Summary
Мы представляем протокол для иммобилизации отдельных макромолекулв в микрофлюидных устройствах и количественной изменения в их конформации при потоке сдвига. Этот протокол полезен для характеристики биомеханических и функциональных свойств биомолекул, таких как белки и ДНК в среде потока.
Abstract
Одномолекулярное поведение при механических возмущениях характеризуется широко, чтобы понять многие биологические процессы. Однако такие методы, как атомная силовая микроскопия, имеют ограниченное временное разрешение, в то время как режит энергии Фюрстера (FRET) только позволяет делать вывод о конформах. Флуоресценция микроскопии, с другой стороны, позволяет в режиме реального времени на месте визуализации отдельных молекул в различных условиях потока. Наш протокол описывает шаги по захвату конформансальных изменений отдельных биомолекул в различных средах потока сдвига с помощью флуоресценционной микроскопии. Поток сдвига создается внутри микрофлюидных каналов и контролируется шприц насосом. В качестве демонстрации метода, фон Willebrand фактор (VWF) и лямбда ДНК помечены биотин омичи и фторфора, а затем обездвижены на поверхности канала. Их конформации постоянно контролируются при переменном потоке сдвига с использованием общего внутреннего отражения (TIRF) и конфокальной флуоресценции микроскопии. Реверсивная динамика распутывания VWF полезна для понимания того, как регулируется его функция в крови человека, в то время как конформация ДНК лямбды дает представление о биофизике макромолекул. Протокол также может быть широко применен для изучения поведения полимеров, особенно биополимеров, в различных условиях потока и для исследования реологии сложных жидкостей.
Introduction
Механизмы реагирования биомолекул на экологические стимулы были изучены широко. В среде потока, в частности, сдвига и удлиненные силы регулируют конформационные изменения и, возможно, функции биомолекул. Типичные примеры включают сдвига индуцированной распутывание лямбда ДНК и фон Willebrand фактор (VWF). Ламбда ДНК была использована в качестве инструмента для понимания конформационной динамики отдельных, гибких полимерных цепей и реологии полимерных решений1,2,3,4. VWF является естественным датчиком потока, который агрегирует тромбоциты на участках раны кровеносных сосудов с ненормальными скоростью сдвига и структурой потока. Разгадка VWF имеет важное значение для активации связывания тромбоцитов с доменом A1 и связывания коллагена с доменом A3. Кроме того, высокий сдвига индуцированных A2 домена разворачивается позволяет расщепление VWF, который регулирует его молекулярное распределение веса вобращении5,6. Таким образом, прямая визуализация того, как эти молекулы ведут себя под потоком, может значительно улучшить наше фундаментальное понимание их биомеханики и функции, что, в свою очередь, может позволить новые диагностические и терапевтические применения.
Типичные методологии для характеристики одномолекулярных конформации включают оптические/магнитные пинцеты, атомную микроскопию силы (AFM) и одномолекулярную рецензируемую рецензию Фюрстера (FRET)7. Одномолекулярная силовая спектроскопия является мощным инструментом для исследования силы и движения, связанных с конформационными изменениями биомолекул. Тем не менее, ему не хватает возможности составить карту общих молекулярных конформий8. AFM способен к визуализации с высоким пространственным разрешением, но ограничен в временном разрешении9,10. Кроме того, контакт между кончиком и образцом может затруднить реакцию, вызванную потоком. Другие методы, такие как FRET и нанопорная аналитика, определяют одномолекулярные белковые складные и разворачивающиеся состояния на основе обнаружения внутримолекулярного расстояния и исключенных объемов. Тем не менее, эти методы все еще находятся в зачаточном состоянии и ограничены в их прямом наблюдении одномолекулярных конформации11,12,13,14.
С другой стороны, непосредственное наблюдение макромолекулы с высоким висальным и пространственным разрешением при флуоресценционной микроскопии улучшило наше понимание одномолекулярной динамики во многих биологических процессах15,16. Например, Fu et al. недавно впервые добились одновременной визуализации удлинения VWF и связывания рецепторов тромбоцитов. В своей работе молекулы VWF были обездвижены на поверхности микрофлюидного канала через взаимодействия биотин-стрептавидина и изображены под общей внутренней флуоресценцией (TIRF) микроскопии при различных средах потока сдвига17. Применяя аналогичный метод, как Фу, мы здесь продемонстрировать, что конформации VWF и лямбда ДНК могут быть непосредственно наблюдались как при TIRF и конфокальной флуоресценции микроскопии. Как показано на рисунке 1,микрофлюидные устройства используются для создания и контроля потока сдвига, а биомолекулы обездвижены на поверхности канала. При применении различных ставок сдвига регистрируются конформации одной и той же молекулы для измерения прорезной длины, также показанной на рисунке 1. Этот метод может быть широко применен для изучения других полимерных поведений в сложных условиях потока как для реологических, так и для биологических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка VWF
- Восстановите плазму человека VWF, чтобы подготовить ее к маркировке реакций. Добавьте 100 л деионизированной (DI) воды в 100 мкг лиофилизированного VWF для создания 1 мг/мл VWF сзапасваемого раствора.
- Dialyze VWF фондовый раствор для того, чтобы удалить избыток глицина, тем самым увеличивая эффективность маркировки биотина и фторорора.
- Передача 50 злифика раствора запасов VWF в диализный блок 0,1 мл с 10 000 молекулярным отсечкой веса и уплотнением крышкой. Храните оставшийся биржевый раствор при -20 градусов по Цельсию. Акции VWF будут стабильными в течение 1 года при -20 градусов по Цельсию.
- Запуск диализа в 500 мл 1x стерильный фосфат-буферный солей (PBS) (0,01 M дисотрия фосфат, 0,0018 монопотазий фосфат, 0,0027 М хлорид калия, 0,137 М хлорид натрия, pH 7.4 на 25 Повторите диализ в течение дополнительного часа, используя 500 мл свежего PBS.
- Начните реакцию маркировки биотина. Подготовьте 2 мМ раствор NHS-PEG4-biotin путем растворения твердых веществ в воде DI непосредственно перед реакцией. Разрешение NHS-PEG4-biotin оставаться в воде в течение длительного времени приведет к NHS-эфир группы гидролизоваться, тем самым уменьшая эффективность маркировки.
- Добавьте 2,5 л 2 мМNHS-PEG 4-биотина в диализный блок, содержащий решение для акций VWF. Это приведет к 20-кратного избытка молярного биотина по сравнению с мономерами VWF. Первичные амины VWF будут реагировать с NHS-ester групп, темсамым ковалентно связывания с PEG 4-биотин групп через amide связи.
- Поместите диализный блок в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Печать диализного блока с соответствующей крышкой. Защищайте сборку трубно-диализного с Помощью Parafilm. Держите сью и оставьте при комнатной температуре в течение 40 минут.
- Начало флюорофорной маркировки реакции. Подготовьте раствор 2,8 мМ Alexa 488 тетрафторофенил-эстер (TFP-ester) флуоресцентный краситель (возбуждениемакс 498 нм,максимум выбросов - 519 нм) путем растворения твердого фторофора в воде DI. Сделайте это непосредственно перед реакцией, чтобы предотвратить гидролизуем группы TFP-ester.
- Добавьте 2,9 л флюорофора 2,8 мМ 488 в диализный блок. Это приведет к 34-кратного избытка молярного флюорофора по сравнению с vwF мономеров. Оставшиеся первичные амины VWF будут реагировать с группами TFP-ester, тем самым ковалентно связывая с флюорофорами через аминные связи.
- Добавьте 2,0 л бикарбоната натрия (растворенного в воде DI) в диализный блок. Это регулирует рН реакции ближе к 8.0, что повышает эффективность TFP-эстер и первичной реакции амина.
- Защищайте диализный блок в микроцентрифуговой трубке так же, как и в шаге 1.3.2. Хранить в темноте, чтобы предотвратить фотоотбеление и оставить при комнатной температуре в течение 1 ч и 30 мин.
- Поместите диализный блок в 900 мл 1x стерильных PBS и диализировать на ночь при 4 градусах Цельсия. Это даст примерно 70 кЛ маркированных VWF при концентрации 0,71 мг/мл или 2,84 мкм (мономерная концентрация).
- Передача помечены VWF в микроцентрифуг трубки. Накройте трубку алюминиевой фольгой и защитите от света. Хранить при 4 градусах по Цельсию. Для длительного хранения добавьте антимикробный азид натрия до конечной концентрации 0,02% (w/v).
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
2. Подготовка ДНК Ламбда
- Биотинилат линейной ДНК лямбда, заполняя ее сплоченные конечные участки (кос-сайты) нуклеотидами биотина-14-dCTP в соответствии со стандартными протоколами, повторяемыми здесь в шаге 2.118. Заполните оставшуюся часть коссайтов с dATP, dTTP и dGTP нуклеотидов.
- Приготовьте 1 мМ растворы dATP, dTTP, dGTP и биотин-14-dCTP в 10-кратном буфере реакции (500 мМ хлорида натрия, 100 мМ Трис гидрохлорид, 100 мМ хлорид магния, 10 мМ дитиотрейтол, рН 7,9 при 25 градусах Цельсия).
- Поместите 48 л/с 500 нг/Л Л ДНК лямбда в трубку ПЦР и нагрейте в течение 5 мин при температуре 65 градусов по Цельсию. Участки круговой ДНК лямбды будут отделяться под теплом, линейно излучать молекулу и делая одноцепочечные свесы готовыми к биотиниляции. Сразу же после этого, место на льду, чтобы предотвратить cos сайтов от повторного annealing.
- Добавьте в ДНК лямбды 5 мМ dATP, dTTP и dGTP и 4 л биотин-14-dCTP. Кроме того, добавить 2,5 л 5 U / L Кленов Фрагмент (3''5' экзо-) для катализировать синтез ДНК.
- Инкубировать реакционную смесь в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия.
- Добавьте 1,2 л 0,5 М ЭДТА. Затем нагрейте реакционную смесь в течение 5 мин при температуре 70 градусов по Цельсию. Это отключит реакцию Кленова фрагмента и биотинилации.
- Удалить избыток нуклеотидов из ДНК лямбды с помощью спиновой колонки, которая может вместить 10-70 Л л и имеет 6000 молекулярного веса отсечения.
- Поместите колонну в микроцентрифугную трубку 2 мл. Центрифуга колонны и трубки при 1000 х г в течение 2 мин. Распоряжаться потоком через который собирается в трубке.
- Замените буфер столбца 1x тем же буфером реакции с шага 2.1.1. Сделайте это, добавив 500 кЛ 1x буфера к столбце. Центрифуга в течение 1 мин при 1000 х г. Утилизация потока через. Повторите эти 2 раза, так что в общей сложности 1500 Л был добавлен в столбец.
- Поместите колонну в микроцентрифугную трубку длиной 1,5 мл. Аккуратно добавьте раствор со ступени 2.1.5 к верхнему слою столбца. Центрифуга в течение 4 мин при 1000 х г.
- Соберите протока (40-70 qL) из микроцентрифуговой трубки и поместите в трубку ПЦР. Это содержит очищенную, биотиниляционную ДНК лямбды.
- Этикетка лямбда ДНК с флуоресцентным красителем YOYO-1 (возбуждениемакс 490 нм, выбросмакс 509 нм) в соответствии со стандартными протоколами, повторяется здесь в шаге 2.3.120.
- Подготовьте раствор красителя YOYO-1 и ДНК лямбды с красителя к базовой паре молярного соотношения 1:10. Предположим, что НИкакая ДНК не была потеряна в шаге очистки для расчета концентрации базовой пары ДНК лямбды. Полноразмерная ДНК лямбды имеет 48 502 базовых пары.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если 50 qL раствора был восстановлен с шага 2.2.4, добавьте 7.4 qL 500 мкм YOYO-1 красителя. - Нагрейте раствор в течение 2 ч при температуре 50 градусов в темноте, чтобы завершить реакцию.
- Накройте трубку алюминиевой фольгой и защитите от света. Хранить при 4 градусах по Цельсию. Теперь решение готово к вкачанию в микрофлюидные устройства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
- Подготовьте раствор красителя YOYO-1 и ДНК лямбды с красителя к базовой паре молярного соотношения 1:10. Предположим, что НИкакая ДНК не была потеряна в шаге очистки для расчета концентрации базовой пары ДНК лямбды. Полноразмерная ДНК лямбды имеет 48 502 базовых пары.
3. Создание микрофлюидных форм канала в кремниевой пластине
- Используйте фотолитографию для создания микрофлюидных каналов с соответствующими размерами(рисунок 2) на мастер кремниевой пластине в соответствии со стандартными протоколами19.
4. Подготовка полидиметилсилоксана (PDMS) микрофлюидного устройства
- Добавьте 5 частей силиконовой эластомерной базы к 1 части лечебного средства (по массе) в весовой лодке. Тщательно перемешайте содержимое в течение 1 мин, чтобы создать предварительно вылеченный раствор PDMS.
- Поместите мастер кремниевой пластины в пластиковую чашку Петри. Налейте раствор PDMS над вафлей, чтобы создать слой 5 мм. Накройте блюдо и оставьте в обезвращренном вакууме в течение 1 ч, чтобы удалить пузырьки воздуха.
- Инкубировать покрыты Петри блюдо на 60 градусов по Цельсию на ночь, чтобы вылечить PDMS в гибкой твердой. Лечение приведет к микрофлюидных каналов формованных в PDMS на интерфейсPDMS-вафель.
- Вырезать 20 х 10 мм прямоугольники в PDMS, вокруг каждого микрофлюидного канала, используя бритву. Удалите прямоугольные блоки PDMS с помощью пинцета.
- Используйте 25 G тупой конец иглы с заточенными краями пробить отверстие 0,5 мм в диаметре на одном конце канала, убедившись, что отверстие проходит полностью через блок PDMS (Рисунок 2). Используйте тонкую иглу, чтобы выбить PDMS из отверстия. Повторите это на другом конце канала. Это создаст входе и выход для потока через канал.
- Очистите поверхность блока PDMS с помощью виниловой ленты. Удар сжатый азотный газ над No 1 1 1 /2, 22 х 50 мм coverslip для удаления мусора.
- Поместите блок PDMS с стороной канала вверх и крышкой в камеру плазменной машины связи. Начните лечение.
- Когда лечение завершено, быстро поместите блок PDMS на крышку так, что канал находится в контакте с скольжения. Нанесите давление по краям блока. Поместите сборку coverslip-PDMS на горячую тарелку при 115 градусах по Цельсию в течение 15 минут, чтобы укрепить постоянную связь.
- Вставьте 10 см длиной, 0,25 мм внутреннего диаметра трубки в отверстие розетки в верхней части блока PDMS. Это позволяет жидкости легко вытекать из канала. Устройство завершено.
5. Лечение поверхности микрофлюидного устройства
- Инъекционный йlt;10 qL из 10 мкг/мл биоинтинилатированный альбомин сыворотки крупного рогатого скота (BSA-biotin) растворяется в стерильных 1x PBS в впуске микрофлюидного устройства для экспериментов VWF. Вводят йт;10 л 1 мг/мл BSA-биотин для экспериментов с ДНК лямбда. Удерживайте несколько микролитров BSA-биотина в наконечнике пипетки после инъекции и позвольте кончику оставаться встроенным в входе.
- Всегда держите каплю воды DI вокруг кончика. Это предотвратит попадание пузырьков воздуха в канал. Применяйте эту технику каждый раз, когда в канал вводится новое решение.
- Разрешить BSA-биотин инкубировать в устройстве в течение 2 ч. BSA будет неспецифически связываться с поверхностью крышки(рисунок 3A).
- Снимите наконечник пипетки. Введите в канал блокирующий раствор казеина и дайте ему инкубировать в течение 30 мин. Казеин будет блокировать любые свободные сайты, уменьшая неспецифические привязки биомолекул на поверхность(рисунок 3B).
- Удалите кончик и введите злит;10 л из 10 мкг/мл стрептавидина, растворенного в стерильных 1x PBS в канал для экспериментов VWF. Используйте 100 мкг/мл стрептавидина для экспериментов с ДНК лямбда. Инкубировать в течение 10 мин. Стрептавидин будет связываться с биотинами группы BSA-биотин(рисунок 3C).
- Удалите наконечник и введите злитроу;10 л раствора моющего средства 1x (0,05% Tween 20 в PBS) в канал, чтобы смыть лишний стрептавидин.
- Удалите наконечник и введите злиц;10 л либо 28,4 нм VWF разбавленного в растворе казеина или ламбда ДНК от шага 2.3.3. Инкубировать VWF в течение 3 мин. Инкубировать лимбда ДНК в течение 45 мин (Рисунок 3D).
- Снимите кончик и введите злитроу;10 л из 5 мМ свободного биотина, разбавленного в растворе казеина. Бесплатный биотин будет блокировать избыточные места связывания стрептавидина на поверхности канала(рисунок 3E).
6. Визуализация ДНК VWF и Lambda под флуоресценционную микроскопию
- Приготовьте 1 мл блокирующего раствора казеина с 2,2 мМ протокатеховой кислотой и 37 нм протокатечуатом-3,4-диоксигеназой (для минимизации фотоотбелеки). Загрузите в шприц и закрепите в шприц-насосе. Возьмите 30 см в длину, 0,25 мм внутреннего диаметра трубки и прикрепите один конец к шприц иглы. Поток в раствор, чтобы удалить пузырьки воздуха. Прикрепите другой конец трубки к входе микрофлюидного устройства. Рекомендуется делать это через 3 минуты после шага 5.6.
- Выберите наивысшую цель увеличения (т.е. 60-100X) общего внутреннего отражения (TIRF) или конфокального флуоресцентного микроскопа. Добавить каплю масла погружения на его цель, если это необходимо. Поместите микрофлюидное устройство на стадии микроскопа, чтобы coverslip заподлицо с целью.
- Начните ярко-полевую микроскопию. Отрегулируйте фокус так, чтобы все объекты, такие как мусор и пузырьки, были видны. Затем отрегулируйте сцену в направлении X и Y до тех пор, пока не будет виден край микрофлюидного канала и не разделит раму.
- Переключитесь на канал 488 (FITC). Отрегулируйте угол наклона уровня и TIRF по мере необходимости до тех пор, пока не отличить отдельные зеленые, шаровые молекулы. Это либо молекулы ДНК VWF, либо лямбда.
- Отрегулируйте время экспозиции и интенсивность лазера, чтобы визуализировать флуоресцентные молекулы без фотоотбелевания их слишком быстро. Отрегулируйте контраст, чтобы также визуализировать молекулы более четко.
- Начало потока от шприца насоса так, что casein блокирующий раствор течет в канал и из розетки. Делайте это ровно через 5 минут после шага 5.6. Остановить и начать поток, чтобы наблюдать изменения в конформации молекул. При применении потока, скорость использования между 5000 и 30000 л/ ч. Повторите это в различных областях микрофлюидного устройства. Продолжить этот процесс, чтобы найти молекулы, которые могут продлить и расслабиться на нескольких циклах остановки и начала потока.
- Обратите внимание, сколько времени требуется для молекул, чтобы достичь максимального расширения и полностью расслабиться в глобулы. Запись видео непрерывного поведения молекул под сдвига потока, выбрав лучшее время экспозиции, частота экспозиции и продолжительность видео, которые будут захватывать весь спектр расширенного поведения и свести к минимуму photobleaching.
- Сохранить видео как . Файлы AVI с шкалой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
7. Анализ изображений конформансальных изменений
- Рассчитайте скорость
сдвига стены () применяется к макромолекулы с помощью скорости потока ()и высота(ч) и ширина(w) прямоугольного микрофлюидного канала. Используйте следующее уравнение, чтобы сделать это:
- Определите длину любой биомолекулы под различными темпами сдвига с помощью индивидуального кода MATLAB (см. Дополнительные файлы). Создайте папку под названием анализ видео, которая включает в себя следующие коды MATLAB: main.m, save_each_frame.m, get_length.m. и get_length.fig. Создайте subfolder в анализе видео под названием видео и добавить . Avi файлы, которые будут проанализированы в него.
- Откройте main.m с помощью MATLAB 2019a и запустите код. Введите имя видеофайла для анализа в окне команды под введите файл данных для анализа:.
- В открытом графическом пользовательском интерфейсе (GUI) установленный порог (текст в поле в правом верхнем правом окне) до 20 и нажмите на кнопку «Набор порога» для подтверждения.
- Используйте курсор данных в верхней панели инструментов окна, чтобы выбрать один пиксель в любом месте на панели шкалы. Нажмите кнопку «Старт» в разделе бар шкалы справа от окна. Положение выбранного пикселя (x,y) будет отображаться справа от кнопки. Нажмите на кнопку Pixel размер (мкм) кнопку. Размер пикселя должен измеряться только один раз в каждом видео.
- Выберите любой пиксель на молекуле интереса. Нажмите на стартовую точку в разделе VWF. После того, как положение выбранного пикселя появится на текстовом поле справа, нажмите на левый конец, правый конец и длину строки, чтобы получить молекулярную длину в изображении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть использован для анализа конформационных изменений любой биомолекулы, несмотря на код, имеющий определенный раздел под названием VWF. - Дважды проверьте левый и правый конец молекулы. Увеличьте и используйте курсор данных, чтобы проверить положение пикселей, представляющий интерес. Вручную выберите пиксель в качестве конца и пересчитать длину (в пикселях) при необходимости.
- Запишите размер пикселя в мкм и длину строки в пикселе в листе Excel и вычислите длину строки в мкм.
- Повторите вышедля шаги для каждого изображения. Используйте Кнопку Last, Следующая в правом нижнем углу графического интерфейса, чтобы переключаться между изображениями в том же видеофайле. Нажмите на Близко, чтобы закрыть окно ГРАФИЧЕСКОго интерфейса.
сдвига стены () применяется к макромолекулы с помощью скорости потока ()и высота(ч) и ширина(w) прямоугольного микрофлюидного канала. Используйте следующее уравнение, чтобы сделать это:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наблюдение за динамическим поведением биомолекул, таких как VWF и лямбда ДНК в большой степени зависит от оптимизации их связывания с поверхностью устройства. Инкубирование поверхностных процедур для рекомендуемого времени в микрофлюидном устройстве имеет решающее значение для получения связывания с несколькими точками крепления, так что молекулы могут свободно расширяться и расслабляться при изменении потока. Если белки или ДНК связаны слишком сильно с несколькими связями, они будут либо распространяться на ограниченную длину или не распространяться на всех. Это происходит, в частности, с VWF, когда он остается без потока на поверхности устройства в течение более 3 минут до свободного блокирования биотин. Чем дольше VWF остается на поверхности застойной, тем больше групп VWF биотин связываются с поверхностными группами стрептавидина и тем меньше гибкости молекула должна распутать. Если молекулы связаны слишком слабо, с другой стороны, они будут отделяться от потока и исчезают из поля зрения. Это может произойти, если VWF или лямбда ДНК инкубируется в течение слишком коротких периодов, в результате чего слишком мало взаимодействия биотина-стрептавидина в форме. Молекулы могут также вырваться на свободу, когда применяются чрезвычайно высокие скорости сдвига (200 000 с-1),ослабляя взаимодействия биотина-стрептавидина.
Идеальная молекула связывается до такой степени, что она может распутать и расслабиться на нескольких циклах остановки и начала потока. Гибкость молекулы для изменения конформации, как это часто демонстрируется его способность распространяться на увеличение длины, как более высокие темпы сдвига применяются в диапазоне увеличения потока. Изображения VWF, полученные с помощью микроскопии TIRF, демонстрируют эту связь в видео 1. Кривая скорости расширения против сдвига этой же молекулы VWF на рисунке 4 точно фиксирует поведение молекулы VWF, индуцированную сдвига, и полезна для характеристики биомеханических свойств белка. Изображения ЛУмбда ДНК, полученные с конфокальной флуоресценции микроскопии аналогичным образом показывают увеличение на более высокие темпы сдвига и постепенное расслабление более 2 мин, как это записано в видео 2 и видео 3. Отскакивая характеристики ДНК лямбды после остановки потока также графически представлены на рисунке 5.
Рисунок 1: Схема одномолекулярного эксперимента потока в микрофлюидном канале под флуоресценцией микроскопии. Поверхность канала покрыта BSA-биотином и блокируется казеином. Стрептавидин связан с биотином на поверхности канала, а также биотинилапосированной ДНК VWF/lambda для обездвиживания отдельных молекул на поверхности. По мере увеличения скорости сдвига от А до Смолекула растягивается от сложенного состояния до удлиненого состояния вдоль направления потока слева направо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Размеры микрофлюидного канала. Форма и структура микрофлюидного устройства PDMS показаны вместе с размерами канала. Высота канала составляет 50 мкм, ширина - от 0,1 до 1,0 мм. Длина сужения посередине канала составляет 0,7 мм. Диаметр входе и розетки составляет 0,5144 мм (25 Г). Направление потока слева направо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Поверхностные этапы лечения одномолекулярной иммобилизации. Все шаги происходят при комнатной температуре. (A). BSA-биотин покрыт на поверхности в течение 2 ч. (B). Казеин вводится в канал в течение 30 минут, чтобы заблокировать поверхность. (C). Стрептавидин инкубируется в канале в течение 10 минут, чтобы связать с BSA-биотин. (D). После смывания избыточных молекул в прежних шагах, фторофор и биотин помечены VWF / лямбда ДНК вводится в канал и обездвижены через связь со стрептавидином. (E). Свободный биотин течет в, блокируя дополнительные места связывания стрептавидина, чтобы свести к минимуму его помехи с молекулой во время конформационных изменений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Расширенное поведение VWF при потоке сдвига. Молекула обратимо распутывается на 7 различных коэффициентах сдвига: 0 s-1, 33,333 s-1, 66,667 s-1, 100,000 s-1, 133,333 s-1, 166,667 s-1 и 200,000 s-1. Длина растянутой молекулы увеличивается с 0,52 мкм при нулевой скорости сдвига до 3,44 мкм при скорости 200 000спой-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Расслабленное поведение ДНК лямбды после остановки потока сдвига. Поток с 33000 s-1 и 66,667 s-1 сдвига ставки применяются от 0 до 30 с той же молекулы. Расслабление фиксируется от 30 с до 150 с. При частоте сдвига 66 667 с-1 молекула ДНК удлиняется до 15,00 мкм и расслабляется до 5,83 мкм после того, как поток был остановлен в течение 2 минут. При скорости сдвига 33 333 с-1 молекула простирается только до 8,75 мкм и составляет 3,33 мкм в длину после 2 минут релаксации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Видео 1: Обратимое распутывание VWF при увеличении сдвига с использованием общей внутренней флуоресценции отражения (TIRF) микроскопии. Молекула в середине зрения обратимо распутывает на различную длину при сдвигах 33,333 s-1, 66,667 s-1, 100,000 s-1 и 133,333 s-1. Шприц насос используется для управления скоростью потока, из которых скорость сдвига рассчитываются. Направление потока слева направо. Изображения принимаются с интервалом 15 с, чтобы обеспечить полное расслабление и процессы расширения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Видео 2: Расслабление ДНК лямбды после 33,333 s-1 скорость сдвига. Изображения принимаются под конфокальной флуоресценцией микроскопии. ДНК Lambda растягивается под потоком сдвига 33 333 с-1 и расслаблена обратно в сложенное состояние после того, как поток останавливается на 30 с. Длительность релаксации составляет 2 мин. Направление потока находится слева направо. Изображения принимаются с интервалом 30 с между ними. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Видео 3: Расслабление ЛУМБ ДНК после 66 667 s-1 скорость сдвига. Настройки идентичны тем, что есть в Video 2, за исключением начальной скорости сдвига. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Дополнительные файлы: коды MATLAB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для получения высококачественных данных одномолекулярных конформационных изменений с помощью флуоресценционной микроскопии, описанной в этом методе, очень важно инкубировать молекулу в течение соответствующего количества времени, минимизировать ее неспецифические взаимодействия с поверхностью и установить настройки микроскопа, которые уменьшают фотоотбеление. Способность молекулы свободно изменять конформацию связана с количеством взаимодействия биотина-стрептавидина, образовавшихся между молекулой и поверхностью. Как упоминалось ранее, это должно контролироваться путем инкубации молекулы без потока в течение соответствующего количества времени. Кроме того, белок или ДНК могут непривязываться к крышке, если крышка не заблокирована эффективно. Без рекомендуемого блокирующего раствора молекулы могут прикрепляться к стеклу неспецифически и не реагировать на любой приложенной скорости потока. Применение блока казеина во время ранней обработки поверхности и поддержание его присутствия во время потока имеет важное значение для уменьшения этих неспецифических взаимодействий. Наконец, захват непрерывного, динамичного поведения одной молекулы требует частого флюорофорного возбуждения во время захвата изображения. Это может привести к быстрому отбеливанию, если интенсивность лазера, время экспозиции и частота экспозиции слишком высоки. Поэтому необходимо настроить эти параметры в тандеме и выработать стратегию снижения их значений без ущерба для разрешения времени или изображения данных.
Если расширение и расслабление молекулы не наблюдается, следует предпринять дополнительные шаги. Инкубировать молекулу в устройстве дольше и короче, чем то, что рекомендуется в протоколе. Для каждого времени, которое проверяется, варьировать СЯ-биотин и стрептавидин концентрации по факторам 10. Эти тесты могут быть необходимы для оптимизации количества биотино-стрептавидиновых якорных точек, образуются между молекулой и поверхностью. Например, если плотность маркировки биотина очень высока, из-за отклонений от рекомендуемых концентраций или реагентов в протоколе маркировки может потребоваться более короткое время молекулярной инкубации и более низкие концентрации BSA-биотина и стрептавидина. Для дальнейшего улучшения успеха эксперимента, сканировать все микрофлюиды устройства для молекул, которые обратимо распутать. Поверхность не может рассматриваться равномерно с стрептавидином или корпусеин блок, в результате чего молекулы в некоторых областях, чтобы иметь больше распутывания ответов, чем другие.
Этот метод ограничен отсутствием информации о размере и точках привязывания молекулы, сложности в производстве 0 s-1 скорость сдвига и оптическое разрешение флуоресцентных микроскопов. Предыдущая работа показала большую вариацию в распутывающем поведении VWF, потенциально объясненные широким распределением в количестве и расположении точек биотина-стрептавидина и молекулярного веса каждой молекулы VWF18. На данный момент метод, который мы представляем, не может определить точки троса и молекулярный размер. Тем не менее, брауновская динамика моделирования грубозернистые модели VWF опубликованы Ван и др. включить эти переменные и может быть запущен вместе с экспериментальными выводами, чтобы объяснить такие изменения18. Кроме того, поток не останавливается мгновенно, когда шприц насос остановлен, путая наблюдения откатдинамики динамики. Это связано с деформацией и небольшим расширением канала PDMS в течение предполагаемого периода потока. Когда насос остановлен, жидкость продолжает течь до тех пор, пока PDMS полностью расслаблен. Улучшенная система должна использовать более жесткие PDMS или микроканалы, изготовленные из твердых пластиковых материалов, что позволяет жидкости достичь 0 с-1 скорость сдвига быстрее. Наконец, можно только решить молекулы, размер которых находится на том же порядке величины, как оптическое разрешение флуоресцентного микроскопа, который может быть не меньше, чем несколько сотен нанометров. Таким образом, существует требование минимального размера для молекул, которые могут непосредственно наблюдаться с помощью этого метода.
Текущий протокол касается главным образом количественной оценки конформационных изменений белков и молекул ДНК при физиологическом потоке. Тем не менее, метод также может быть использован для визуализации взаимодействия в реальном времени между биологическими молекулами и дальнейшей характеристики белка и функции ДНК. Например, Fu et al. показали, что привязанный VWF может активироваться при высоком потоке сдвига и далее захватывать молекулу сагеции тромбоцитов GPIb при различных условиях потока17. Это связывающее событие сохраняется даже тогда, когда VWF связан на поверхность связями биотин-стрептавидина, демонстрируя эффективность этого протокола для изучения физиологически значимых функций и механики17. Аналогичные механистические идеи могут быть получены при изучении взаимодействия между разгаданной ДНК и нормативных белков в среде потока21,22. Кроме того, наш метод относится в основном к наблюдению конформационных изменений в макромолекулах. Тем не менее, можно было бы адаптировать его с целью изучения небольших молекул, которые достаточно велики, чтобы быть решены под флуоресценцией микроскопии. Например, нековалентно или ковалентно прикрепляя небольшую молекулу к гораздо большей, обездвиженной ДНК лямбды, можно было бы увеличить чувствительность сдвига меньшей молекулы и легче наблюдать за ее поведением. В заключение, другие методы одномолекулярной характеристики, такие как AFM или оптические пинцеты, предоставляют данные высокого разрешения о структурных и функциональных свойствах макромолекул; однако, эти альтернативные методы не могут наблюдать динамические, конформационные изменения белков и ДНК, которые происходят в физиологической среде потока, как это представлено в этом протоколе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана Грантом Национального научного фонда DMS-1463234, Национальными институтами здравоохранения, грантами HL082808 и AI133634, а также внутренним финансированием Университета Лихай.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
References
- Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
- Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
- LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
- Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
- Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
- Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
- Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
- Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
- Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
- Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
- Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).
- Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
