x (0,05 % Tween 20 en PBS) dans le canal pour éliminer l'excès de streptavidine.
  5. Retirez la pointe et injectez 10 ll de 28,4 nM VWF diluédans dans la solution de caséine ou de l'ADN lambda de l'étape 2.3.3. Incubate VWF pendant 3 min. Incubate lambda DNA pendant 45 min (figure 3D).
  6. Retirez la pointe et injectez 10 ll de biotine libre diluée de 5 mm dans la solution de caséine. La biotine gratuite bloquera les sites de liaison excédentaires de streptavidin sur la surface du canal (figure 3E).

6. Visualiser l'ADN de VWF et lambda sous microscopie de fluorescence

  1. Préparer 1 mL de solution de blocage de caséine avec 2,2 mM d'acide protocatechuique et 37 nM protocatechuate-3,4-dioxygénase (pour minimiser le photoblanchiment). Chargez dans une seringue et fixez-les dans une pompe à seringues. Prendre un tube de 30 cm de long et de 0,25 mm de diamètre intérieur et attacher une extrémité à l'aiguille de seringue. Flux dans la solution pour enlever les bulles d'air. Fixez l'autre extrémité du tube à l'inlet de l'appareil microfluidique. Il est recommandé de le faire 3 minutes après l'étape 5.6.
  2. Sélectionnez l'objectif de grossissement le plus élevé (c.-à-d. 60-100X) d'un microscope de réflexion interne totale (TIRF) ou de fluorescence confocale. Ajouter une goutte d'huile d'immersion sur son objectif si nécessaire. Placez le dispositif microfluidique sur l'étape du microscope de sorte que la couverture soit rincière avec l'objectif.
  3. Commencez la microscopie brightfield. Ajustez la mise au point de sorte que toutes les caractéristiques, comme les débris et les bulles, soient visibles. Ensuite, ajustez la scène dans la direction X et Y jusqu'à ce que le bord du canal microfluidique soit visible et coupe le cadre en deux.
  4. Passez au canal 488 (FITC). Ajustez l'angle z-niveau et TIRF au besoin jusqu'à ce que les molécules globulaires vertes individuelles puissent être distinguées. Il s'agit de molécules d'ADN DE VWF ou de lambda.
  5. Ajuster le temps d'exposition et l'intensité laser pour visualiser les molécules fluorescentes sans les photoblanchir trop rapidement. Ajuster le contraste pour visualiser les molécules plus clairement.
  6. Démarrer le flux de la pompe à seringues de sorte que la solution de blocage de caséine s'écoule dans le canal et hors de la prise. Faites ceci exactement 5 minutes après l'étape 5.6. Arrêter et commencer le flux pour observer les changements dans la conformation des molécules. Lors de l'application du débit, les taux d'utilisation se sicomptent entre 5 000 et 30 000 l/h. Répétez cette opération dans diverses zones de l'appareil microfluidique. Poursuivez ce processus pour localiser les molécules qui peuvent s'étendre et se détendre sur plusieurs cycles d'arrêt et de démarrage du débit.
  7. Notez combien de temps il faut pour que les molécules atteignent une extension maximale et se détendent complètement dans les globules. Enregistrez des vidéos du comportement continu des molécules sous le flux de cisaillement, en sélectionnant le meilleur temps d'exposition, la fréquence d'exposition et la durée vidéo qui captureront toute la gamme du comportement d'extension et minimiseront le photoblanchiment.
  8. Enregistrer les vidéos comme . Fichiers AVI avec une barre d'échelle.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

7. Analyse d'image des changements conformationnels

  1. Calculer le taux deSymbol 1cisaillement de la paroi ( ) appliqué aux macromolécules en utilisant le débit (Q) et la hauteur (h) et la largeur (w) du canal microfluidique rectangulaire. Utilisez l'équation suivante pour ce faire :
    Equation 1
  2. Déterminer la longueur de toute biomolécule sous divers taux de cisaillement à l'aide d'un code MATLAB personnalisé (voir Fichiers supplémentaires). Créer un dossier intitulé analyse vidéo qui comprend les codes MATLAB suivants: main.m, save_each_frame.m, get_length.m et get_length.fig. Créez un sous-folder dans l'analyse vidéo intitulée vidéos et ajoutez . fichiers AVI à analyser.
  3. Ouvrez main.m en utilisant MATLAB 2019a et exécutez le code. Tapez le nom du fichier vidéo à analyser dans la fenêtre de commande sous S'il vous plaît entrer le fichierde données pour analyser: .
  4. Dans l'interface utilisateur graphique ouverte (GUI), définir le seuil (texte dans la boîte en haut à droite de la fenêtre) à 20 et cliquez sur le bouton de seuil set pour confirmer.
  5. Utilisez le curseur de données dans la barre d'outils supérieure de la fenêtre pour choisir un pixel n'importe où sur la barre d'échelle. Cliquez sur Point de départ dans la section barre d'échelle à droite de la fenêtre. La position (x,y) du pixel choisi apparaîtra à droite du bouton. Cliquez sur le bouton de taille Pixel (m). La taille du pixel ne doit être mesurée qu'une seule fois dans chaque vidéo.
  6. Choisissez n'importe quel pixel sur la molécule d'intérêt. Cliquez sur Le point de départ dans la section VWF. Après que la position du pixel choisi apparaît sur la boîte de texte sur la droite, cliquez sur l'extrémité gauche,l'extrémité droite et la longueur de la corde pour obtenir la longueur moléculaire dans l'image.
    REMARQUE: Cette étape peut être utilisée pour analyser les changements conformationnels de toute biomolécule, malgré le code ayant une section spécifique nommée VWF.
  7. Vérifier à deux fois l'extrémité gauche et droite de la molécule. Zoomez et utilisez le curseur de données pour vérifier la position d'intérêt du pixel. Choisissez manuellement le pixel comme fin et recalculez la longueur (en pixels) si nécessaire.
  8. Enregistrez la taille des pixels en m et la longueur de chaîne dans le nombre de pixels dans une feuille Excel et calculez la longueur de la chaîne en m.
  9. Répétez les étapes ci-dessus pour chaque image. Utilisez Last, Suivant bouton dans le coin inférieur droit de l'interface graphique pour basculer entre les images dans le même fichier vidéo. Cliquez sur Fermer pour fermer la fenêtre GUI.

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Representative Results

L'observation du comportement dynamique des biomolécules telles que vwF et lambda DNA dépend fortement de l'optimisation de leur liaison à la surface de l'appareil. L'incubation des traitements de surface pour les temps recommandés dans le dispositif microfluidique est cruciale pour obtenir la liaison avec quelques points d'ancrage, de sorte que les molécules peuvent librement s'étendre et se détendre lors de l'évolution du débit. Si les protéines ou l'ADN sont liés trop fortement avec des liens multiples, ils s'étendront à des longueurs limitées ou ne s'étendront pas du tout. Cela se produit en particulier avec VWF quand il reste sans écoulement sur la surface de l'appareil pendant plus de 3 minutes avant le blocage de la biotine libre. Plus la VWF reste à la surface stagnante, plus les groupes de biotine de VWF se lient aux groupes de streptavidin de surface et moins la molécule a de flexibilité à démêler. Si les molécules sont liées trop faiblement, d'autre part, elles se détacheront sur le flux et disparaîtront de la vue. Cela peut se produire si l'ADN de VWF ou lambda est incubé pendant trop peu de périodes, causant trop peu d'interactions biotin-streptavidin pour former. Les molécules peuvent également se libérer lorsque des taux de cisaillement extrêmement élevés sont appliqués, ce qui affaiblit les interactions biotine-streptavidine.

Une molécule idéale se lie à un point tel qu'elle peut se démêler et se détendre sur de multiples cycles d'arrêt et de démarrage. La flexibilité d'une molécule pour changer la conformation comme celle-ci est souvent démontrée par sa capacité à s'étendre à des longueurs croissantes à mesure que des taux de cisaillement plus élevés sont appliqués dans une gamme de flux croissant. Les images de VWF obtenues avec la microscopie TIRF démontrent cette relation dans la vidéo 1. La courbe de taux d'extension par rapport à la courbe de taux de cisaillement de cette même molécule VWF dans la figure 4 capture précisément le comportement induit par le cisaillement d'une molécule VWF et est utile pour caractériser les propriétés biomécaniques de la protéine. Les images de l'ADN lambda obtenu avec la microscopie de fluorescence confocale montrent également une extension accrue sur des taux de cisaillement plus élevés et une relaxation graduelle au-dessus de 2 min, comme est capturé dans la vidéo 2 et la vidéo 3. Les caractéristiques de recul de l'ADN lambda après l'arrêt du débit sont également représentées graphiquement dans la figure 5.

Figure 1
Figure 1 : Schématiques de l'expérience d'écoulement d'une seule molécule dans le canal microfluidique sous microscopie de fluorescence. La surface du canal est recouverte de BSA-biotine et bloquée par de la caséine. Streptavidin est lié à la biotine sur la surface du canal et aussi biotinylated VWF / lambda ADN pour immobiliser des molécules simples sur la surface. Comme le taux de cisaillement augmente de A à C, la molécule est étirée d'un état plié à un état allongé le long de la direction de flux de la gauche vers la droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Dimensions microfluidiques du canal. La forme et la structure du dispositif microfluidique PDMS sont montrées avec les dimensions du canal. Le canal mesure 50 m de hauteur et mesure de 0,1 à 1,0 mm de largeur. La région de rétrécissement au milieu du chenal est de 0,7 mm de longueur. L'anse et la sortie ont un diamètre de 0,5144 mm (25 G). La direction du flux est de gauche à droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Étapes de traitement de surface pour l'immobilisation d'une seule molécule. Toutes les étapes se produisent à température ambiante. (A. BSA-biotine est enduit sur la surface pendant 2 h. (B). La caséine est injectée dans le canal pendant 30 min pour bloquer la surface. (C). Streptavidin est incubé dans le canal pendant 10 min pour se lier avec BSA-biotine. (D). Après avoir lavé l'excès de molécules dans les anciennes étapes, le fluorophore et la biotine étiquetés ADN VWF/lambda est injecté dans le canal et immobilisé par liaison avec la streptavidine. (E). La biotine libre est déversée, bloquant les sites de liaison supplémentaires de streptavidin pour minimiser son interférence avec la molécule pendant les changements conformationnels. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Comportement d'extension de la VWF sous le flux de cisaillement. La molécule se démêle de façon réversible à 7 taux de cisaillement différents : 0 s-1, 33 333 s-1, 66 667 s-1, 100 000 s-1, 133 333 s-1, 166 667 s-1 et 200 000 s-1. La longueur de la molécule étirée passe de 0,52 m à un taux de cisaillement nul à 3,44 m à 200 000 s-1 taux de cisaillement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Comportement de relaxation de l'ADN lambda après l'arrêt du flux de cisaillement. Les taux de cisaillement de 33 000 s-1 et 66 667 s-1 sont appliqués de 0 à 30 s à la même molécule. La relaxation est enregistrée de 30 s à 150 s. À 66 667 s-1 taux de cisaillement, la molécule d'ADN s'allonge à 15,00 m et se détend à 5,83 m après que le flux a été arrêté pendant 2 min. À 33 333 s-1 taux de cisaillement, la molécule ne s'étend qu'à 8,75 m et mesure 3,33 m de longueur après 2 min de relaxation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Video 1
Vidéo 1 : Démêlage réversible de la VWF sous des taux croissants de cisaillement à l'aide de la microscopie interne totale de fluorescence de réflexion (TIRF). La molécule au milieu de la vue se démêle de façon réversible à des taux de cisaillement différents à 33 333 s-1, 66 667 s-1, 100 000 s-1 et 133 333 s-1. Une pompe à seringues est utilisée pour contrôler le débit à partir duquel les taux de cisaillement sont calculés. La direction du flux est de gauche à droite. Les images sont prises avec des intervalles de 15 s pour permettre la relaxation complète et les processus d'extension. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Video 2
Vidéo 2 : Relaxation de l'ADN lambda après 33 333 s-1 taux de cisaillement. Les images sont prises sous microscopie de fluorescence confocale. L'ADN de Lambda est étiré sous 33 333 s-1 flux de cisaillement et détendu de nouveau à un état plié après que le flux est arrêté à 30 s. Durée de la relaxation est de 2 min. Direction de flux est de gauche à droite. Les images sont prises avec des intervalles de 30 s entre les deux. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Video 3
Vidéo 3: Relaxation de l'ADN lambda après 66 667 s-1 taux de cisaillement. Les paramètres sont identiques à ceux de la vidéo 2, à l'exception du taux de cisaillement initial. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Fichiers supplémentaires : codes MATLAB. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Pour obtenir des données de haute qualité sur les changements conformationnels à molécule unique à l'aide de la microscopie de fluorescence décrite dans cette méthode, il est essentiel d'incuber la molécule pendant le temps approprié, de minimiser ses interactions non spécifiques avec la surface et établir des réglages de microscope qui réduisent le photoblanchiment. La capacité de la molécule à modifier librement la conformation est liée au nombre d'interactions biotine-streptavidine formées entre la molécule et la surface. Comme mentionné précédemment, cela doit être contrôlé par l'incubation de la molécule sans flux pour la quantité appropriée de temps. En outre, les protéines ou l'ADN peuvent ne pas se lier spécifiquement à la couverture si le bordereau de couverture n'est pas bloqué efficacement. Sans la solution de blocage recommandée, les molécules peuvent se fixer au verre de façon non spécifique et ne pas réagir à tout débit appliqué. L'application du bloc de caséine pendant le traitement de surface tôt et le maintien de sa présence pendant le flux est essentiel pour réduire ces interactions non spécifiques. Enfin, la capture du comportement continu et dynamique d'une seule molécule nécessite une excitation fluorophore fréquente lors de la capture d'image. Cela peut provoquer un photoblanchiment rapide si l'intensité laser, le temps d'exposition et la fréquence d'exposition sont trop élevés. Il est donc nécessaire d'ajuster ces paramètres en tandem et d'élaborer des stratégies pour réduire leurs valeurs sans compromettre le temps ou la résolution d'image des données.

Si l'extension et la relaxation de la molécule ne sont pas observées, des étapes supplémentaires doivent être suivies. Incuber la molécule dans l'appareil pendant des temps plus longs et plus courts que ce qui est conseillé dans le protocole. Pour chaque fois que cela est testé, varier les concentrations de BSA-biotine et de streptavidin par des facteurs de 10. Ces tests peuvent être nécessaires pour optimiser le nombre de points d'ancrage biotin-streptavidin formés entre la molécule et la surface. Par exemple, si la densité d'étiquetage de la biotine est très élevée, en raison de déviations par rapport aux concentrations recommandées ou aux réactifs du protocole d'étiquetage, il peut être nécessaire de réduire le temps d'incubation moléculaire et de réduire les concentrations de BSA-biotine et de streptavidin. Pour améliorer encore le succès de l'expérience, numérisez l'ensemble du dispositif microfluidique à la recherche de molécules qui se déversent de façon réversible. La surface ne peut pas être traitée uniformément avec de la streptavidine ou un bloc de caséine, ce qui provoque des molécules dans certaines zones d'avoir des réponses plus démêler que d'autres.

Cette méthode est limitée par un manque d'informations sur la taille et les points d'attache de la molécule, la difficulté à produire 0 s-1 taux de cisaillement et la résolution optique des microscopes à fluorescence. Les travaux antérieurs ont montré une grande variation dans le comportement de démêler de VWF, potentiellement expliqué par la large distribution dans le nombre et l'emplacement des points d'attache biotin-streptavidin et le poids moléculaire de chaque molécule de VWF18. À l'heure actuelle, la méthode que nous présentons ne peut pas définir les points d'attache et la taille moléculaire. Cependant, les simulations de dynamique Brownienne d'un modèle VWF à grain grossier publié par Wang et coll. incorporent ces variables et peuvent être exécutés parallèlement à des résultats expérimentaux pour expliquer une telle variation18. De plus, le débit ne s'arrête pas instantanément lorsque la pompe à seringues est arrêtée, ce qui confond l'observation de la dynamique de recul. Cela est dû à la déformation et à la légère dilatation du canal PDMS pendant la période de débit prévue. Lorsque la pompe est arrêtée, le liquide continue de couler jusqu'à ce que le PDMS soit complètement détendu. Un système amélioré devrait utiliser des PDMS plus rigides ou des microcanaux fabriqués dans des matières plastiques dures, permettant au fluide d'atteindre un taux de cisaillement de 0 s-1 plus rapidement. Enfin, on ne peut résoudre que des molécules dont la taille est du même ordre de grandeur que la résolution optique du microscope à fluorescence, qui peut ne pas être plus petite que quelques centaines de nanomètres. Ainsi, il y a une exigence de taille minimale pour les molécules qui peuvent être directement observées avec cette méthode.

Le protocole actuel concerne principalement la quantification des changements conformationnels des molécules de protéines et d'ADN sous le flux physiologique. Cependant, la méthode peut également être utilisée pour visualiser les interactions en temps réel entre les molécules biologiques et caractériser davantage la fonction des protéines et de l'ADN. Par exemple, Fu et coll. ont montré que la VWF attachée peut s'activer sous un flux de cisaillement élevé et capturer davantage la molécule d'adhérence plaquettaire GPIbMD dans des conditions d'écoulement variables17. Cet événement contraignant est préservé même lorsque VWF est lié à la surface par des liaisons biotine-streptavidin, démontrant l'efficacité de ce protocole pour étudier les fonctions physiologiquement pertinentes et la mécanique17. Des connaissances mécanistes similaires pourraient être obtenues lors de l'étude des interactions entre l'ADN démêlé et les protéines régulatrices dans les environnements de débit21,22. En outre, notre méthode se rapporte principalement à l'observation des changements conformationnels dans les macromolécules. Néanmoins, on pourrait l'adapter dans le but d'étudier de plus petites molécules qui sont assez grandes pour être résolues sous la microscopie de fluorescence. Par exemple, en attachant non-covalently ou covalently une petite molécule à un ADN lambda beaucoup plus grand et immobilisé, on pourrait augmenter la sensibilité de cisaillement de la plus petite molécule et observer plus facilement son comportement. En conclusion, d'autres méthodes de caractérisation à molécule unique, comme l'AFM ou les pinces optiques, fournissent des données à haute résolution sur les propriétés structurelles et fonctionnelles des macromolécules; cependant, ces méthodes alternatives ne peuvent pas observer les changements dynamiques et conformationnels des protéines et de l'ADN qui ont lieu dans un environnement physiologique de flux, comme est présenté dans ce protocole.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de la National Science Foundation DMS-1463234, national Institutes of Health subventions HL082808 et AI133634, et le financement interne de l'Université Lehigh.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Labeling Kit Invitrogen A30006
Bio-Spin P-6 Gel Columns Bio-Rad 7326221
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Use as free biotin in Step 5.6
Biotin-14-dCTP AAT Bioquest 17019
BSA-Biotin Sigma-Aldrich A8549
Coverslips VWR 48393-195 No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP Set Invitrogen 10297018
Float Buoys for Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69588
Klenow Fragment (3'→5' exo-) New England BioLabs M0212S Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2
Lambda DNA New England BioLabs N3011S
Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69570 10K MWCO, 0.1 mL volume
NEBuffer 4 New England BioLabs B7004S
NHS-PEG4-Biotin Thermo Scientific 21330
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase Sigma-Aldrich P8279
Protocatechuic acid Santa Cruz Biotechnology sc-205818
Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication The Dow Chemical Company 4019862
Streptavidin Sigma-Aldrich 85878
The Blocking Solution CANDOR Bioscience 110 050 Use as casein blocking solution throughout protocol
Vinyl Cleanroom Tape Fisher Scientific 19-120-3217
von Willebrand Factor, Human Plasma Millipore Sigma 681300
YOYO-1 Dye AAT Bioquest 17580
0.25 mm Inner Diameter Tubing Cole-Parmer EW-06419-00
25 Gauge Needle Thomas Scientific JG2505X

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References

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Bioingénierie Numéro 155 facteur von Willebrand ADN lambda microfluidique flux de cisaillement TIRF microscopie de fluorescence confocale
Caractérisation des changements conformationnels à molécule unique sous le flux de cisaillement avec microscopie fluorescence
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Pisapati, A. V., Wang, Y., Blauch, M. E., Wittenberg, N. J., Cheng, X., Zhang, X. F. Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60784, doi:10.3791/60784 (2020).

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