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Bioengineering

फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ कतरनी प्रवाह के तहत एकल अणु संरचना परिवर्तन की विशेषता

Published: January 25, 2020 doi: 10.3791/60784
Automatic Translation
1, *2, *3, 3, 1,2, 1,4
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University
* These authors contributed equally

Summary

हम माइक्रोफ्लूइडिक उपकरणों में एकल मैक्रोअणुओं को स्थिर करने और कतरनी प्रवाह के तहत उनकी संरचनाओं में परिवर्तन ों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल प्रवाह वातावरण में प्रोटीन और डीएनए जैसे जैव अणुओं के जैव यांत्रिक और कार्यात्मक गुणों की विशेषता के लिए उपयोगी है।

Abstract

यांत्रिक क्षोभ के तहत एकल अणु व्यवहार को कई जैविक प्रक्रियाओं को समझने के लिए व्यापक रूप से विशेषता दी गई है। हालांकि, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी जैसे तरीकों में सीमित लौकिक संकल्प होता है, जबकि फॉर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) केवल संरचनाओं को अनुमानित करने की अनुमति देता है। दूसरी ओर, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, विभिन्न प्रवाह स्थितियों में एकल अणुओं के सीटू दृश्य में वास्तविक समय की अनुमति देता है। हमारा प्रोटोकॉल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विभिन्न कतरनी प्रवाह वातावरण के तहत एकल जैव अणुओं के संरचना परिवर्तनों को पकड़ने के चरणों का वर्णन करता है। कतरनी प्रवाह माइक्रोफ्लूइडिक चैनलों के अंदर बनाया जाता है और एक सिरिंज पंप द्वारा नियंत्रित किया जाता है। विधि के प्रदर्शनों के रूप में, वॉन विल्लेब्रांड फैक्टर (वीडब्ल्यूएफ) और लैम्ब्डा डीएनए को बायोटिन और फ्लोरोफोर के साथ लेबल किया जाता है और फिर चैनल की सतह पर स्थिर किया जाता है। कुल आंतरिक प्रतिबिंब (टीआईआरएफ) और कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चर कतरनी प्रवाह के तहत उनकी संरचनाओं की लगातार निगरानी की जाती है। VWF की रिवर्सिबल unraveling गतिशीलता यह समझने के लिए उपयोगी हैं कि मानव रक्त में इसके कार्य को कैसे विनियमित किया जाता है, जबकि लैम्ब्डा डीएनए की संरचना मैक्रोमॉलिक्यूल्स के बायोफिजिक्स में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रवाह स्थितियों में बहुलक, विशेष रूप से बायोपॉलिमर के व्यवहार का अध्ययन करने और जटिल तरल पदार्थों के रीलॉजी की जांच करने के लिए व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।

Introduction

जैव अणु पर्यावरण ीय स्टिमुली का जवाब कैसे देते हैं, इसका तंत्र व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है। विशेष रूप से एक प्रवाह वातावरण में, कतरनी और लम्बी ताकतें संरचना परिवर्तनों और संभावित रूप से जैव अणुओं के कार्य को विनियमित करती हैं। विशिष्ट उदाहरणों में लैम्ब्डा डीएनए और वॉन विल्लेब्रांड फैक्टर (वीडब्ल्यूएफ) की कतरनी-प्रेरित unraveling शामिल हैं। लैम्ब्डा डीएनए का उपयोग व्यक्तिगत, लचीली बहुलक श्रृंखलाओं और बहुलकसमाधान1,2,3,4की रीलॉजी की संरचना गतिशीलता को समझने के लिए एक उपकरण के रूप में किया गया है। VWF एक प्राकृतिक प्रवाह सेंसर है जो असामान्य कतरनी दरों और प्रवाह पैटर्न के साथ रक्त वाहिकाओं के घाव साइटों पर प्लेटलेट्स को एकत्र करता है। ए3 डोमेन के लिए बाध्यकारी A1 डोमेन और कोलेजन के लिए प्लेटलेट्स के बंधन को सक्रिय करने में VWF का सुलझाना आवश्यक है। इसके अलावा, उच्च कतरनी-प्रेरित A2 डोमेन खुलासा VWF के दरार की अनुमति देता है, जो संचलन5,6में अपने आणविक वजन वितरण को नियंत्रित करता है । इस प्रकार, इन अणुओं के प्रवाह के तहत व्यवहार करने का प्रत्यक्ष दृश्य उनके बायोमैकेनिक्स और कार्य के बारे में हमारी मौलिक समझ को बहुत बढ़ा सकता है, जो बदले में उपन्यास नैदानिक और चिकित्सीय अनुप्रयोगों को सक्षम कर सकता है।

एकल अणु संरचनाओं की विशेषता के लिए विशिष्ट पद्धतियों में ऑप्टिकल/चुंबकीय चिमटी, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) और एकल-अणु फॉर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET)7शामिल हैं । एकल-अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी जैव अणुओं के संरचना परिवर्तनों से जुड़े बल और गति की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, यह समग्र आणविक संरचनाओं8नक्शा करने की क्षमता का अभाव है । एएफएम उच्च स्थानिक संकल्प के साथ इमेजिंग करने में सक्षम है लेकिन लौकिक संकल्प9,10में सीमित है । इसके अलावा, टिप और नमूने के बीच संपर्क प्रवाह से प्रेरित प्रतिक्रिया को चकित कर सकता है। FRET और नैनोपोर एनालिटिक्स जैसे अन्य तरीके इंट्रामॉलिक्यूलर दूरी और बहिष्कृत मात्रा का पता लगाने के आधार पर एकल अणु प्रोटीन तह और खुलासा राज्यों का निर्धारण करते हैं । हालांकि, ये विधियां अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में हैं और एकल अणु संरचनाओं11,12,13,14के प्रत्यक्ष अवलोकन में सीमित हैं।

दूसरी ओर, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ मैक्रो अणुओं को सीधे देखने से कई जैविक प्रक्रियाओं15,16में एकल अणु गतिशीलता के बारे में हमारी समझ में सुधार हुआ है । उदाहरण के लिए, Fu et al. हाल ही में पहली बार के लिए VWF विस्तार और प्लेटलेट रिसेप्टर बाध्यकारी के एक साथ दृश्य हासिल की । अपने काम में, VWF अणुओं को बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन इंटरैक्शन के माध्यम से एक माइक्रोफ्लूइडिक चैनल की सतह पर स्थिर किया गया था और कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी के तहत अलग-अलग कतरनी प्रवाह वातावरण17पर चित्रित किया गया था। फू के रूप में एक ऐसी ही विधि लागू करने, हम यहां प्रदर्शित करते है कि VWF और lambda डीएनए की संरचनाओं सीधे दोनों TIRF और confocal फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत मनाया जा सकता है । जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है, माइक्रोफ्लूइडिक उपकरणों का उपयोग कतरनी प्रवाह को बनाने और नियंत्रित करने के लिए किया जाता है, और चैनल की सतह पर जैव अणुओं को स्थिर किया जाता है। अलग-अलग कतरनी दरों के आवेदन पर, एक्सटेंशन लम्हों को मापने के लिए एक ही अणु की संरचनाएं दर्ज की जाती हैं, जो चित्र 1में भी दिखाई जाती हैं। विधि व्यापक रूप से दोनों rheological और जैविक अध्ययन के लिए जटिल प्रवाह वातावरण के तहत अन्य बहुलक व्यवहार का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. वीडब्ल्यूएफ तैयार करना

  1. इसे लेबलिंग प्रतिक्रियाओं के लिए तैयार करने के लिए मानव प्लाज्मा VWF का पुनर्गठन करें। 1 मिलीग्राम/एमएल वीडब्ल्यूएफ स्टॉक सॉल्यूशन बनाने के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल वीडब्ल्यूएफ स्टॉक सॉल्यूशन बनाने के लिए 100 माइक्रोनिड (डीआई) पानी को 100 माइक्रोन्ड ियावीएफ में जोड़ें।
  2. अतिरिक्त ग्लाइसिन को हटाने के लिए डायलिज़ वीडब्ल्यूएफ स्टॉक समाधान, जिससे बायोटिन और फ्लोरोफोर लेबलिंग दक्षता में वृद्धि होती है।
    1. एक 10,000 आणविक वजन कट-ऑफ और एक टोपी के साथ सील के साथ एक 0.1 mL डायलिसिस इकाई में VWF स्टॉक समाधान के 50 μL हस्तांतरण। शेष स्टॉक समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। वीडब्ल्यूएफ स्टॉक -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 साल तक स्थिर रहेगा।
    2. 1x बाँझ फास्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) (0.01 मीटर डिसोडियम फास्फेट, 0.0018 मोनोपोटेशियम फास्फेट, 0.0027 एम पोटेशियम क्लोराइड, 0.137 मीटर सोडियम क्लोराइड, पीएच 7.4 पर 25 डिग्री सेल्सियस) के 500 एमएल में डायलिसिस चलाएं। ताजा पीबीएस के 500 मीटर का उपयोग करके एक अतिरिक्त घंटे के लिए डायलिसिस दोहराएं।
  3. बायोटिन लेबलिंग रिएक्शन शुरू करें। प्रतिक्रिया से तुरंत पहले डीआईपानी में ठोस को भंग करके एनएचएस-खूंटी 4-बायोटिन का 2 एमएम समाधान तैयार करें। एनएचएस-खूंटी4-बायोटिनको विस्तारित समय के लिए पानी में रहने की अनुमति देने से एनएचएस-एस्टर समूह को हाइड्रोलीज करना होगा, जिससे लेबलिंग दक्षता कम हो जाएगी ।
    1. वीडब्ल्यूएफ स्टॉक सॉल्यूशन वाली डायलिसिसयूनिट में 2 एमएम एनएचएस-खूंटी 4-बायोटिन के 2.5 माइक्रोन जोड़ें। इसके परिणामस्वरूप वीडब्ल्यूएफ मोनोमर की तुलना में बायोटिन की 20 गुना मोलर अतिरिक्त होगी। VWF के प्राथमिक अमीनों एनएचएस-एस्टर समूहों के साथ प्रतिक्रियाहोगी, जिससे सहसंयोजक खूंटी 4-बायोटिन समूहों के लिए amide लिंकेज के माध्यम से बाध्यकारी ।
    2. डायलिसिस यूनिट को 1.5 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब के अंदर रखें। डायलिसिस यूनिट को इसकी इसी कैप से सील करें। पैराफिल्म के साथ ट्यूब-डायलिसिस असेंबली को सुरक्षित करें। सीधा रखें और 40 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
  4. फ्लोरोफोर लेबलिंग रिएक्शन शुरू करें। डीआई पानी में फ्लोरोफोर ठोस को भंग करके एलेक्सा 488 टेट्राफ्लोरोफेनिल-एस्टर (टीएफपी-एस्टर) फ्लोरोसेंट डाइ (उत्तेजनाअधिकतम = 498 एनएम, उत्सर्जनअधिकतम = 519 एनएम) का 2.8 एमएम समाधान तैयार करें। टीएफपी-एस्टर समूह को हाइड्रोलाज़िंग से रोकने के लिए प्रतिक्रिया से तुरंत पहले ऐसा करें।
    1. डायलिसिस यूनिट में 2.8 एमएम 488 फ्लोरोफोर का 2.9 माइक्रोन जोड़ें। इसके परिणामस्वरूप वीडब्ल्यूएफ मोनोमर की तुलना में फ्लोरोफोर की 34 गुना मोलर अतिरिक्त होगी। VWF के शेष प्राथमिक अमीनों टीएफपी-एस्टर समूहों के साथ प्रतिक्रिया होगी, जिससे amide लिंकेज के माध्यम से फ्लोरोफोरस के लिए सहसंयोजकीय बाध्यकारी ।
    2. डायलिसिस यूनिट में 1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट (डीआई पानी में घुलजाना) का 2.0 माइक्रोन जोड़ें। यह प्रतिक्रिया के पीएच को 8.0 के करीब समायोजित करता है, जो टीएफपी-एस्टर और प्राथमिक अमीन प्रतिक्रिया की दक्षता को बढ़ाता है।
    3. एक माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब में डायलिसिस इकाई सुरक्षित बस के रूप में कदम 1.3.2 में। फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए अंधेरे में स्टोर करें और 1 घंटे और 30 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
  5. डायलिसिस यूनिट को 1x बाँझ पीबीएस के 900 एमएल में रखें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर डायलिसिस यूनिट रखें। यह 0.71 मिलीग्राम/mL या 2.84 माइक्रोन (मोनोमर एकाग्रता) की एकाग्रता पर लेबल VWF के लगभग 70 μL निकलेगा।
  6. एक माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब में VWF लेबल स्थानांतरण। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब को कवर और प्रकाश से बचाने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। दीर्घकालिक भंडारण के लिए, 0.02% (w/v) की अंतिम एकाग्रता में एंटी-माइक्रोबियल एजेंट सोडियम एजाइड जोड़ें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

2. लैम्ब्डा डीएनए तैयार करना

  1. मानक प्रोटोकॉल के अनुसार बायोटिन-14-डीसीटीपी न्यूक्लियोटाइड्स के साथ अपनी एकजुट अंत साइटों (कॉस साइटों) को भरकर बायोटिनलेट रैखिक लैम्ब्डा डीएनए, यहां चरण 2.118में दोहराया गया। डीएटीपी, डीटीपी और डीजीटीपी न्यूक्लियोटाइड्स के साथ शेष कॉस साइटों को भरें।
    1. 10x रिएक्शन बफर (500 एमएम सोडियम क्लोराइड, 100 एम ट्राई हाइड्रोक्लोराइड, 100 एमएम मैग्नीशियम क्लोराइड, 10 एम एम डिथिओथ्रेइटॉल, पीएच 7.9 एट 25 डिग्री सेल्सियस) में डीएटीपी, डीटीपी, डीजीटीपी और बायोटिन-14-डीसीटीपी के 1 एमएम समाधान तैयार करें।
    2. पीसीआर ट्यूब में 500 एनजी/माइक्रोन लम्ब्डा डीएनए के 48 माइक्रोन रखें और 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए हीट करें। परिपत्र लैम्ब्डा डीएनए की कॉस साइटें गर्मी के तहत अलग होंगी, अणु को रैखिक करेंगी और बायोटिनाइलेशन के लिए एकल-फंसे ओवरहैंग तैयार करेंगी । इसके तुरंत बाद, कॉस साइटों को फिर से एनीलिंग से रोकने के लिए बर्फ पर रखें।
    3. लैम्ब्डा डीएनए में 1 एमएम डीएटीपी, डीटीपी और डीजीटीपी और 1 एमएम बायोटिन-14-डीसीटीपी के 4 माइक्रोन को 5 माइक्रोन जोड़ें। इसके अलावा डीएनए संश्लेषण को उत्प्रेरक करने के लिए 5 U/μL Klenow खंड (3'à5' exo-) के 2.5 μL जोड़ें।
    4. प्रतिक्रिया मिश्रण को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. 0.5 मीटर EDTA के 1.2 माइक्रोन जोड़ें। इसके बाद रिएक्शन मिश्रण को 5 मिन के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। यह क्लेनोखंड और बायोटिनाइलेशन प्रतिक्रिया को निष्क्रिय कर देगा।
  2. एक स्पिन कॉलम का उपयोग करके लैम्ब्डा डीएनए से अतिरिक्त न्यूक्लियोटाइड्स निकालें जो 10-70 माइक्रोन पकड़ सकता है और इसमें 6,000 आणविक वजन कट-ऑफ है।
    1. कॉलम को 2 mL माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के अंदर रखें। 2 मिन के लिए 1000 x ग्राम पर कॉलम और ट्यूब को सेंट्रलाइज करें। ट्यूब में एकत्र होने वाले प्रवाह-के माध्यम से निपटाएं।
    2. कॉलम बफर को चरण 2.1.1 से एक ही प्रतिक्रिया बफर के 1x समाधान के साथ बदलें। कॉलम में 1x बफर के 500 माइक्रोन जोड़कर ऐसा करें। 1000 x ग्रामपर 1 मिन के लिए सेंट्रलाइज। प्रवाह के माध्यम से निपटानी। इन 2 बार और दोहराएं ताकि कॉलम में कुल 1500 माइक्रोन जोड़े गए हों।
    3. कॉलम को 1.5 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में रखें। ध्यान से कॉलम की शीर्ष परत में चरण 2.1.5 से समाधान जोड़ें। 1000 x ग्रामपर 4 मिन के लिए सेंट्रलाइज।
    4. माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब से फ्लो-थ्रू (40-70 माइक्रोन) इकट्ठा करें और पीसीआर ट्यूब में रखें। इसमें शुद्ध, बायोटिनेटेड लैम्ब्डा डीएनए होता है।
  3. फ्लोरोसेंट योयो-1 रंग (उत्तेजनाअधिकतम = 490 एनएम, उत्सर्जनअधिकतम = 509 एनएम) मानक प्रोटोकॉल के अनुसार लेबल लैम्ब्डा डीएनए, यहां चरण 2.3.120में दोहराया गया।
    1. 1:10 के आधार जोड़ी मोलर अनुपात के लिए एक रंग के साथ YOYO-1 रंगे और लैम्ब्डा डीएनए का समाधान तैयार करें। मान लें कि लैम्ब्डा डीएनए की आधार जोड़ी एकाग्रता की गणना करने के लिए शुद्धिकरण कदम में कोई डीएनए खो गया था। फुल लेंथ लैम्ब्डा डीएनए में ४८,५०२ बेस जोड़े हैं ।
      नोट: उदाहरण के लिए, यदि चरण 2.2.4 से समाधान का 50 माइक्रोन बरामद किया गया था, तो 500 माइक्रोन योयो-1 रंग के 7.4 माइक्रोन जोड़ें।
    2. प्रतिक्रिया को पूरा करने के लिए अंधेरे में 50 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए समाधान गर्म करें।
    3. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब को कवर और प्रकाश से बचाने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। समाधान अब माइक्रोफ्लूइडिक उपकरणों में इंजेक्ट करने के लिए तैयार है।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

3. सिलिकॉन वेफर में माइक्रोफ्लूइडिक चैनल मोल्ड बनाना

  1. मानक प्रोटोकॉल19के अनुसार मास्टर सिलिकॉन वेफर पर उपयुक्त आयामों(चित्रा 2)के साथ माइक्रोफ्लूइडिक चैनल बनाने के लिए फोटोलिथोग्राफी का उपयोग करें ।

4. पॉलीडिमेथिलसिलॉक्सेन (पीडीएम) माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस की तैयारी

  1. एक वजन नाव में 1 भाग इलाज एजेंट (द्रव्यमान द्वारा) के लिए 5 भागसिलिकॉन elastomer आधार जोड़ें । पूर्व-ठीक पीडीएफएस समाधान बनाने के लिए 1 मिन के लिए सामग्री को अच्छी तरह हिलाएं।
  2. मास्टर सिलिकॉन वेफर को प्लास्टिक पेट्री डिश में रखें। 5 मिमी परत बनाने के लिए वेफर पर पीडीएम समाधान डालें। पकवान को कवर करें और हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 1 घंटे के लिए वैक्यूम के नीचे एक डिसिकाटर में छोड़ दें।
  3. इनक्यूबेट ने पीडीएमएस को एक लचीले ठोस में इलाज करने के लिए रातोंरात 60 डिग्री सेल्सियस पर पेट्री डिश को कवर किया। इलाज के परिणामस्वरूप पीडीएम-वेफर इंटरफेस पर पीडीएम में ढाला गया माइक्रोफ्लूइडिक चैनल होगा।
  4. एक रेजर का उपयोग करके, प्रत्येक माइक्रोफ्लूइडिक चैनल के आसपास, पीडीएम में 20 x 10 मिमी आयतों को काटें। चिमटी के साथ आयताकार पीडीएस ब्लॉक निकालें।
  5. चैनल के एक छोर पर व्यास में एक छेद 0.5 मिमी पंच करने के लिए तेज किनारों के साथ एक 25 जी कुंद अंत सुई का प्रयोग करें, सुनिश्चित करें कि छेद पीडीएफब्लॉक(चित्रा 2)के माध्यम से पूरी तरह से चला जाता है। छेद से पीडीएम बाहर पंच करने के लिए एक पतली सुई का प्रयोग करें। चैनल के दूसरे छोर पर इसे दोहराएं। इससे चैनल के जरिए फ्लो के लिए इंलेट और आउटलेट बनाएगा।
  6. वीनिल क्लीनरूम टेप के साथ पीडीएम ब्लॉक की सतह को साफ करें। मलबे को हटाने के लिए नंबर 1 1/2, 22 x 50 मिमी कवरस्लिप पर संकुचित नाइट्रोजन गैस उड़ाएं।
  7. चैनल साइड अप के साथ पीडीएम ब्लॉक और कवरस्लिप को प्लाज्मा बॉन्डिंग मशीन के चैंबर में रखें। इलाज शुरू करें।
  8. इलाज पूरा होने पर जल्दी से पीडीएम ब्लॉक को कवरस्लिप पर रखें ताकि चैनल स्लिप के संपर्क में रहे। ब्लॉक के किनारों के साथ दबाव लागू करें। स्थायी बंधन को मजबूत करने के लिए 15 मिन के लिए 115 डिग्री सेल्सियस पर हॉट प्लेट पर कवरस्लिप-पीडीएम एसेंबली रखें।
  9. पीडीएम ब्लॉक के शीर्ष पर आउटलेट छेद में 10 सेमी लंबी, 0.25 मिमी आंतरिक व्यास ट्यूबिंग डालें। यह तरल पदार्थ को आसानी से चैनल से बाहर बहने की अनुमति देता है। डिवाइस अब पूरा हो गया है।

5. माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस की सतह का इलाज

  1. वीडब्ल्यूएफ प्रयोगों के लिए माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के इनलेट में बाँझ 1x पीबीएस में भंग 10 μg/mL बायोटिनेटेड बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए-बायोटिन) का इंजेक्ट & 10 μL । लैम्ब्डा डीएनए प्रयोगों के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल बीएसए-बायोटिन का इंजेक्ट एंड एलटी; 10 माइक्रोन। इंजेक्शन के बाद पिपेट टिप में बीएसए-बायोटिन के कुछ माइक्रोलीटर रोक ें और टिप को इनलेट में एम्बेडेड रहने की अनुमति दें।
    1. हमेशा टिप के चारों ओर DI पानी की एक बूंद रखें। इससे हवा के बुलबुले चैनल में घुसने से रोकेंगे। इस तकनीक को हर बार लागू करें जब चैनल में एक नया समाधान इंजेक्ट किया जाता है।
    2. बीएसए-बायोटिन को 2 घंटे के लिए डिवाइस में इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। बीएसए विशेष रूप से कवरस्लिप सतह(चित्रा 3ए)से बंधा होगा ।
  2. पिपेट टिप निकालें। चैनल में कैसिन ब्लॉकिंग समाधान के और एलटी; 10 μL इंजेक्ट करें और इसे 30 मिन के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। कैसिन किसी भी मुफ्त साइटों को अवरुद्ध करेगा, सतह पर जैव अणुओं के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को कम करेगा(चित्रा 3बी)।
  3. वीडब्ल्यूएफ प्रयोगों के लिए चैनल में बाँझ 1x पीबीएस में भंग 10 μg/mL स्ट्रेप्टाविडिन के टिप और एलटी;10 μL इंजेक्ट करें । लैम्ब्डा डीएनए प्रयोगों के लिए 100 μg/mL स्ट्रेप्टाविडिन का प्रयोग करें। 10 मिन के लिए इनक्यूबेट। स्ट्रेप्टाविडिन बीएसए-बायोटिन(चित्रा 3सी)के बायोटिन समूहों को बांधदेगा।
  4. अतिरिक्त स्ट्रेप्टाविडिन को धोने के लिए चैनल में टिप और 10 माइक्रोन 1x डिटर्जेंट समाधान (पीबीएस में 0.05% ट्वीन 20) को इंजेक्ट करें।
  5. टिप निकालें और या तो 28.4 एनएम VWF के टिप और इंजेक्ट और 10 μL कदम 2.3.3 से casein समाधान या लैम्ब्डा डीएनए में पतला। 3 मिन के लिए इनक्यूबेट VWF। 45 मिन के लिए इनक्यूबेट लैम्ब्डा डीएनए(चित्रा 3डी)।
  6. केसिन समाधान में 5 एमएम फ्री बायोटिन पतला की टिप और एलटी 10 माइक्रोन इंजेक्ट करें और इंजेक्ट करें। फ्री बायोटिन चैनल की सतह(चित्रा 3ई)पर अतिरिक्त स्ट्रेप्टाविडिन बाध्यकारी साइटों को अवरुद्ध करेगा।

6. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत VWF और लैम्ब्डा डीएनए की कल्पना

  1. 2.2 एमएम प्रोटोकेटचुइक एसिड और 37 एनएम प्रोटोकाटेचुएट-3,4-डाइऑक्सिकाज़ (फोटोब्लीचिंग को कम करने के लिए) के साथ कैसिन ब्लॉकिंग समाधान का 1 एलतैयार करें। एक सिरिंज में लोड करें और सिरिंज पंप में सुरक्षित करें। 30 सेमी लंबा, 0.25 मिमी आंतरिक व्यास ट्यूबिंग लें और सिरिंज सुई के लिए एक छोर देते हैं। हवा के बुलबुले को हटाने के लिए समाधान में प्रवाह। ट्यूब के दूसरे छोर को माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के इनलेट में अटैच करें। चरण 5.6 के बाद 3 मिनट ऐसा करने की सिफारिश की जाती है।
  2. कुल आंतरिक प्रतिबिंब (टीआईआरएफ) या कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के उच्चतम आवर्धन उद्देश्य (यानी, 60-100X) का चयन करें। जरूरत पड़ने पर अपने उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ें। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें ताकि कवरस्लिप को ऑब्जेक्टिव के साथ फ्लश किया जा सके।
  3. ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी शुरू करें। ध्यान समायोजित करें ताकि मलबे और बुलबुले जैसी कोई भी विशेषताएं दिखाई दे। फिर एक्स और वाई दिशा में चरण को तब तक समायोजित करें जब तक कि माइक्रोफ्लूइडिक चैनल का किनारा दिखाई न दे और फ्रेम को विभाजित न कर दे।
  4. 488 चैनल (फ़ीसीसी) पर स्विच करें। जेड स्तर और TIRF कोण समायोजित जब तक व्यक्तिगत हरे, गोलाकार अणुओं प्रतिष्ठित किया जा सकता है की जरूरत है । ये या तो VWF या lambda डीएनए अणुहैं ।
  5. फ्लोरोसेंट अणुओं की कल्पना करने के लिए एक्सपोजर समय और लेजर तीव्रता को समायोजित करें, उन्हें बहुत जल्दी फोटोब्लीचिंग किए बिना। अणुओं को अधिक स्पष्ट रूप से कल्पना करने के लिए विपरीत समायोजित करें।
  6. सिरिंज पंप से प्रवाह शुरू करें ताकि कैसिन ब्लॉकिंग समाधान चैनल में और आउटलेट से बाहर बहता है। यह चरण 5.6 के बाद ठीक 5 मिनट करें। अणुओं की संरचना में परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए प्रवाह को रोकें और शुरू करें। प्रवाह लागू करते समय, माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के विभिन्न क्षेत्रों में इसे दोहराएं 5,000 और 30,000 माइक्रोन/एच के बीच दरों का उपयोग करें। अणुओं का पता लगाने के लिए इस प्रक्रिया को जारी रखें जो प्रवाह को रोकने और शुरू करने के कई चक्रों पर विस्तार और आराम कर सकते हैं।
  7. ध्यान दें कि अणुओं को अधिकतम विस्तार तक पहुंचने और ग्लोब्यूल्स में पूरी तरह से आराम करने में कितना समय लगता है। कतरनी प्रवाह के तहत अणुओं के निरंतर व्यवहार के रिकॉर्ड वीडियो, सबसे अच्छा एक्सपोजर समय, एक्सपोजर आवृत्ति और वीडियो अवधि का चयन करना जो एक्सटेंशनल व्यवहार की पूरी श्रृंखला को कैप्चर करेगा और फोटोब्लीचिंग को कम करेगा।
  8. वीडियो के रूप में सहेजें । एक स्केलबार के साथ AVI फ़ाइलें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

7. संरचना परिवर्तन ों का छवि विश्लेषण

  1. आयताकार माइक्रोफ्लूइडिक चैनल के प्रवाह दरSymbol 1(क्यू)और ऊंचाई(एच)और चौड़ाई(डब्ल्यू)का उपयोग करके मैक्रोअणुओं पर लागू दीवार कतरनी दर () की गणना करें। ऐसा करने के लिए निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करें:
    Equation 1
  2. अनुकूलित मैटलैब कोड का उपयोग करके विभिन्न कतरनी दरों के तहत किसी भी जैव अणु की लंबाई निर्धारित करें (पूरक फाइलेंदेखें)। वीडियो विश्लेषण शीर्षक से एक फ़ोल्डर बनाएं जिसमें निम्नलिखित मैटलैब कोड शामिल हैं: मुख्याह्न, save_each_frame, get_length और get_length. अंजीर। वीडियो शीर्षक से वीडियो विश्लेषण के भीतर एक सबफोल्डर बनाएं और जोड़ें। AVI फ़ाइलों का विश्लेषण किया जाएगा।
  3. MATLAB 2019a का उपयोग कर के मुख्य ाह्न खोलें और कोड चलाएं। कृपया डेटा फ़ाइलका विश्लेषण करने के लिए इनपुट के तहत कमांड विंडो में विश्लेषण किया जा करने के लिए वीडियो फ़ाइल के नाम पर टाइप करें: ।
  4. खोले गए ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) में, 20 से 20 तक सीमा (विंडो के शीर्ष दाईं ओर बॉक्स में पाठ) सेट करें और पुष्टि करने के लिए सेट थ्रेसहोल्ड बटन पर क्लिक करें।
  5. स्केल बार पर कहीं भी एक पिक्सेल चुनने के लिए विंडो के टॉप टूल बार में डेटा कर्सर का उपयोग करें। विंडो के दाईं ओर स्केल बार सेक्शन में स्टार्ट पॉइंट पर क्लिक करें। चुने हुए पिक्सेल की (एक्स,वाई) स्थिति बटन के दाईं ओर दिखाई देगी। पिक्सल साइज (माइक्रोन) बटन पर क्लिक करें। पिक्सेल आकार प्रत्येक वीडियो में केवल एक बार मापा जाना चाहिए।
  6. ब्याज के अणु पर किसी भी पिक्सेल चुनें। VWF अनुभाग में स्टार्ट पॉइंट पर क्लिक करें। चुने हुए पिक्सेल की स्थिति दाईं ओर टेक्स्ट बॉक्स पर दिखाई देने के बाद, छवि में आणविक लंबाई प्राप्त करने के लिए बाएं छोर, दाएं अंत और स्ट्रिंग लेंथ पर क्लिक करें।
    नोट: इस कदम का उपयोग किसी भी जैव अणु के संरचना परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, बावजूद इसके कोड में वीडब्ल्यूएफनाम का एक विशिष्ट अनुभाग है।
  7. अणु के बाएं और दाएं छोर की दोहरी जांच करें। ज़ूम इन करें और ब्याज की पिक्सेल स्थिति की जांच करने के लिए डेटा कर्सर का उपयोग करें। मैन्युअल रूप से पिक्सेल को अंत के रूप में चुनें और आवश्यक होने पर लंबाई (पिक्सेल में) की पुनर्गणना करें।
  8. पिक्सल नंबर में माइक्रोन और स्ट्रिंग लेंथ में पिक्सल साइज को एक्सेल शीट में रिकॉर्ड करें और माइक्रोन में स्ट्रिंग लेंथ की गणना करें ।
  9. हर छवि के लिए ऊपर दिए गए चरणों को दोहराएं। एक ही वीडियो फ़ाइल में छवियों के बीच स्विच करने के लिए जीयूआई के निचले दाहिने कोने में अंतिम, अगले बटन का उपयोग करें। जीयूआई विंडो को बंद करने के लिए बंद पर क्लिक करें।

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Representative Results

VWF और लैम्ब्डा डीएनए जैसे जैव अणुओं के गतिशील व्यवहार को देखना डिवाइस की सतह के लिए उनके बाध्यकारी को अनुकूलित करने पर अत्यधिक निर्भर है। माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस में अनुशंसित समय के लिए सतह उपचार इनक्यूबेटिंग कुछ एंकरेज पॉइंट्स के साथ बाध्यकारी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, ताकि अणु स्वतंत्र रूप से विस्तार और प्रवाह को बदलने पर आराम कर सकें। यदि प्रोटीन या डीएनए कई संबंधों के साथ बहुत दृढ़ता से बंधे हैं, तो वे या तो सीमित लंबाई तक विस्तारित होंगे या बिल्कुल भी विस्तार नहीं करेंगे। यह विशेष रूप से VWF के साथ होता है जब यह मुफ्त बायोटिन अवरुद्ध करने से पहले 3 से अधिक टिन के लिए डिवाइस की सतह पर प्रवाह के बिना रहता है। अब VWF सतह स्थिर पर रहता है, और अधिक VWF बायोटिन समूहों सतह स्ट्रेप्टाविडिन समूहों को बांध और कम लचीलापन अणु को सुलझाना है । यदि अणु बहुत कमजोर रूप से बंधे हैं, तो दूसरी ओर, वे प्रवाह पर अलग हो जाएंगे और देखने से गायब हो जाएंगे । यह तब हो सकता है जब वीडब्ल्यूएफ या लैम्ब्डा डीएनए को पीरियड्स की बहुत कम कमी के लिए इनक्यूबेटेड किया जाता है, जिससे बहुत कम बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन इंटरैक्शन होता है। अणु भी मुक्त हो सकते हैं जब अत्यंत उच्च कतरनी दर (>200,000एस-1)लागू की जाती है, जिससे बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन इंटरैक्शन कमजोर हो जाता है।

एक आदर्श अणु इस हद तक बांधता है कि यह रोकने और प्रवाह शुरू करने के कई चक्रों पर जानने और आराम कर सकता है। इस तरह संरचना को बदलने के लिए एक अणु का लचीलापन अक्सर अपनी लंबाई बढ़ाने के लिए विस्तार करने की क्षमता से प्रदर्शित किया जाता है क्योंकि उच्च कतरनी दरों को बढ़ते प्रवाह की एक श्रृंखला के भीतर लागू किया जाता है। TIRF माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त VWF की छवियां वीडियो 1में इस रिश्ते को प्रदर्शित करती हैं । एक्सटेंशन बनाम चित्रा 4 में इस एक ही VWF अणु की कतरनी दर वक्र ठीक एक VWF अणु के कतरनी प्रेरित व्यवहार को कैप्चर करता है और प्रोटीन के जैव यांत्रिक गुणों की विशेषता के लिए उपयोगी है। कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त लैम्ब्डा डीएनए की छवियां इसी तरह उच्च कतरनी दरों पर विस्तार में वृद्धि और 2 मिन पर क्रमिक विश्राम दिखाती हैं, जैसा कि वीडियो 2 और वीडियो 3में कैप्चर किया गया है। रुके हुए प्रवाह के बाद लैम्ब्डा डीएनए की हटना विशेषताओं को भी चित्रा 5में ग्राफिक रूप से दर्शाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1: फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत माइक्रोफ्लूइडिक चैनल में एकल अणु प्रवाह प्रयोग की योजनाबद्ध । चैनल की सतह को बीएसए-बायोटिन के साथ लेपित किया जाता है और कैसिन के साथ अवरुद्ध किया जाता है। स्ट्रेप्टाविडिन चैनल की सतह पर बायोटिन के साथ बंधुआ है और सतह पर एकल अणुओं को स्थिर करने के लिए बायोटिनेटेड VWF/lambda डीएनए भी है । चूंकि कतरनी दर ए से सीतक बढ़ जाती है, इसलिए अणु को एक तह राज्य से बाएं से दाईं ओर प्रवाह दिशा के साथ एक लम्बी स्थिति में फैलाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रोफ्लूइडिक चैनल आयाम। पीडीएमएस माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के आकार और संरचना को चैनल आयामों के साथ दिखाया गया है। चैनल ऊंचाई में 50 माइक्रोमीटर है और चौड़ाई में 0.1 से 1.0 मिमी तक है। चैनल के बीच में संकुचित क्षेत्र लंबाई में 0.7 मिमी है। इनलेट और आउटलेट व्यास में 0.5144 मिमी (25 जी) हैं। प्रवाह दिशा बाईं से दाएं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एकल अणु स्थिरीकरण के लिए सतह उपचार कदम। सभी कदम कमरे के तापमान पर होते हैं। (A)बीएसए-बायोटिन को सतह पर 2 घंटे(बी)के लिए लेपित किया जाता है । केसिन को सतह को ब्लॉक करने के लिए 30 सीन के लिए चैनल में इंजेक्ट किया जाता है। (ग)स्ट्रेपविडिन को बीएसए-बायोटिन के साथ बांधने के लिए 10 मिन के लिए चैनल में इनक्यूबेटेड किया जाता है । (डी)पूर्व चरणों में अतिरिक्त अणुओं को धोने के बाद, फ्लोरोफोर और बायोटिन लेबल वाले वीडब्ल्यूएफ/लैम्ब्डा डीएनए को चैनल में इंजेक्ट किया जाता है और स्ट्रेप्टाविडिन के साथ संबंध के माध्यम से स्थिर किया जाता है । (ई)मुक्त बायोटिन में प्रवाहित किया जाता है, जो संरचना परिवर्तनों के दौरान अणु के साथ अपने हस्तक्षेप को कम करने के लिए अतिरिक्त स्ट्रेप्टाविडिन बाध्यकारी साइटों को अवरुद्ध करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: कतरनी प्रवाह के तहत VWF के एक्सटेंशनल व्यवहार । अणु 7 विभिन्न कतरनी दरों पर उलटा ढंग से खोलता है: 0एस -1, 33,333एस -1, 66,667एस -1, 100,000 एस-1, 133,333एस -1, 166,667 एस-1 और 200,000एस -1. विस्तारित अणु की लंबाई शून्य कतरनी दर पर 0.52 माइक्रोन से बढ़कर 200,000एस-1 कतरनी दर पर 3.44 माइक्रोन हो जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: कतरनी प्रवाह बंद हो जाता है के बाद लैम्ब्डा डीएनए के विश्राम व्यवहार । 33,000 एस-1 और 66,667 एस-1 कतरनी दरों के साथ प्रवाह 0 से 30 एस एक ही अणु के लिए लागू होते हैं। छूट 30 से 150 एस तक दर्ज की गई है। 66,667 एस-1 कतरनी दर पर, डीएनए अणु 15.00 माइक्रोन तक पहुंच जाता है और 2 मिन के लिए प्रवाह बंद होने के बाद 5.83 माइक्रोन को वापस आराम करता है। 33,333 एस-1 कतरनी दर पर, अणु केवल 8.75 माइक्रोन तक फैला हुआ है और छूट के 2 मिन के बाद लंबाई में 3.33 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Video 1
वीडियो 1: कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके बढ़ती कतरनी दरों के तहत VWF का रिवर्सिबल unraveling। देखने के बीच में अणु कतरनी दरों पर अलग - अलग लंबाई तक 33,333 एस-1, 66,667 एस-1, 100,000 एस-1 और 133,333 एस-1तक पहुंच जाता है . एक सिरिंज पंप का उपयोग उस प्रवाह दर को नियंत्रित करने के लिए किया जाता है जिससे कतरनी दरों की गणना की जाती है। प्रवाह दिशा बाईं से दाएं है। छवियों को पूर्ण छूट और विस्तार प्रक्रियाओं की अनुमति देने के लिए 15 एस अंतराल के साथ लिया जाता है। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

Video 2
वीडियो 2: 33,333 एस-1 कतरनी दर के बाद लैम्ब्डा डीएनए की छूट। छवियों को कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत लिया जाता है। लैम्ब्डा डीएनए को 33,333एस-1 कतरनी प्रवाह के नीचे फैलाया जाता है और प्रवाह को 30 एस में बंद करने के बाद एक मुड़ा हुआ राज्य में वापस आराम किया जाता है। विश्राम की अवधि 2 मिनट है। प्रवाह दिशा बाएं से दाएं होती है। छवियों के बीच में 30 एस अंतराल के साथ लिया जाता है। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

Video 3
वीडियो 3: 66,667एस -1 कतरनी दर के बाद लैम्ब्डा डीएनए की छूट। प्रारंभिक कतरनी दर को छोड़कर वीडियो 2 में सेटिंग्स लोगों के समान हैं। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

अनुपूरक फाइलें: MATLAB कोड। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस विधि में वर्णित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकल-अणु संरचना परिवर्तनों के उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए, उचित समय के लिए अणु को इनक्यूबेट करना महत्वपूर्ण है, सतह के साथ इसकी गैर-विशिष्ट बातचीत को कम करना और माइक्रोस्कोप सेटिंग्स स्थापित करें जो फोटोब्लीचिंग को कम करते हैं। अणु को स्वतंत्र रूप से बदलने के लिए अणु की क्षमता अणु और सतह के बीच गठित बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन इंटरैक्शन की संख्या से संबंधित है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, इसे उचित समय के लिए प्रवाह के बिना अणु को इनक्यूबेटकरद्वारा नियंत्रित किया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, यदि कवरस्लिप प्रभावी रूप से अवरुद्ध नहीं होती है तो प्रोटीन या डीएनए गैर-विशेष रूप से कवरस्लिप से बांध सकते हैं। अनुशंसित अवरुद्ध समाधान के बिना, अणु कांच को गैर-विशिष्ट रूप से संलग्न कर सकते हैं और लागू किसी भी प्रवाह दर के प्रति अनुत्तरदायी हो सकते हैं। प्रारंभिक सतह उपचार के दौरान कैसिन ब्लॉक लागू करना और प्रवाह के दौरान इसकी उपस्थिति बनाए रखना इन गैर-विशिष्ट बातचीत को कम करने के लिए आवश्यक है। अंत में, एक अणु के निरंतर, गतिशील व्यवहार पर कब्जा करने के लिए छवि कैप्चर के दौरान लगातार फ्लोरोफोर उत्तेजना की आवश्यकता होती है। यह तेजी से फोटोब्लीचिंग का कारण बन सकता है यदि लेजर तीव्रता, एक्सपोजर समय और एक्सपोजर फ्रीक्वेंसी बहुत अधिक है। इसलिए इन सेटिंग्स को मिलकर समायोजित करना और डेटा के समय या छवि समाधान से समझौता किए बिना अपने मूल्यों को कम करने के तरीके की रणनीति बनाना आवश्यक है।

यदि अणु का विस्तार और विश्राम नहीं देखा जाता है, तो अतिरिक्त कदम उठाए जाने चाहिए। प्रोटोकॉल में जो सलाह दी जाती है, उससे अधिक समय तक डिवाइस में अणु को इनक्यूबेट करें। परीक्षण किए जाने वाले प्रत्येक बार के लिए, 10 के कारकों द्वारा बीएसए-बायोटिन और स्ट्रेपेविडिन सांद्रता को भिन्न करता है। ये परीक्षण अणु और सतह के बीच बनने वाले बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन एंकोरेज पॉइंट्स की संख्या को अनुकूलित करने के लिए आवश्यक हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, यदि लेबलिंग प्रोटोकॉल में अनुशंसित सांद्रता या अभिकर्मकों से विचलन के कारण बायोटिन लेबलिंग घनत्व बहुत अधिक है, तो कम आणविक ऊष्मायन समय और कम बीएसए-बायोटिन और स्ट्रेपेविडिन सांद्रता की आवश्यकता हो सकती है। प्रयोग की सफलता को और बेहतर बनाने के लिए, अणुओं के लिए पूरे माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस को स्कैन करें जो श्रद्धापूर्वक सुलझाना है। सतह को स्ट्रेप्टाविडिन या कैसिन ब्लॉक के साथ समान रूप से इलाज नहीं किया जा सकता है, जिससे कुछ क्षेत्रों में अणुओं को दूसरों की तुलना में अधिक प्रतिक्रियाएं होती हैं।

यह विधि अणु के आकार और तेरेरिंग बिंदुओं के बारे में जानकारी की कमी, 0एस-1 कतरनी दर और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल संकल्प के उत्पादन में कठिनाई से सीमित है। पिछले काम VWF के unraveling व्यवहार में एक बड़ी भिन्नता दिखाई है, संभवतः संख्या और बायोटिन-स्ट्रेपटाविडिन तार अंक और प्रत्येक VWF अणु18के आणविक वजन के स्थान में व्यापक वितरण द्वारा समझाया । फिलहाल, हम जिस विधि से पेश हैं, वह तार बिंदुओं और आणविक आकार को परिभाषित नहीं कर सकती । हालांकि, वांग एट अल द्वारा प्रकाशित एक मोटे दानेदार VWF मॉडल के ब्राउनियन गतिशीलता सिमुलेशन इन चर को शामिल करें और इस तरह के बदलाव18की व्याख्या करने के लिए प्रयोगात्मक निष्कर्षों के साथ चलाया जा सकता है । इसके अलावा, जब सिरिंज पंप बंद हो जाता है, तो प्रवाह तुरंत बंद नहीं होता है, गतिशीलता को पीछे हटाने के अवलोकन को भ्रमित करता है। यह अभीष्ट प्रवाह अवधि के दौरान पीडीएमएस चैनल के विरूपण और मामूली फैलाव के कारण है। जब पंप बंद हो जाता है, तो तरल पदार्थ तब तक प्रवाहित होता रहता है जब तक कि पीडीएम पूरी तरह से आराम न कर दे। एक बेहतर प्रणाली को कठोर प्लास्टिक सामग्रियों में निर्मित अधिक कठोर पीडीएफ एमडीएस या माइक्रोचैनलका उपयोग करना चाहिए, जिससे तरल पदार्थ 0एस-1 कतरनी दर तक अधिक तेजी से पहुंच सकता है। अंत में, कोई भी केवल उन अणुओं को हल कर सकता है जिनका आकार फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल संकल्प के रूप में परिमाण के समान क्रम पर है, जो कुछ सौ नैनोमीटर से छोटा नहीं हो सकता है। इस प्रकार, अणुओं के लिए न्यूनतम आकार की आवश्यकता है जिसे सीधे इस विधि के साथ देखा जा सकता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल मुख्य रूप से शारीरिक प्रवाह के तहत प्रोटीन और डीएनए अणुओं के संरचना परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित करने से संबंधित है । हालांकि, इस विधि का उपयोग जैविक अणुओं के बीच वास्तविक समय की बातचीत की कल्पना करने और प्रोटीन और डीएनए फ़ंक्शन को और अधिक विशेषता देने के लिए भी किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, फू एट अल ने दिखाया है कि सीमित VWF उच्च कतरनी प्रवाह के तहत सक्रिय हो सकता है और आगे अलग प्रवाह की स्थिति17के तहत प्लेटलेट आसंजन अणु GPIbα पर कब्जा कर सकते हैं । यह बाध्यकारी घटना तब भी संरक्षित है जब वीडब्ल्यूएफ बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन लिंकेज द्वारा सतह से बंधा हुआ है, जो शारीरिक रूप से प्रासंगिक कार्यों और यांत्रिकी17का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता का प्रदर्शन करता है। इसी तरह की मशीनी अंतर्दृष्टि प्राप्त की जा सकती है , जबकि प्रवाह वातावरण में सुलझाया डीएनए और नियामक प्रोटीन के बीच बातचीत का अध्ययन21,22. इसके अतिरिक्त, हमारी विधि ज्यादातर मैक्रोअणुओं में संरचना परिवर्तन ों को देखने से संबंधित है। फिर भी, कोई भी इसे छोटे अणुओं का अध्ययन करने के उद्देश्य से अनुकूलित कर सकता है जो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत हल होने के लिए काफी बड़े हैं। उदाहरण के लिए, एक छोटे अणु को बहुत बड़ा, स्थिर लैम्ब्ड डीएनए में संलग्न करके, कोई भी छोटे अणु की कतरनी-संवेदनशीलता को बढ़ा सकता है और अधिक आसानी से इसके व्यवहार का निरीक्षण कर सकता है। निष्कर्ष में, एएफएम या ऑप्टिकल चिमटी जैसे अन्य एकल-अणु लक्षण वर्णन विधियां, मैक्रोअणुओं के संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटा प्रदान करती हैं; हालांकि, ये वैकल्पिक तरीके प्रोटीन और डीएनए के गतिशील, संरचनात्मक परिवर्तनों का पालन नहीं कर सकते हैं जो शारीरिक प्रवाह वातावरण में होते हैं, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया गया है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान DMS-1463234, राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान HL082808 और AI133634, और Lehigh विश्वविद्यालय आंतरिक वित्तपोषण द्वारा भाग में समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Labeling Kit Invitrogen A30006
Bio-Spin P-6 Gel Columns Bio-Rad 7326221
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Use as free biotin in Step 5.6
Biotin-14-dCTP AAT Bioquest 17019
BSA-Biotin Sigma-Aldrich A8549
Coverslips VWR 48393-195 No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP Set Invitrogen 10297018
Float Buoys for Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69588
Klenow Fragment (3'→5' exo-) New England BioLabs M0212S Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2
Lambda DNA New England BioLabs N3011S
Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69570 10K MWCO, 0.1 mL volume
NEBuffer 4 New England BioLabs B7004S
NHS-PEG4-Biotin Thermo Scientific 21330
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase Sigma-Aldrich P8279
Protocatechuic acid Santa Cruz Biotechnology sc-205818
Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication The Dow Chemical Company 4019862
Streptavidin Sigma-Aldrich 85878
The Blocking Solution CANDOR Bioscience 110 050 Use as casein blocking solution throughout protocol
Vinyl Cleanroom Tape Fisher Scientific 19-120-3217
von Willebrand Factor, Human Plasma Millipore Sigma 681300
YOYO-1 Dye AAT Bioquest 17580
0.25 mm Inner Diameter Tubing Cole-Parmer EW-06419-00
25 Gauge Needle Thomas Scientific JG2505X

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References

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फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ कतरनी प्रवाह के तहत एकल अणु संरचना परिवर्तन की विशेषता
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Pisapati, A. V., Wang, Y., Blauch, M. E., Wittenberg, N. J., Cheng, X., Zhang, X. F. Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60784, doi:10.3791/60784 (2020).

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