Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

אפיון מולקולה חד-מולקולות באמצעות זרימת הטיה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית

Published: January 25, 2020 doi: 10.3791/60784
Automatic Translation
1, *2, *3, 3, 1,2, 1,4
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University
* These authors contributed equally

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לשתק קרו יחיד במכשירים מיקרופלואידים וכביכמת שינויים בקונמציות שלהם תחת זרימת הטיה. פרוטוקול זה שימושי לאפיון המאפיינים הביומכאני והפונקציונלי של biomolecules כגון חלבונים ו-DNA בסביבת זרימה.

Abstract

התנהגות מולקולה בודדת תחת הפרטורציה מכנית התאפיין באופן נרחב בהבנת תהליכים ביולוגיים רבים. עם זאת, שיטות כגון מיקרוסקופ של כוח אטומי יש ברזולוציה מוגבלת בזמן, בעוד Förster העברת אנרגיה (לדאוג) רק לאפשר את התצורות להיות משתמעת. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית, מצד שני, מאפשר בזמן אמת הדמיה באתרו של מולקולות יחיד בתנאי זרימה שונים. הפרוטוקול שלנו מתאר את השלבים ללכידת שינויים בbiomolecules בודדים תחת סביבות זרימת הטיה שונות באמצעות מיקרוסקופ קרינה. זרימת ההטיה נוצרת בתוך ערוצי microflu, ונשלטת על ידי משאבת מזרק. כמו הפגנות של השיטה, וון וילבלאנד מקדם (vwf) ו-DNA למדא מתויגים עם ביוטין ו fluorophore ולאחר מכן לקיבוע על פני הערוץ. הקונמציות שלהם מנוטרים ברציפות באמצעות הטיה משתנה באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת (TIRF) ומיקרוסקופ מיקרומוקד. הדינמיקה להתיר הפיך של VWF הם שימושיים להבנת כיצד תפקידה מוסדר בדם האדם, תוך היווצרות של DNA למדא מציע תובנות לביופיזיקה של קרו. הפרוטוקול יכול גם להיות מיושם באופן נרחב כדי ללמוד את ההתנהגות של פולימרים, במיוחד biopolymers, בתנאי זרימה שונים לחקור rheology של נוזלים מורכבים.

Introduction

מנגנונים של כמה biomolecules להגיב לגירויים סביבתיים נחקרו רבות. בסביבת זרימה בפרט, הטיה והכוחות הelongational מווסת את השינויים המומסבותית והעלולים לתפקד כbiomolecules. דוגמאות טיפוסיות כוללות להטות המושרה לאחר למבדה DNA ו פון Willebrand פקטור (VWF). DNA למדא שימש כלי כדי להבין את הדינמיקה של הפרט, שרשראות פולימר גמיש ו rheology של פתרונות פולימריים1,2,3,4. VWF הוא חיישן זרימה טבעי כי אגרגטים טסיות באתרי הפצע של כלי הדם עם שיעורי גזירה חריגים דפוסי זרימה. להתיר של VWF חיוני בהפעלת האיגוד של טסיות לתחום A1 וכריכת קולגן לתחום A3. בנוסף, גבוהה המושרה להטות את התחום A2 התגלגלות מאפשר את המחשוף של vwf, אשר מווסת את התפלגות המשקל המולקולרי שלה במחזור5,6. כך, הדמיה ישירה של איך אלה מולקולות להתנהג תחת זרימה יכול לשפר מאוד את ההבנה הבסיסית של הביומכניקה שלהם ותפקוד, אשר בתורו יכול לאפשר אבחון הרומן ויישומים טיפוליים.

מתודולוגיות טיפוסיות לאפיון הקונמציות חד-מולקולות כוללות פינצטה אופטית/מגנטית, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ומולקולה חד-שגרתית של העברת אנרגיית תהודה (סריג)7. מולקולה בודדת ספקטרוסקופיית כוח הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור את הכוח ואת התנועה הקשורים השינויים הקונפורבית של biomolecules. עם זאת, היא חסרה את היכולת למפות הקונמציות מולקולריות הכולל8. Afm מסוגל הדמיה עם רזולוציה מרחבית גבוהה אבל הוא מוגבל ברזולוציה הטמפורלית9,10. בנוסף, קשר בין העצה לבין המדגם עשוי לבלבל את התגובה הנגרמת על ידי זרימה. שיטות אחרות כמו nanopore וניתוחים לקבוע קיפול חלבון יחיד מולקולה ומדינות התפתחות מבוסס על זיהוי של מרחק מולקולרי מתוך וכולל כמויות. עם זאת, שיטות אלה עדיין בחיתוליו ומוגבלות בהתבוננות ישירה של קונמציות בודדות של מולקולה אחת11,12,13,14.

מצד שני, התבוננות ישירה בקרו באמצעות הזמן הגבוה והרזולוציה המרחבית תחת מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית השתפרה בהבנת הדינמיקה של מולקולה בודדת בתהליכים ביולוגיים רבים15,16. לדוגמה, פו et al. לאחרונה השיגה ויזואליזציה סימולטני של התארכות VWF ומחייב קולטן טסיות בפעם הראשונה. בעבודתם, מולקולות VWF היו מנוכי על פני השטח של ערוץ microflu, באמצעות האינטראקציות biotin-streptavidin והתמונה תחת סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ (TIRF) בסביבות משתנות זרימת הטיה17. החלת שיטה דומה כמו פו של, אנחנו כאן להפגין כי קונמציות של VWF ו-DNA למדא ניתן לראות ישירות תחת השני TIRF ו-מיקרוסקופ הקונטמוקד. בדומה למוצג באיור 1, התקנים מיקרופלואידים משמשים ליצירה ולבקרה של זרימת הטיה, וbiomolecules מנודים על פני הערוץ. עם היישום של שיעורי גזירה שונים, תצורות של מולקולה זהה נרשמות למדוד את אורך ההארכה, המוצג גם באיור 1. השיטה יכולה להיות מיושמת באופן נרחב כדי לחקור התנהגויות פולימר אחרות מתחת לסביבות זרימה מורכבות עבור מחקרים מרטילוגיים וביולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת VWF

  1. מהווים מחדש את VWF פלזמה האדם כדי להכין אותו לתגובות תיוג. הוסף 100 μL של מים מוהים (DI) כדי 100 μg של VWF ה, והוא ליצור 1 mg/mL פתרון מניות VWF.
  2. Dialyze VWF פתרון מניות על מנת להסיר גליצין עודף, ובכך להגדיל את היעילות ביוטין ו fluorophore.
    1. העברת 50 μL של פתרון מניות VWF לתוך יחידת דיאליזה של 0.1 mL עם משקל מולקולרי של 10,000 לגזור וחותם עם כובע. אחסן את פתרון המניה הנותר ב-20 ° c. מניות VWF יהיה יציב עד 1 שנה ב-20 ° c.
    2. הפעל דיאליזה ב 500 מ ל של 1x סטרילי מואגור פוספט מלוחים (PBS) (0.01 m ניתרן פוספט, 0.0018 מונואוטאסיניום פוספט, 0.0027 m אשלגן כלוריד, 0.137 m נתרן כלוריד, pH 7.4 ב -25 ° c) עבור 1 h ב 4 ° c עם מקצב איטי. חזור על דיאליזה במשך שעה נוספת באמצעות 500 mL של PBS טרי.
  3. . התחילו בתגובת הביוטין לתיוג הכינו פתרון 2 מ"מ של ביוטין4-biotin על ידי המסת מוצק במים DI מיד לפני התגובה. המאפשר לארגוןהחברה להישאר במים למשך זמן ממושך יגרום לקבוצת הביולידזה לhydrolyze, ובכך להקטין את יעילות התיוג.
    1. הוסף 2.5 μL של 2 מ"מ-ביוטין4-biotin ליחידת הדיאליזה המכילה את פתרון המניה vwf. זה יגרום העודף הטוחנת של 20 מקפלים של ביוטין לעומת vwf monomers. אמינים הראשי של vwf יגיב עם הקבוצות של מדינת-אסתר, ובכך מחייב באופן כושל לקבוצות יתד4-biotin באמצעות קישור הגילאים אמיד.
    2. מניחים את יחידת הדיאליזה בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. אטום את יחידת הדיאליזה. עם הכובע המתאים תאבטח את הרכבת הדיאליזה. עם פארפilm לשמור זקוף ולצאת בטמפרטורת החדר עבור 40 דקות.
  4. התחל לתייג את תגובת התיוג. להכין פתרון 2.8 mM של אלקסה 488 הטטרלוקסיל-אסתר (TFP-אסתר) צבען פלורסנט (עירורmax = 498 nm, פליטהmax = 519 nm) על ידי המסת fluoropהור מוצק ב-DI מים. עשה זאת מיד לפני התגובה כדי למנוע את קבוצת TFP-אסתר מהידרוליזינג.
    1. הוסף 2.9 μL של 2.8 mM 488 fluorophore ליחידת דיאליזה. זה יגרום העודפים מתקפל 34 העודף של פלואורואופפור לעומת VWF monomers. אמינים הראשי הנותרים של vwf יגיב עם הקבוצות tfp-אסתר, ובכך מחייב באופן כושל fluorophores באמצעות קישור הגילאים אמיד.
    2. הוסף 2.0 μL של 1 M נתרן ביקרבונט (מומס במים DI) ליחידת דיאליזה. זה מתאים את ה-pH של התגובה קרוב 8.0, אשר מגביר את היעילות של התגובה TFP-אסתר ואת תגובת האמין העיקרי.
    3. אבטח את יחידת הדיאליזה בשפופרת מיקרוצנטריפוגה בדיוק כמו בשלב 1.3.2. חנות בחושך כדי למנוע הלבנה ולצאת בטמפרטורת החדר עבור 1 h ו 30 דקות.
  5. מניחים את יחידת הדיאליזה ב 900 מ ל של 1x מעוקר ו dialyze לילה ב 4 ° c. זה תניב כ 70 μL של שכותרתו VWF בריכוז של 0.71 mg/mL או 2.84 μM (ריכוז מונומר).
  6. העברה מתויג VWF לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. כסו את הצינור ברדיד אלומיניום והגנו מפני אור. חנות ב -4 ° c. לאחסון לטווח ארוך, הוסף הסוכן האנטי מיקרוביאלית נתרן אזיד לריכוז הסופי של 0.02% (w/v).
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

2. הכנת דנ א למדא

  1. בbiotinylate אוחר למדא DNA על ידי מילוי אתרי הקצה המלוכדת שלה (cos אתרים) עם biotin-14-dCTP נוקלאוטידים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, חוזר כאן בשלב 2.118. מלא את שאר אתרי cos עם dATP, Dטרומבוציטופניה ו-dGTP נוקלאוטידים.
    1. להכין פתרונות 1 מ"מ של dATP, Dטרומבוציטופניה, dGTP ו biotin-14-dCTP במאגר התגובה 10x (500 mM נתרן כלוריד, 100 mM טריס הידרוכלוריד, 100 מ"מ מגנזיום כלוריד, 10 מ"מ dithioitol, pH 7.9 ב -25 ° c).
    2. מקום 48 μL של 500 ng/μL למדא DNA בצינור ה-PCR וחום של 5 דקות ב-65 ° c. אתרי cos של ה-DNA למבדה מעגלי יהיה להפריד תחת החום, להפוך את המולקולה ולעשות בודד תקוע החוצה מוכן לביוטילציה. מיד לאחר מכן, המקום על הקרח כדי למנוע מאתרי כי מחדש ריפוי.
    3. הוסף 5 μL מ-1 מ"מ dATP, Dטרומבוציטופניה ו-dGTP ו-4 μL של ביוטין 1 מ"מ-14-dCTP ל-DNA של למדא. גם להוסיף 2.5 μL של 5 U/μL Klenow מקטע (3 ' à5 ' exo-) כדי לזרז את סינתזה ה-DNA.
    4. מודב את תערובת התגובה 1 h ב 37 ° c.
    5. הוסף 1.2 μL של 0.5 M EDTA. ואז לחמם את תערובת התגובה עבור 5 דקות ב 70 ° c. זה יהפוך את הKlenow. לתגובת הביוטילציה
  2. הסרת נוקלאוטידים העודפים מ-DNA למדא באמצעות עמודת ספין שיכולה להכיל 10-70 μL ויש לו משקל מולקולרי 6,000 לגזור.
    1. הצב את הטור בתוך צינורית מיקרוצנטריפוגה של 2 מ ל. צנטריפוגה את העמודה ואת הצינור ב 1000 x g עבור 2 דקות. להיפטר זרימה-דרך זה אוספת בצינור.
    2. החלף את מאגר העמודות בפתרון 1x של אותו מאגר תגובות משלב 2.1.1. עשה זאת על-ידי הוספת 500 μL של מאגר 1x לעמודה. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 1000 x g. . היפטרו מהזרימה חזור על הפעולה 2 פעמים נוספות כך שסכום כולל של 1500 μL נוסף לעמודה.
    3. מקם את העמודה בשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. הוסף בזהירות את הפתרון משלב 2.1.5 לשכבה העליונה של העמודה. צנטריפוגה עבור 4 דקות ב 1000 x g.
    4. לאסוף את הזרימה-through (40-70 μL) מצינור המיקרוצנטריפוגה והמקום בצינור ה-PCR. זה מכיל את הדנ א. הטהור, הביוטיליס למדא
  3. תווית למדא DNA עם הפלורסנט YOYO-1 צבע (עירורמקסימום = 490 nm, פליטהmax = 509 nm) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, חוזר כאן בשלב 2.3.120.
    1. הכינו פתרון של הצבע YOYO-1 ו-DNA למדא עם צבע כדי הבסיס זוג היחס טוחנת של 1:10. נניח שאף דנ א אבד בשלב הטיהור כדי לחשב את הריכוז זוג בסיס של דנ א למדא. DNA למדא באורך מלא יש 48,502 זוגות בסיס.
      הערה: לדוגמה, אם 50 μL של הפתרון התאושש משלב 2.2.4, הוסף 7.4 μL של 500 μM YOYO-1 צבע.
    2. לחמם את הפתרון 2 h ב 50 ° c בחשיכה כדי להשלים את התגובה.
    3. כסו את הצינור ברדיד אלומיניום והגנו מפני אור. חנות ב -4 ° c. הפתרון הוא כעת מוכן להיות מוזרק לתוך התקנים microfluidic.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

3. יצירת בתבניות ערוץ מיקרופלואידידים בסיליקון וופל

  1. השתמש בפוטוגרפיה כדי ליצור ערוצי microflu, עם מידות מתאימות (איור 2) על מאסטר סיליקון וופל על פי פרוטוקולים סטנדרטיים19.

4. הכנת מכשיר מיקרופלואידיז (PDMS) פולימיקרומיתיל

  1. הוסף 5 חלקים סיליקון אלסטומר בסיס לחלק 1 ריפוי סוכן (על ידי מסה) בסירה שוקלים. מערבבים את התוכן ביסודיות עבור 1 דקות כדי ליצור פתרון מוקדם לריפוי PDMS.
  2. מניחים את המאסטר סיליקון וופל בצלחת פטרי מפלסטיק. יוצקים את הפתרון PDMS על וופל כדי ליצור שכבה 5 מ"מ. לכסות את הצלחת ולהשאיר desiccator תחת ואקום עבור 1 h כדי להסיר בועות אוויר.
  3. דגירה מכוסה צלחת פטרי ב 60 ° c לילה כדי לרפא PDMS לתוך מוצק גמיש. אשפרה תגרום לערוצי המיקרופלואידים היצוקים ב-PDMS בממשק ה-PDMS-וופל.
  4. חותכים 20 x 10 מ"מ מלבנים לתוך PDMS, סביב כל ערוץ מיקרופלואידיג, באמצעות תער. הסר את אבני PDMS מלבני עם מספריים.
  5. השתמש 25 גרם מחט בוטה עם קצוות מחודדים אגרוף חור 0.5 מ"מ בקוטר בקצה אחד של הערוץ, וודא החור עובר לחלוטין דרך בלוק PDMS (איור 2). השתמש מחט דקה אגרוף החוצה PDMS מן החור. חזור על הפעולה בקצה השני של הערוץ. זה יהיה ליצור מפרץ ומשקע לזרום דרך הערוץ.
  6. נקה את פני השטח של לחסום PDMS עם קלטת חדר נקי ויניל. לפוצץ גז חנקן דחוס מעל No. 1 1/2, 22 x 50 מ"מ coverslip כדי להסיר פסולת.
  7. מניחים את הבלוק PDMS עם צד הערוץ למעלה ואת שמיכות לתוך החדר של מכונת מליטה פלזמה. . התחילו את הטיפול
  8. כאשר הטיפול הושלם, במהירות למקם את לחסום PDMS על שמיכות כך הערוץ הוא במגע עם slip. הפעילו לחץ לאורך קצות הבלוק. הצב את ההרכבה coverslip-PDMS על צלחת חמה ב 115 ° c עבור 15 דקות כדי לחזק את הקשר הקבוע.
  9. הוסף 10 ס"מ-ארוך, 0.25 מ"מ בקוטר צינור פנימי לתוך חור השקע בחלק העליון של בלוק PDMS. הדבר מאפשר לנוזלים לזרום בקלות אל מחוץ לערוץ. . המתקן הושלם כעת

5. טיפול במשטח המכשיר המיקרופלואידיג

  1. הכנס < 10 μL של 10 μg/mL סרום ביולוגי חלבון אלבומין (BSA-biotin) הומס ב-1-PBS סטרילי לתוך הפרץ של התקן microfluidic עבור ניסויים VWF. הכנס < 10 μL של 1 מ"ג/mL BSA-biotin עבור ניסויים למדא DNA. מעכב כמה מיקרוליטר של BSA-biotin בקצה הפיפטה לאחר ההזרקה ולאפשר את הקצה להישאר מוטבע בתוך הים.
    1. שמרו תמיד על droplet של. מים מסביב לקצה זה ימנע בועות אוויר להיכנס לערוץ. החל טכניקה זו בכל פעם שפתרון חדש מוזרק לערוץ.
    2. אפשר BSA-biotin כדי דגירה במכשיר עבור 2 h. ה-BSA לא ייאגד במפורש למשטח הכיסויים (איור 3א).
  2. . הסר את קצה הפיפטה הכנס < 10 μL של פתרון לחסימת קזאין לתוך הערוץ ואפשר לו לעבור את המיקון למשך 30 דקות. הקזאין תחסום את כל האתרים החופשיים, ויפחית את הכבילה הbiomolecules לפני השטח (איור 3ב').
  3. הסר את העצה והזרק < 10 μL של 10 μg/mL streptavidin מומס ב-1x סטרילי לתוך הערוץ עבור ניסויים VWF. השתמש 100 μg/mL streptavidin עבור ניסויים למדא DNA. . מודטה למשך 10 דקות הstreptavidin ייאגד לקבוצות הביוטין של bsa-ביוטין (איור 3ג).
  4. הסר את העצה והזרק < 10 μL של פתרון ניקוי של 1 x (0.05% הרצף 20 ב-PBS) לתוך הערוץ כדי לשטוף את עודפי הstreptavidin.
  5. הסר את העצה והזרק < 10 μL של 28.4 ננומטר VWF מדולל בפתרון קזאין או DNA למדא משלב 2.3.3. מודטה VWF עבור 3 דקות. מודונט למדא DNA עבור 45 דקות (איור 3ד).
  6. הסר את העצה והזרק < 10 μl של 5 מילימטר ביוטין מדולל בתמיסה של קזאין. ביוטין חינם יחסום אתרי קשירה streptavidin עודפים על משטח הערוץ (איור 3E).

6. המחשה של VWF ו-DNA למדא תחת מיקרוסקופ קרינה

  1. הכינו 1 מ ל של פתרון לחסימת קזאין עם 2.2 מ"מ protocatechuic חומצה ו 37 nM protocatechuate-3, 4-diחמצון (כדי למזער את הלבנת התמונות). לטעון למזרק ולאבטח. במשאבת מזרק לקחת 30 ס"מ ארוך, 0.25 מ"מ בקוטר צינור פנימי ולצרף קצה אחד למחט המזרק. זרימה בתמיסה כדי להסיר בועות אוויר. הצמד את הקצה השני של הצינורית אל השקע של התקן microfluidic. מומלץ לעשות זאת 3 דקות לאחר שלב 5.6.
  2. בחר את מטרת ההגדלה הגבוהה ביותר (כלומר, 60-100X) של השתקפות פנימית מוחלטת (TIRF) או מיקרוסקופ ממוקד לקרינה פלואורסצנטית. להוסיף טיפת שמן טבילה על המטרה שלו במידת הצורך. מניחים את המכשיר microflu, מיקרופלואידים על הבמה במיקרוסקופ, כך הכיסויים מחליק עם המטרה.
  3. . תתחיל לעשות מיקרוסקופ ברייטפילד כוונן את המיקוד כך שכל התכונות, כגון פסולת ובועות, גלויות. לאחר מכן, כוונן את השלב בכיוון X ו-Y עד שקצה הערוץ המיקרו-פלואידיי גלוי וחוצה את המסגרת.
  4. מעבר לערוץ 488 (FITC). להתאים את רמת Z ואת זווית TIRF לפי הצורך עד בודדים ירוק, מולקולות כדורית ניתן להבדיל. אלה הם או המולקולות של VWF או DNA למדא.
  5. כוונן את זמן החשיפה ואת עוצמת הלייזר כדי להמחיש מולקולות פלורסנט מבלי לצלם אותם מהר מדי. להתאים את הניגודיות גם להמחיש מולקולות באופן ברור יותר.
  6. התחילו לזרום ממשאבת המזרק כך שפתרון חסימת הקזאין יזרום לתוך התעלה ומחוץ לשקע. לעשות את זה בדיוק 5 דקות אחרי שלב 5.6. לעצור ולהתחיל לזרום כדי להתבונן בשינויים ביצירת מולקולות. בעת החלת זרימה, שימוש בתעריפי השימוש בין 5,000 ל-30,000 μL/h. חזור על פעולה זו לאורך האזורים השונים של המכשיר המיקרו-פלואידיג. המשך תהליך זה כדי לאתר מולקולות שיכולות להאריך ולהירגע על מחזורים מרובים של הפסקה והתחלת זרימת.
  7. שים לב כמה זמן לוקח עבור מולקולות להגיע הארכה מקסימלית ולהירגע לחלוטין לתוך globules. הקלטת קטעי וידאו של התנהגות רציפה של מולקולות תחת זרימת הטיה, בחירת זמן החשיפה הטוב ביותר, תדירות חשיפה ומשך וידאו אשר ללכוד את הטווח המלא של התנהגות ההארכה ולמזער photobleaching לבנה.
  8. שמור את הסרטונים בשם. קבצי AVI עם scalebar.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

7. ניתוח תמונה של התאמות שינויים

  1. Symbol 1חישוב קצב ההטיה של הקיר () שהוחל על קרו באמצעות קצב הזרימה (Q) והגובה (h) והרוחב (w) של ערוץ המיקרו-פלואידיג המלבני. השתמש במשוואה הבאה כדי לעשות זאת:
    Equation 1
  2. קבע את אורך כל הסמנים תחת שיעורי ההטיה השונים באמצעות קוד MATLAB מותאם אישית (ראה קבצים משלימים). צור תיקייה שכותרתו ניתוח וידאו הכולל את קודי MATLAB הבאים: main. m, save_each_frame מ, get_length. m וget_length תאנה צור תיקיית ממשנה בתוך ניתוח סרטי וידאו שכותרתו ' סרטי וידאו ' והוסף. קבצי AVI שיש לנתח לתוך זה.
  3. פתח את main. m באמצעות MATLAB 2019a ולהפעיל את הקוד. הקלד את שם קובץ הווידאו שיש לנתח בחלון הפקודה תחת נא הזן את קובץ הנתונים לניתוח:.
  4. בממשק המשתמש הגרפי הפתוח (GUI), קבע את הסף (טקסט בתיבה בקצה הימני העליון של החלון) עד 20 ולחץ על לחצן הסף הקבוע כדי לאשר.
  5. השתמשו בסמן נתונים בסרגל הכלים העליון של החלון כדי לבחור פיקסל אחד בכל מקום בסרגל הסרגל. לחץ על נקודת התחלה במקטע סרגל שינוי קנה מידה שבצד החלון. מיקום (x, y) של הפיקסל הנבחר יופיע מימין ללחצן. לחץ על לחצן גודל פיקסל (μm) . גודל הפיקסל צריך להיות נמדד פעם אחת בלבד בכל וידאו.
  6. לבחור פיקסל כלשהו על המולקולה של עניין. לחץ על נקודת ההתחלה בסעיף vwf . לאחר שהמיקום של הפיקסל הנבחר מופיע בתיבת הטקסט שמשמאל, לחץ על קצה שמאלי, קצה ימני ומחרוזת כדי לקבל את האורך המולקולרי בתמונה.
    הערה: ניתן להשתמש בשלב זה כדי לנתח את השינויים הקונספורמציה של כל ביואואלי, למרות הקוד בעל מקטע מסוים בשם Vwf.
  7. בדוק את הקצה השמאלי והימני של המולקולה. התקרבות והשתמש בסמן הנתונים כדי לבדוק את מיקום הפיקסל של הריבית. בחר באופן ידני את הפיקסל כסוף וחשב מחדש את האורך (בפיקסלים) בעת הצורך.
  8. הקלט את גודל הפיקסל ב-יקרומטר ובאורך המחרוזת במספר הפיקסלים לתוך גיליון Excel וחשב את אורך המחרוזת ב-יקרומטר.
  9. חזור על השלבים שלעיל עבור כל תמונה. השתמש אחרון, לחצן הבא בפינה הימנית התחתונה של GUI כדי לעבור בין תמונות באותו קובץ וידאו. לחץ על קרוב כדי לסגור את חלון GUI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

צפייה בהתנהגות הדינמית של biomolecules כגון VWF ו-DNA למדא הוא תלוי מאוד במיטוב הכריכה שלהם למשטח המכשיר. הטיפול במשטח המים המומלץ במכשיר המיקרו-פלואידיג חיוני להשגת מחייב עם כמה נקודות מעגן, כך שמולקולות יכולות להאריך ולהירגע על הזרימה המשתנה. אם החלבונים או הדנ א מאוגדים חזק מדי עם קישורים מרובים, הם מתרחבים לאורכים מוגבלים או לא להאריך בכלל. זה מתרחש במיוחד עם vwf כאשר הוא נשאר ללא זרימה על פני שטח המכשיר עבור יותר מ 3 דקות לפני חסימת ביוטין חינם. Vwf ארוך יותר נשאר על פני השטח קפואה, הקבוצות ביוטין יותר vwf לאגד את פני השטח streptavidin קבוצות ואת הגמישות פחות המולקולה יש לפענח. אם מולקולות מאוגדות חלש מדי, מצד שני, הם להתנתק על הזרימה ונעלמים מן הנוף. זה יכול להתרחש אם VWF או DNA למדא היא מודלת עבור קצר מדי של תקופות, גורם למעט מדי אינטראקציות biotin-streptavidin לטופס. מולקולות יכול גם לשבור בחינם כאשר שיעורי הטיה גבוהה מאוד (> 200000 s-1) מוחלים, היחלשות האינטראקציות biotin-streptavidin.

מולקולה אידיאלית מאגד במידה כזו כי הוא יכול לפתור ולהירגע על מחזורים מרובים של הפסקת ולהתחיל לזרום. הגמישות של מולקולה לשנות היווצרות כגון זה מוצג לעתים קרובות על ידי יכולתה להאריך להגדיל את האורכים ככל שקצבי ההטיה גבוהים יותר מוחלים בתוך מגוון של זרימה גוברת. תמונות של VWF השיג עם מיקרוסקופ TIRF להפגין את הקשר הזה בווידאו 1. השלוחה לעומת עקומת קצב ההטיה של מולקולה VWF זהה באיור 4 בדיוק לוכדת את התנהגות המושרה הנגרמת של מולקולה vwf והוא שימושי לאפיון המאפיינים הביומכנית של החלבון. תמונות של למדא DNA שהתקבלו עם מיקרוסקופ מיקוד ממוקד באופן דומה להראות הרחבה מוגברת על שיעורי גזירה גבוהים יותר הרפיה הדרגתית על 2 דקות, כפי שנלכד וידאו 2 ו- video 3. המאפיינים המדניים של ה-DNA למדא לאחר הפסקת הזרימה מיוצגים גם באופן גרפי באיור 5.

Figure 1
איור 1: תרשימים של ניסוי מולקולה בודדת בערוץ מיקרופלואידיג במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. משטח הערוץ מצופה ב-BSA-biotin ונחסם בקזאין. Streptavidin הוא מאוחד עם ביוטין על משטח הערוץ גם ביולוגית vwf/DNA למדא ו-דנ א לשתק מולקולות יחיד על פני השטח. ככל שקצב ההטיה עולה מ- C, המולקולה נמתחת ממצב מקופל למצב מוארך לאורך כיוון הזרימה משמאל לימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ממדי ערוץ מיקרופלואידיג. הצורה והמבנה של התקן מיקרופלואידיג PDMS מוצגים יחד עם ממדי הערוץ. הערוץ הוא 50 יקרומטר בגובה וטווחים מ 0.1 ל 1.0 mm ברוחב. אזור הצמצום באמצע הערוץ הוא 0.7 מ"מ באורך. כניסת הים והשקע הם 0.5144 מ"מ (25 G) בקוטר. כיוון הזרימה הוא משמאל לימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שלבי הטיפול בפני השטח לצורך השתק מולקולה אחת. כל השלבים מתרחשים בטמפרטורת החדר. (א). bsa-biotin מצופה על פני השטח עבור 2 h. (ב). הקזאין מוזרק לתעלה במשך 30 דקות כדי לחסום את פני השטח. (ג). Streptavidin מודב בערוץ במשך 10 דקות כדי לאגד עם bsa-biotin. (ד). לאחר שטיפת מולקולות עודפות בצעדים לשעבר, fluorophore ו ביוטין התווית vwf/למדא DNA הוא מוזרק לתוך הערוץ ומלא קיבוע באמצעות התחברות עם streptavidin. (E). ביוטין חינם הוא זרם, חסימת אתרי קשירה streptavidin נוספת כדי למזער את ההפרעה שלה עם המולקולה במהלך שינויים התאמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: התנהגות ההארכה של VWF תחת זרימת הטיה. המולקולה הפיכה בתהודה ב -7 קצבי הטיה שונים: 0 s-1, 33,333 s-1, 66,667 s-1, 100,000 s-1, 133,333 s-1, 166,667 s-1 ו-200,000 s-1. אורך של המולקולה מתוח עולה מ 0.52 יקרומטר באפס קצב הטיה ל 3.44 יקרומטר ב 200,000 s-1 הטיה קצב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: התנהגות הרפיה של ד. נ. א למדא לאחר הטיית זרימה מפסיק. זרימה עם 33,000 s-1 ו 66,667 s-1 הטיה שיעורי מוחלים מ -0 אל 30 לאותה מולקולה. הרפיה מוקלטת מ-30 עד 150 s. ב 66,667 s-1 להטות קצב, מולקולת ה-DNA תארכת כדי 15.00 יקרומטר ומרגיע חזרה 5.83 יקרומטר לאחר הזרימה הופסק עבור 2 דקות. ב 33,333 s-1 להטות קצב, המולקולה מרחיב רק 8.75 יקרומטר והוא 3.33 יקרומטר באורך לאחר 2 דקות של הרפיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Video 1
וידאו 1: להפוך הפיך של VWF תחת הגדלת קצב ההטיה באמצעות סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ (TIRF). המולקולה באמצע התצוגה ההפיכה לאורך שונה בקצב הטיה 33,333 s-1, 66,667 s-1, 100,000 s-1 ו 133,333 s-1. משאבת מזרק משמשת לשליטה בקצב הזרימה שממנו מחושבים קצבי ההטיה. כיוון הזרימה הוא משמאל לימין. תמונות נלקחים עם מרווחי 15 s כדי לאפשר תהליכי הרפיה והארכה מלאה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Video 2
וידאו 2: הרפיה של למדא DNA אחרי 33,333 s-1 להטות קצב. תמונות מצולמות תחת. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית ה-DNA של למדא נמתח תחת 33,333 s-1 להטות את הזרימה וברוגע בחזרה למדינה מקופלת לאחר הזרימה נעצרה ב -30 ס. משך ההרפיה הוא 2 דקות. כיוון הזרימה הוא משמאל לימין. תמונות נלקחים עם מרווחי של 30 באמצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Video 3
וידאו 3: הרפיה של למדא DNA לאחר 66,667 s-1 להטות קצב. ההגדרות זהות לאלה שבווידאו 2 למעט קצב ההטיה ההתחלתי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

קבצים משלימים: קודי MATLAB. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי להשיג נתונים באיכות גבוהה של מולקולה בודדת שינויים באמצעות מיקרוסקופ הזריחה כפי שמתואר בשיטה זו, זה קריטי כדי לסקול את המולקולה למשך הזמן המתאים, למזער את האינטראקציות הלא ספציפיות שלה עם פני השטח ולבסס הגדרות מיקרוסקופ הפחתת הלבנת התמונות. היכולת של המולקולה לשנות באופן חופשי את הקשר למספר האינטראקציות הביוטין-streptavidin שנוצרו בין המולקולה לפני השטח. כפי שהוזכר קודם לכן, זה חייב להיות נשלט על ידי הדגירה של המולקולה ללא זרימה למשך הזמן המתאים. בנוסף, חלבון או DNA יכול לאגד באופן ספציפי כדי coverslip אם coverslip לא נחסם ביעילות. ללא פתרון החסימות המומלץ, מולקולות יכולות להצמיד לזכוכית שאינן מפורשות ולהגיב לכל שיעור זרימה שהוחל. החלת בלוק הקזאין במהלך הטיפול בפני השטח המוקדם ושמירה על נוכחותה במהלך הזרימה חיונית להפחתת אינטראקציות לא ספציפיות אלה. לבסוף, לכידת התנהגות רציפה, דינמי של מולקולה בודדת דורש התרגשות fluorophore תכופים במהלך לכידת תמונה. זה יכול לגרום photobleaching לבנת מהירה אם עוצמת לייזר, זמן חשיפה ותדר חשיפה גבוהים מדי. לכן יש לכוונן הגדרות אלה במשולב ואסטרטגיות כיצד להקטין את ערכיהם מבלי להתפשר על הזמן או על רזולוציית התמונה של הנתונים.

אם הסיומת וההרפיה של המולקולה אינם מצופים, יש לעקוב אחר צעדים נוספים. מודמת את המולקולה במכשיר לתקופות ארוכות וקצרות יותר ממה שמומלץ בפרוטוקול. עבור כל פעם נבדק, לשנות BSA-biotin ואת ריכוזי streptavidin על ידי גורמים של 10. בדיקות אלה עשויות להיות נחוצות כדי למטב את מספר נקודות העגינה של biotin-streptavidin שנוצרו בין המולקולה למשטח. לדוגמה, אם צפיפות התיוג הביוטין גבוהה מאוד, עקב סטיות מהריכוזים המומלצים או מהריאגנטים בפרוטוקול התיוג, זמן הדגירה המולקולארי והתחתון bsa-ביוטין וריכוזי streptavidin עשויים להיות נחוצים. כדי לשפר עוד יותר את ההצלחה של הניסוי, לסרוק את המכשיר כולו מיקרופלואידיג עבור מולקולות לפענח הפיך. המשטח לא יכול להיות מטופל בצורה אחידה עם streptavidin או בלוק קזאין, גרימת מולקולות באזורים מסוימים יש תגובות להתיר גדול יותר מאחרים.

שיטה זו מוגבלת על-ידי חוסר מידע אודות גודל ונקודות הקשירה של המולקולה, הקושי בהפקת 0 s-1 קצב ההטיה ואת הרזולוציה האופטית של מיקרוסקופים פלואורסצנטית. העבודה הקודמת הראו וריאציה גדולה בהתנהגות להתיר של VWF, הסביר ביותר על ידי התפלגות רחבה במספר ומיקום של biotin-streptavidin בנקודות ואת המשקל המולקולרי של כל מולקולה VWF18. כרגע, השיטה שאנו מציגים אינה יכולה להגדיר נקודות וגודל מולקולרי. עם זאת, הדמיות בראונית דינמיקה של מודל VWF גס, שפורסם על ידי וואנג et al. לשלב משתנים אלה ניתן להפעיל לצד ממצאים ניסיוניים להסביר וריאציה כזו18. יתר על כן, הזרימה אינה עוצרת בכיוון מיידי כאשר משאבת המזרק מופסקת, ומייסדת את ההתבוננות בדינמיקה. הדבר נובע מדפורמציה והתרחבות קלה של ערוץ PDMS במהלך תקופת הזרימה המיועדת. כאשר המשאבה מופסקת, נוזל ממשיך לזרום עד PDMS הוא נינוח לחלוטין. מערכת משופרת צריך להשתמש יותר נוקשה PDMS או microchannels מיקרוערוצים מפוברק בחומרים פלסטיק קשה, המאפשר לנוזל להגיע לקצב של 0 s-1 להטות יותר מהר. לבסוף, אחד יכול רק לפתור מולקולות שגודלם הוא על אותו סדר גודל כמו הרזולוציה האופטית של המיקרוסקופ פלואורסצנטית, אשר עשוי להיות קטן יותר מאשר כמה מאות nanometers. כך, יש דרישה גודל מינימלי עבור מולקולות שניתן לצפות ישירות עם שיטה זו.

הפרוטוקול הנוכחי מטפל בעיקר בקוונפיקציה של שינויי החלבון ומולקולות ה-DNA באמצעות זרימה פיזיולוגית. עם זאת, ניתן להשתמש בשיטה גם כדי להמחיש אינטראקציות בזמן אמת בין מולקולות ביולוגיות ולאפיין עוד יותר את החלבון ואת פונקציית ה-DNA. למשל, פו et al הראו כי הקשור VWF יכול להפעיל תחת זרימת הטיה גבוהה ועוד ללכוד את המולקולה הדבקה טסיות GPIbα בתנאי זרימה שונים17. אירוע מחייב זה נשמר גם כאשר VWF מאוגד לפני השטח על ידי biotin-streptavidin הקשרים, הוכחת את האפקטיביות של פרוטוקול זה כדי ללמוד פונקציות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ומכניקה17. ניתן להשיג תובנות דומות של מכניסטיות בזמן לימוד האינטראקציות בין ה-DNA המומצאים והחלבונים הרגולטורים בסביבות הזרימה21,22. בנוסף, השיטה שלנו מתייחסת בעיקר להתבוננות בשינויים בקרו. אף על פי כן, ניתן להתאים אותו למטרת לימוד מולקולות קטנות יותר הגדולות מספיק כדי להיפתר תחת מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית. לדוגמה, על ידי הצמדת מולקולה קטנה או באופן בלתי הדוק מולקולת קטן הרבה יותר, למדא DNA למבדה, אחד יכול להגביר את רגישות ההטיה של המולקולה הקטנה יותר בקלות להתבונן התנהגותה. לסיכום, השיטות האחרות לאפיון מולקולה אחת, כגון AFM או מלקחיים אופטיים, מספקים נתונים ברזולוציה גבוהה על התכונות המבבניות והפונקציונליות של קרו; עם זאת, שיטות חלופיות אלה אינן יכולות להתבונן באופן דינאמי, בשינויים שבוצעו בחלבונים ו-DNA המתרחשים בסביבת זרימה פיזיולוגית, כפי שמוצג בפרוטוקול זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע מענק DMS-1463234, המכונים הלאומיים לבריאות מענקים HL082808 ו AI133634, ואת Lehigh באוניברסיטת מימון פנימי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Labeling Kit Invitrogen A30006
Bio-Spin P-6 Gel Columns Bio-Rad 7326221
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Use as free biotin in Step 5.6
Biotin-14-dCTP AAT Bioquest 17019
BSA-Biotin Sigma-Aldrich A8549
Coverslips VWR 48393-195 No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP Set Invitrogen 10297018
Float Buoys for Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69588
Klenow Fragment (3'→5' exo-) New England BioLabs M0212S Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2
Lambda DNA New England BioLabs N3011S
Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69570 10K MWCO, 0.1 mL volume
NEBuffer 4 New England BioLabs B7004S
NHS-PEG4-Biotin Thermo Scientific 21330
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase Sigma-Aldrich P8279
Protocatechuic acid Santa Cruz Biotechnology sc-205818
Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication The Dow Chemical Company 4019862
Streptavidin Sigma-Aldrich 85878
The Blocking Solution CANDOR Bioscience 110 050 Use as casein blocking solution throughout protocol
Vinyl Cleanroom Tape Fisher Scientific 19-120-3217
von Willebrand Factor, Human Plasma Millipore Sigma 681300
YOYO-1 Dye AAT Bioquest 17580
0.25 mm Inner Diameter Tubing Cole-Parmer EW-06419-00
25 Gauge Needle Thomas Scientific JG2505X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
  4. Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
  5. Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
  6. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
  7. Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
  8. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  9. Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
  10. Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
  11. Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
  12. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  13. Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
  14. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
  15. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  16. Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
  17. Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
  18. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
  19. Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).
  20. Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
  21. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  22. Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).

Tags

ביו-הנדסה סוגיה 155 מקדם המותג וילצ דנ א של למדא microfluidics מיקרופלואידיקה להטות את הזרימה TIRF מיקרוסקופ הקונטייטטיבי
אפיון מולקולה חד-מולקולות באמצעות זרימת הטיה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pisapati, A. V., Wang, Y., Blauch,… More

Pisapati, A. V., Wang, Y., Blauch, M. E., Wittenberg, N. J., Cheng, X., Zhang, X. F. Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60784, doi:10.3791/60784 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter