Summary
Vi presenterar ett protokoll för att immobilisera enskilda makromolekyler i mikrofluidiska enheter och kvantifiera förändringar i deras konformationer under skjuvningsflöde. Detta protokoll är användbart för att karakterisera biomekaniska och funktionella egenskaper biomolekyler såsom proteiner och DNA i en flödesmiljö.
Abstract
Enmolekylsbeteende under mekanisk störning har karakteriserats brett för att förstå många biologiska processer. Metoder som atomkraftmikroskopi har dock begränsad tidsupplösning, medan Förster resonansenergiöverföring (FRET) endast gör det möjligt att dra slutsatsen att konformationer härleds. Fluorescensmikroskopi, å andra sidan, möjliggör realtidsinsitu visualisering av enstaka molekyler i olika flödesförhållanden. Vårt protokoll beskriver stegen för att fånga konformationella förändringar av enskilda biomolekyler under olika skjuvflödesmiljöer med fluorescensmikroskopi. Skjuvflödet skapas inuti mikrofluidiska kanaler och styrs av en sprutpump. Som demonstrationer av metoden, von Willebrand faktor (VWF) och lambda DNA är märkta med biotin och fluorofor och sedan immobiliseras på kanalytan. Deras konformationer övervakas kontinuerligt under variabelsk skjuvningsflöde med hjälp av total inre reflektion (TIRF) och konfokal fluorescensmikroskopi. Den reversibla unraveling dynamikVWF är användbara för att förstå hur dess funktion regleras i mänskligt blod, medan konformationen av lambda DNA ger insikter i biofysik makromolekyler. Protokollet kan också tillämpas i stor utsträckning för att studera polymerernas beteende, särskilt biopolymerer, i varierande flödesförhållanden och undersöka reologi av komplexa vätskor.
Introduction
Mekanismer för hur biomolekyler reagerar på miljöstimuli har studerats brett. I en flödesmiljö i synnerhet reglerar skjuvning och långsträckningskrafter konformationsförändringarna och potentiellt biomolekylernas funktion. Typiska exempel är skjuvning-inducerad upplösning av lambda DNA och von Willebrand faktor (VWF). Lambda DNA har använts som ett verktyg för att förstå konformationsdynamiken hos enskilda, flexibla polymerkedjor och reologi av polymerlösningar1,2,3,4. VWF är en naturlig flödessensor som aggregerar blodplättar på sårplatser av blodkärl med onormal skjuvning och flödesmönster. Reda ut VWF är viktigt för att aktivera bindningen av blodplättar till A1-domänen och kollagenbindning till A3-domänen. Dessutom tillåter hög skjuvning-inducerad A2 domän utspelar sig klyvning av VWF, som reglerar dess molekylära viktfördelning i omlopp5,6. Således kan direkt visualisering av hur dessa molekyler bete sig under flöde avsevärt förbättra vår grundläggande förståelse för deras biomekanik och funktion, vilket i sin tur kan möjliggöra nya diagnostiska och terapeutiska tillämpningar.
Typiska metoder för att karakterisera enmolekylkonformationer inkluderar optiska/magnetiska pincett, atomkraftmikroskopi (AFM) och enmolekyl Förster resonans energiöverföring (FRET)7. Enmolekylkraftspektroskopi är ett kraftfullt verktyg för att undersöka kraften och rörelsen i samband med de konformationella förändringarna av biomolekyler. Den saknar dock förmågan att kartlägga övergripande molekylära konformationer8. AFM kan avbildning med hög rumslig upplösning men är begränsad i tidsupplösning9,10. Dessutom kan kontakten mellan spetsen och provet förvirra svaret som induceras av flöde. Andra metoder som FRET och nanopore analytics bestämma enmolekyl protein vikning och utfällbara tillstånd baserat på detektion av intramolekylära avstånd och uteslutna volymer. Dessa metoder är dock fortfarande i sin linda och begränsad i sin direkta observation av enmolekylkonformationer11,12,13,14.
Å andra sidan har direkt observera makromolekyler med hög tidsmässig och rumslig upplösning under fluorescensmikroskopi förbättrat vår förståelse av enmolekyldynamik i många biologiska processer15,16. Till exempel, Fu et al. nyligen uppnått samtidig visualisering av VWF förlängning och trombocytreceptorbindning för första gången. I sitt arbete, VWF molekyler var immobiliserade på ytan av en mikrofluidisk kanal genom biotin-streptavidin interaktioner och avbilds under total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi vid varierande skjuvning flöde miljöer17. Tillämpa en liknande metod som Fu's, visar vi här att konformationer av VWF och lambda DNA kan observeras direkt under både TIRF och confocal fluorescens mikroskopi. Som visas i figur 1används mikrofluidiska enheter för att skapa och kontrollera skjuvningsflödet, och biomolekyler na immobiliseras på kanalytan. Vid applicering av varierande skjuvningsfrekvens registreras konformationer av samma molekyl för att mäta förlängningslängden, som också visas i figur 1. Metoden kan användas i stor utsträckning för att utforska andra polymerbeteenden under komplexa flödesmiljöer för både reologiska och biologiska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda VWF
- Rekonstituera human plasma VWF för att förbereda den för märkning reaktioner. Tillsätt 100 μL avjoniserat vatten (DI) vatten till 100 μg frystorkad VWF för att skapa en 1 mg/ml VWF-stamlösning.
- Dialyze VWF stamlösning för att ta bort överskott glycin, vilket ökar biotin och fluorofor märkning effektivitet.
- Överför 50 μl VWF-stamlösning till en 0,1 ml dialysenhet med en 10 000 molekylviktsavstängning och tätning med lock. Förvara den återstående lagerlösningen vid -20 °C. VWF-aktien kommer att vara stabil i upp till 1 år vid -20 °C.
- Kör dialys i 500 ml 1x steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (0,01 M dinatriumfosfat, 0,0018 monokaliumfosfat, 0,0027 M kaliumklorid, 0,137 M natriumklorid, pH 7,4 vid 25 °C) i 1 h vid 4 °C med långsam omrörning. Upprepa dialys i ytterligare en timme med 500 ml färsk PBS.
- Starta biotinmärkningsreaktion. Förbered en 2 mM-lösningav NHS-PEG 4-biotin genom att lösa upp fast substansen i DI-vatten omedelbart före reaktionen. Att låtaNHS-PEG 4-biotin kvarstå i vatten under längre tid kommer att orsaka NHS-ester-gruppen att hydrolysera, vilket minskar märkningens effektivitet.
- Tillsätt 2,5 μL 2 mMNHS-PEG 4-biotin till dialysenheten som innehåller VWF-stamlösningen. Detta kommer att resultera i en 20-faldig molar överskott av biotin jämfört med VWF monomerer. Primära aminer vwf kommer att reagera med NHS-ester grupper,vilket kovalent bindande för PEG 4-biotin grupper via amide kopplingar.
- Placera dialysenheten inuti ett mikrocentrifugrör på 1,5 ml. Försegla dialysenheten med motsvarande lock. Fäst rördialysenheten med Parafilm. Håll upprätt och låt stå i rumstemperatur i 40 min.
- Starta fluoroformärkningsreaktion. Förbered en 2,8 mM lösning av Alexa 488 tetrafluorofenylester (TFP-ester) fluorescerande färgämne (excitationmax = 498 nm,emissionsmax = 519 nm) genom att lösa upp fluoroforfast i DI vatten. Gör detta omedelbart före reaktionen för att förhindra att TFP-ester-gruppen hydrolyseras.
- Tillsätt 2,9 μL av 2,8 mM 488 fluorofore till dialysenheten. Detta kommer att resultera i en 34-faldig molar överskott av fluorofor jämfört med VWF monomerer. Återstående primära aminer VWF kommer att reagera med TFP-ester grupper, vilket kovalent bindande för fluoroforer via amide kopplingar.
- Tillsätt 2,0 μL 1 M natriumbikarbonat (löst i DI-vatten) till dialysenhet. Detta justerar pH-reaktionennärmare 8,0, vilket ökar effektiviteten hos TFP-ester och primär aminreaktion.
- Säkra dialysenheten i ett mikrocentrifugrör precis som i steg 1.3.2. Förvaras i mörker för att förhindra ljusblekning och låt stå i rumstemperatur i 1 h och 30 min.
- Placera dialysenheten i 900 ml 1x steril PBS och dialyze över natten vid 4 °C. Detta kommer att ge cirka 70 μl märkt VWF i en koncentration av 0,71 mg/ml eller 2,84 μM (monomerkoncentration).
- Överför märkt VWF i ett mikrocentrifugrör. Täck röret med aluminiumfolie och skydda mot ljus. Förvaras vid 4 °C. För långtidslagring, tillsätt antimikrobiella medel natriumazid till en slutlig koncentration på 0,02% (w/ v).
Protokollet kan pausas här.
2. Förbereda Lambda DNA
- Biotinylate linjär lambda DNA genom att fylla sina sammanhållna slutplatser (cos platser) med biotin-14-dCTP nukleotider enligt standardprotokoll, upprepas här i steg 2.118. Fyll i resten av cos platser med dATP, dTTP och dGTP nukleotider.
- Förbered 1 mM lösningar av dATP, dTTP, dGTP och biotin-14-dCTP i en 10x reaktionsbuffert (500 mM natriumklorid, 100 mM Tris hydroklorid, 100 mM magnesiumklorid, 10 mM ditiotiotretitol, pH 7.9 vid 25 °C).
- Placera 48 μL 500 ng/μL lambda DNA i ett PCR-rör och värm i 5 min vid 65 °C. Cos platser cirkulärlambda DNA kommer att separera under värme, linearisera molekylen och göra enkelsträngade överhäng redo för biotinylation. Omedelbart efter, placera på isför att förhindra cos platser från re-glödgning.
- Tillsätt 5 μL 1 mM dATP, dTTP och dGTP och 4 μL 1 mM biotin-14-dCTP till lambda DNA. Lägg också till 2,5 μL 5 U/μL Klenow Fragment (3'à5' exo-) för att katalysera DNA-syntesen.
- Inkubera reaktionsblandningen i 1 h vid 37 °C.
- Tillsätt 1,2 μL på 0,5 M EDTA. Värm sedan reaktionsblandningen i 5 min vid 70 °C. Detta kommer att avaktivera Klenow Fragment och biotinylation reaktion.
- Ta bort överflödiga nukleotider från lambda DNA med hjälp av en spin kolumn som rymmer 10-70 μL och har en 6.000 molekylär vikt cut-off.
- Placera kolonnen i ett 2 ml mikrocentrifugrör. Centrifugkolonnen och röret vid 1000 x g i 2 min. Kassera genomströmning som samlas i röret.
- Ersätt kolumnbufferten med en 1x-lösning av samma reaktionsbuffert från steg 2.1.1. Gör detta genom att lägga till 500 μl 1x buffert i kolumnen. Centrifug i 1 min vid 1000 x g. Kassera genomströmningen. Upprepa dessa 2 gånger så att totalt 1500 μL har lagts till i kolumnen.
- Placera kolonnen i ett mikrocentrifugrör på 1,5 ml. Lägg försiktigt till lösningen från steg 2.1.5 till kolumnlagrets översta lager. Centrifug i 4 min vid 1000 x g.
- Samla in genomströmningen (40-70 μL) från mikrocentrifugröret och placera i ett PCR-rör. Detta innehåller renade, biotinylated lambda DNA.
- Etikett lambda DNA med fluorescerande YOYO-1 färgämne (excitationmax = 490 nm, utsläppmax = 509 nm) enligt standardprotokoll, upprepas här i steg 2.3.120.
- Förbered en lösning av YOYO-1 färgämne och lambda DNA med ett färgämne till baspar molar förhållandet 1:10. Anta att inget DNA gick förlorat i reningssteget för att beräkna basparkoncentrationen av lambda DNA. Fullängds lambda DNA har 48.502 baspar.
OBS: Om 50 μl lösning återfanns från steg 2.2.4, tillsätt till 7,4 μL 500 μM YOYO-1 färgämne. - Värm lösningen i 2 h vid 50 °C i mörkret för att slutföra reaktionen.
- Täck röret med aluminiumfolie och skydda mot ljus. Förvaras vid 4 °C. Lösningen är nu klar att injiceras i mikrofluidiska enheter.
Protokollet kan pausas här.
- Förbered en lösning av YOYO-1 färgämne och lambda DNA med ett färgämne till baspar molar förhållandet 1:10. Anta att inget DNA gick förlorat i reningssteget för att beräkna basparkoncentrationen av lambda DNA. Fullängds lambda DNA har 48.502 baspar.
3. Skapa mikrofluidiska kanal formar i kisel wafer
- Använd fotolitografi för att skapa mikrofluidiska kanaler med lämpliga dimensioner (figur 2) på en huvudkiselwafer enligt standardprotokollen19.
4. Beredning av polydimetylsiloxan (PDMS) mikrofluidisk anordning
- Tillsätt 5 delar silikon elastomer bas till 1 del härdning smedlet (i massa) i en vägbåt. Rör om innehållet noggrant i 1 min för att skapa förhärdad PDMS-lösning.
- Placera befälhavaren kisel wafer i en plast Petri skålen. Häll PDMS-lösningen över rånet för att skapa ett 5 mm lager. Täck skålen och lämna i en torkare under vakuum i 1 h för att ta bort luftbubblor.
- Inkubera täckt Petri skålen vid 60 ° C över natten för att bota PDMS i en flexibel fast. Härdning kommer att resultera i mikrofluidiska kanaler gjutna i PDMS vid PDMS-wafer gränssnittet.
- Skär 20 x 10 mm rektanglar i PDMS, runt varje mikrofluidisk kanal, med hjälp av en rakhyvel. Ta bort rektangulära PDMS block med pincett.
- Använd en 25 G trubbig ändnål med slipade kanter för att stansa ett hål 0,5 mm i diameter i ena änden av kanalen, se till att hålet går helt genom PDMS-blocket (figur 2). Använd en tunn nål för att stansa ut PDMS från hålet. Upprepa detta i andra änden av kanalen. Detta skapar ett inlopp och utlopp för flöde genom kanalen.
- Rengör ytan på PDMS-blocket med vinylrenrumtejp. Blås komprimerad kvävegas över ett nr 1 1/2, 22 x 50 mm täckglas för att avlägsna skräp.
- Placera PDMS-blocket med kanalsidan uppåt och täcksen i kammaren på en plasmabindningsmaskin. Starta behandlingen.
- När behandlingen är klar placerar du snabbt PDMS-blocket på ett täckglas så att kanalen är i kontakt med glidningen. Tryck längs kanterna på blocket. Placera täckglas-PDMS-enheten på en kokplatta vid 115 °C i 15 min för att förstärka den permanenta bindningen.
- Sätt i 10 cm långa, 0,25 mm innerdiameterslangar i utloppshålet högst upp på PDMS-blocket. Detta gör det möjligt för vätska att enkelt rinna ut ur kanalen. Enheten är nu klar.
5. Behandling av ytan av mikrofluidisk anordning
- Injicera <10 μL på 10 μg/ml biotinylated bovint serumalbumin (BSA-biotin) löst i sterila 1x PBS i inloppet av mikrofluidisk anordning för VWF-experiment. Injicera <10 μL 1 mg/ml BSA-biotin för lambda-DNA-experiment. Undanhålla några mikroliter BSA-biotin i pipettspetsen efter injektion och låt spetsen förbli inbäddad i inloppet.
- Förvara alltid en droppe DI vatten runt spetsen. Detta förhindrar att luftbubblor kommer in i kanalen. Applicera denna teknik varje gång en ny lösning injiceras i kanalen.
- Låt BSA-biotin inkubera i enheten i 2 timmar. BSA binder icke-specifikt till täckglasytan(figur 3A).
- Ta bort pipettspetsen. Injicera <10 μL kaseinblockerande lösning i kanalen och låt den inkubera i 30 min. Kaseinet blockerar alla fria platser, vilket minskar icke-specifik bindning av biomolekyler till ytan (figur 3B).
- Ta bort spetsen och injicera <10 μL på 10 μg/ml streptavidin löst i steril1x PBS i kanalen för VWF-experiment. Använd 100 μg/ml streptavidin för lambda DNA-experiment. Inkubera i 10 min. Streptavidinbinder till biotingrupperna i BSA-biotin (figur 3C).
- Ta bort spetsen och injicera <10 μL 1x tvättmedelslösning (0,05% Tween 20 i PBS) i kanalen för att tvätta bort överflödigstreptavidin.
- Ta bort spetsen och injicera <10 μL på antingen 28,4 nM VWF utspädd i kaseinlösning eller lambda DNA från steg 2.3.3. Inkubera VWF i 3 min. Inkubat lambda DNA i 45 min (figur 3D).
- Ta bort spetsen och injicera <10 μL 5 mM fri biotin utspädd i kaseinlösning. Fri biotin blockerar överflödiga streptavidinbindningsställen på kanalytan (figur 3E).
6. Visualisera VWF och Lambda DNA under fluorescensmikroskopi
- Förbered 1 ml kaseinblockerande lösning med 2,2 mM protocatechuinsyra och 37 nM protocatechuate-3,4-dioxygenas (för att minimera photobleaching). Lasta i en spruta och säkra i en sprutpump. Ta 30 cm lång, 0,25 mm innerdiameter slang och fäst ena änden till sprutnålen. Flöde i lösningen för att avlägsna luftbubblor. Fäst den andra änden av röret på inloppet av den mikrofluidiska enheten. Det rekommenderas att göra detta 3 minuter efter steg 5.6.
- Välj det högsta förstoringsmålet (dvs. 60-100X) för en total intern reflektion (TIRF) eller konfokalfluorescensmikroskop. Tillsätt en droppe nedsänkning olja på sitt mål om det behövs. Placera den mikrofluidiska enheten på mikroskopstadiet så att täckglasen är i linje med målet.
- Starta brightfield mikroskopi. Justera fokus så att alla funktioner, som skräp och bubblor, är synliga. Justera sedan scenen i X- och Y-riktningen tills kanten av den mikrofluidiska kanalen är synlig och faserar ramen.
- Växla till 488-kanalen (FITC). Justera Z-nivå och TIRF vinkel efter behov tills enskilda gröna, klotformiga molekyler kan särskiljas. Dessa är antingen VWF eller Lambda DNA-molekyler.
- Justera exponeringstiden och laserintensiteten för att visualisera fluorescerande molekyler utan att bleka dem för snabbt. Justera kontrasten till även visualisera molekyler tydligare.
- Starta flödet från sprutpumpen så att kaseinblockerande lösning flyter in i kanalen och ut ur vägguttaget. Gör detta exakt 5 minuter efter steg 5.6. Stoppa och starta flöde för att observera förändringarna i konformationen av molekyler. Upprepa detta i olika områden av mikrofluidisk anordning vid användning av flöde. Fortsätt denna process för att hitta molekyler som kan sträcka sig och slappna av på flera cykler av stopp och startflöde.
- Notera hur lång tid det tar för molekyler att nå maximal förlängning och helt koppla av i globules. Spela in videor av det kontinuerliga beteendet hos molekyler under skjuvflöde, välja den bästa exponeringstiden, exponeringsfrekvensen och videovaraktigheten som kommer att fånga hela skalan av förlängningsbeteende och minimera fotoblekning.
- Spara videorna som . AVI-filer med en skalbar.
Protokollet kan pausas här.
7. Bildanalys av konformationsförändringar
- Beräkna
väggskjuvningshastigheten ( ) som appliceras på makromolekyler med hjälp av flödeshastigheten (Q) och höjden (h) och bredden (w) på den rektangulära mikrofluidiska kanalen. Använd följande ekvation för att göra det:
- Bestäm längden på alla biomolekyler under olika skjuvfrekvenser med hjälp av en anpassad MATLAB-kod (se Kompletterande filer). Skapa en mapp med titeln videor analys som innehåller följande MATLAB koder: main.m, save_each_frame.m, get_length.m och get_length.fig. Skapa en undermapp i videoranalys med titeln videor och lägg till . AVI-filer som ska analyseras i den.
- Öppna main.m med MATLAB 2019a och kör koden. Skriv in namnet på den videofil som ska analyseras i kommandofönstret under Ange datafilen för att analysera:.
- I det öppnade grafiska användargränssnittet (GUI) anger du tröskelvärdet (text i rutan längst upp till höger i fönstret) till 20 och klicka på knappen Ange tröskelvärde för att bekräfta.
- Använd datamarkören i fönstrets övre verktygsfält för att välja en pixel var som helst i skalstrecket. Klicka på Startpunkt i avsnittet Skalbar till höger i fönstret. Den valda pixelns (x,y)-position visas till höger om knappen. Klicka på knappen Pixelstorlek (μm). Pixelstorleken behöver bara mätas en gång i varje video.
- Välj vilken pixel som helst på molekylen av intresse. Klicka på Startpunkten i VWF-avsnittet. När positionen för den valda pixeln visas i textrutan till höger klickar du på Vänster ände, Höger ände och Stränglängd för att få den molekylära längden i bilden.
OBS: Detta steg kan användas för att analysera konformationella förändringar av någon biomolekyl, trots att koden har ett specifikt avsnitt som heter VWF. - Dubbelkolla molekylens vänstra och högra ände. Zooma in och använd datamarkören för att kontrollera pixelpositionen sã¤tt. Välj pixeln manuellt som en ände och beräkna om längden (i bildpunkter) vid behov.
- Spela in pixelstorleken i μm och stränglängd i pixelnummer i ett Excel-ark och beräkna stränglängden i μm.
- Upprepa stegen ovan för varje bild. Använd Senaste, Nästa knapp i det nedre högra hörnet av GUI för att växla mellan bilder i samma videofil. Klicka på Stäng för att stänga GUI-fönstret.
väggskjuvningshastigheten ( ) som appliceras på makromolekyler med hjälp av flödeshastigheten (Q) och höjden (h) och bredden (w) på den rektangulära mikrofluidiska kanalen. Använd följande ekvation för att göra det:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Observera det dynamiska beteendet hos biomolekyler som VWF och lambda DNA är starkt beroende av att optimera deras bindning till enhetens yta. Att inkubera ytbehandlingar för de rekommenderade tiderna i den mikrofluidiska enheten är avgörande för att få bindning med några förankringspunkter, så att molekyler na fritt kan sträcka sig och slappna av vid förändrade flöde. Om proteinerna eller DNA är bundna för starkt med flera kopplingar, kommer de antingen att sträcka sig till begränsade längder eller inte förlänga alls. Detta inträffar särskilt med VWF när det förblir utan flöde på enhetens yta i mer än 3 min före fri biotinblockering. Ju längre VWF kvar på ytan stillastående, desto mer VWF biotin grupper binda till ytan streptavidin grupper och desto mindre flexibilitet molekylen har att riva upp. Om molekyler är bundna för svagt, å andra sidan, kommer de att lossna på flödet och försvinna ur sikte. Detta kan inträffa om VWF eller lambda DNA inkuberas för kort perioder, vilket orsakar för få biotin-streptavidin interaktioner bildas. Molekyler kan också bryta sig loss när extremt höga skjuvningshastigheter (>200 000 s-1) appliceras, försvagabiotin-streptavidininteraktioner.
En idealisk molekyl binder i en sådan utsträckning att den kan nysta upp och slappna av vid flera cykler av stopp och startflöde. Flexibiliteten hos en molekyl för att ändra konformation som denna framgår ofta av dess förmåga att utvidga till ökande längder som högre skjuvning priser tillämpas inom en rad ökande flöde. Bilder av VWF som erhållits med TIRF mikroskopi visar detta förhållande i Video 1. Förlängningen kontra skjuvning hastighet kurva av samma VWF molekyl i figur 4 fångar exakt skjuvning-inducerad beteende av en VWF molekyl och är användbarför att karakterisera de biomekaniska egenskaperna hos proteinet. Bilder av lambda DNA som erhållits med confocal fluorescens mikroskopi på samma sätt visar ökad förlängning på högre skjuvning priser och gradvis avkoppling över 2 min, som fångas i Video 2 och Video 3. Rekylegenskaperna hos lambda DNA efter stoppat flöde är också grafiskt representerade i figur 5.
Figur 1: Scheman för flödesexperiment med en molekyl i mikrofluidisk kanal under fluorescensmikroskopi. Kanalytan är belagd med BSA-biotin och blockeras med kasein. Streptavidin är bunden med biotin på kanalytan och även biotinylated VWF/lambda DNA för att immobilisera enstaka molekyler på ytan. När skjuvningshastigheten ökar från A till Csträcks molekylen från ett vikt tillstånd till ett avlångt tillstånd längs flödesriktningen från vänster till höger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mikrofluidisk kanaldimensioner. Pdms mikrofluidiska enhetens form och struktur visas tillsammans med kanaldimensionerna. Kanalen är 50 μm i höjd och varierar från 0,1 till 1,0 mm i bredd. Den minskande regionen i mitten av kanalen är 0,7 mm lång. Inloppet och utloppet är 0,5144 mm (25 G) i diameter. Flödesriktningen är från vänster till höger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Steg för ytbehandling för enmolekylsimmobilisering. Alla steg sker vid rumstemperatur. (A).BSA-biotin är belagd på ytan i 2 h. (B). Kasein injiceras i kanalen i 30 min för att blockera ytan. Streptavidin inkuberas i kanalen i 10 min för att binda med BSA-biotin. (D). Efter att ha tvättat bort överflödiga molekyler i de tidigare stegen injiceras fluorofore och biotin märkt VWF/lambda DNA i kanalen och immobiliseras genom bindning med streptavidin. (E). Fritt biotin flödas in, blockerar extra streptavidin bindningsplatser för att minimera dess störningar med molekylen under konformationella förändringar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: VWF:s utökningsbeteende under skjuvningsflöde. Molekylen hörs reversibelt vid 7 olika skjuvningshastigheter: 0 s-1, 33 333 s-1, 66 667 s-1, 100 000 s-1, 133 333 s-1, 166 667 s-1 och 200 000 s-1. Den utsträckta molekylens längd ökar från 0,52 μm vid nollskjuvningshastighet till 3,44 μm vid 200 000 s-1 skjuvningshastighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Avslappningsbeteende av lambda DNA efter skjuvning satt. Flöde med 33 000 s-1 och 66 667 s-1 skjuvningshastigheter appliceras från 0 till 30 s till samma molekyl. Avkoppling registreras från 30 s till 150 s. Vid 66.667 s-1 skjuvning hastighet, DNA-molekylen elongates till 15,00 μm och slappnar av tillbaka till 5,83 μm efter att flödet har stoppats i 2 min. Vid 33 333 s-1 skjuvningshastighet sträcker sig molekylen endast till 8,75 μm och är 3,33 μm i längd efter 2 minuters avslappning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Reversibel upplösning av VWF under ökande skjuvning priser med hjälp av totala interna reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Molekylen i mitten av vyn hör bara upp till olika längder vid skjuvning s-1, 66.667 s-1, 100.000 s-1 och 133.333 s-1. En sprutpump används för att styra det flöde sats från vilket skjuvningshastigheten beräknas. Flödesriktningen är från vänster till höger. Bilder tas med 15 s intervall er för att möjliggöra fullständig avslappnings- och förlängningsprocesser. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 2: Avslappning av lambda DNA efter 33.333 s-1 skjuvning takt. Bilder tas under confocal fluorescens mikroskopi. Lambda DNA sträcks under 33.333 s-1 skjuvning flöde och avslappnad tillbaka till ett vikt tillstånd efter att flödet stoppas vid 30 s. Varaktigheten av avslappningen är 2 min. Flödesriktning är från vänster till höger. Bilder tas med 30 s intervall däremellan. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 3: Avslappning av lambda DNA efter 66.667 s-1 skjuvning takt. Inställningarna är identiska med de i Video 2 förutom den ursprungliga skjuvningsfrekvensen. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Kompletterande filer: MATLAB-koder. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att få högkvalitativa data av konformationsförändringar av enmolekyl med fluorescensmikroskopi enligt beskrivningen i denna metod är det viktigt att inkubera molekylen under lämplig tid, minimera dess ospecifika interaktioner med ytan och fastställa mikroskopinställningar som minskar fotoblekning. Molekylens förmåga att fritt ändra konformation är relaterad till antalet interaktioner mellan biotinstreptavidin som bildas mellan molekylen och ytan. Som tidigare nämnts måste detta kontrolleras genom att inkubera molekylen utan flöde under lämplig tid. Dessutom kan protein eller DNA icke specifikt binda till täckslipen om täckslipen inte blockeras effektivt. Utan den rekommenderade blockeringslösningen kan molekyler fästa på glaset icke specifikt och inte svara på något flöde som tillämpas. Det är viktigt att tillämpa kaseinblocket under tidig ytbehandling och bibehålla dess närvaro under flödet för att minska dessa ospecifika interaktioner. Slutligen, fånga kontinuerlig, dynamiskbeteende av en enda molekyl kräver ofta fluoroforspänning under bildavbild. Detta kan orsaka snabb fotoblekning om laserintensitet, exponeringstid och exponeringsfrekvens är för hög. Det är därför nödvändigt att justera dessa inställningar tillsammans och strategize hur man kan minska sina värden utan att kompromissa med tid eller bildupplösning av data.
Om förlängning och avslappning av molekylen inte observeras, bör ytterligare steg följas. Inkubera molekylen i enheten under längre och kortare tider än vad som rekommenderas i protokollet. För varje gång som testas, variera BSA-biotin och streptavidin koncentrationer av faktorer av 10. Dessa tester kan vara nödvändiga för att optimera antalet biotin-streptavidin förankringspunkter som bildas mellan molekylen och ytan. Till exempel, om biotinmärkningsdensiteten är mycket hög, på grund av avvikelser från de rekommenderade koncentrationerna eller reagenserna i märkningsprotokollet, kortare molekylär inkubationstid och lägre Koncentrationer av BSA-biotin och streptavidin kan behövas. För att ytterligare förbättra framgången för experimentet, skanna hela mikrofluidiska enheten för molekyler som reversibelt riva upp. Ytan får inte behandlas jämnt med streptavidin eller kaseinblock, vilket gör att molekyler i vissa områden har större uppstaliga svar än andra.
Denna metod begränsas av brist på information om molekylens storlek och tjudra punkter, svårigheten att producera 0 s-1 skjuvningshastighet och den optiska upplösningen av fluorescensmikroskop. Tidigare arbete har visat en stor variation i upplösningen beteende VWF, potentiellt förklaras av den breda fördelningen i antalet och platsen för biotin-streptavidin tjudra punkter och molekylvikten hos varje VWF molekyl18. För närvarande kan den metod vi presenterar inte definiera tjuderpunkter och molekylstorlek. Men Brownian dynamik simuleringar av en grov-kornig VWF modell publicerad av Wang et al. införliva dessa variabler och kan köras tillsammans med experimentella resultat för att förklara en sådan variation18. Dessutom slutar flödet inte omedelbart när sprutpumpen stoppas, och observationav rekyldynamik. Detta beror på deformation och liten utvidgning av PDMS-kanalen under den avsedda flödesperioden. När pumpen stoppas fortsätter vätskan att flöda tills PDMS är helt avslappnad. Ett förbättrat system bör använda styvare PDMS eller mikrokanaler tillverkade i hårda plastmaterial, vilket gör att vätska kan nå en 0 s-1 skjuvning snabbare. Slutligen kan man bara lösa molekyler vars storlek är i samma storleksordning som den optiska upplösningen av fluorescensmikroskopet, som kanske inte är mindre än några hundra nanometer. Således finns det ett minsta storlekskrav för molekyler som direkt kan observeras med denna metod.
Det nuvarande protokollet gäller främst kvantifiering av konformationsförändringar av protein och DNA-molekyler under fysiologiskt flöde. Metoden kan dock också användas för att visualisera realtidsinteraktioner mellan biologiska molekyler och ytterligare karakterisera protein- och DNA-funktion. Till exempel, Fu et al. har visat att bundna VWF kan aktivera under högt skjuvningflöde och ytterligare fånga trombocyt vidhäftningmolekylen GPIbα under varierandeflödesförhållanden 17. Denna bindande händelse bevaras även när VWF är bunden till ytan av biotin-streptavidin kopplingar, visar effektiviteten i detta protokoll att studera fysiologiskt relevanta funktioner och mekanik17. Liknande mekanistiska insikter kan erhållas när man studerar samspelet mellan unraveled DNA och regulatoriska proteiner i flödesmiljöer21,22. Dessutom avser vår metod främst att observera konformationella förändringar i makromolekyler. Ändå skulle man kunna anpassa den i syfte att studera mindre molekyler som är tillräckligt stora för att lösas under fluorescensmikroskopi. Till exempel, genom noncovalently eller kovalent fästa en liten molekyl till en mycket större, immobiliserade lambda DNA, kan man öka skjuvning-känslighet en mindre molekyl och lättare observera dess beteende. Sammanfattningsvis ger andra enmolekylkarakteriseringsmetoder, såsom AFM eller optiska pincett, högupplösta data om makromolekylernas strukturella och funktionella egenskaper. Dessa alternativa metoder kan dock inte observera de dynamiska, konformationella förändringar av proteiner och DNA som sker i en fysiologisk flödesmiljö, som presenteras i detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av en National Science Foundation bevilja DMS-1463234, National Institutes of Health bidrag HL082808 och AI133634, och Lehigh University intern finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
References
- Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
- Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
- LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
- Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
- Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
- Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
- Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
- Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
- Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
- Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
- Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).
- Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
