Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zur Immobilisierung einzelner Makromoleküle in mikrofluidischen Geräten und zur Quantifizierung von Veränderungen in ihren Konformationen unter Scherfluss. Dieses Protokoll ist nützlich, um die biomechanischen und funktionellen Eigenschaften von Biomolekülen wie Proteinen und DNA in einer Strömungsumgebung zu charakterisieren.
Abstract
Das Verhalten von Einzelmolekülen unter mechanischer Störung wurde weithin charakterisiert, um viele biologische Prozesse zu verstehen. Methoden wie die Atomkraftmikroskopie haben jedoch eine begrenzte zeitliche Auflösung, während Förster Resonanzenergieübertragung (FRET) nur die Ableitung von Konformationen zulässt. Die Fluoreszenzmikroskopie hingegen ermöglicht die Echtzeit-In-situ-Visualisierung einzelner Moleküle unter verschiedenen Strömungsbedingungen. Unser Protokoll beschreibt die Schritte zur Erfassung von konformen Veränderungen einzelner Biomoleküle in verschiedenen Scherflussumgebungen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Der Scherstrom wird in mikrofluidischen Kanälen erzeugt und über eine Spritzenpumpe gesteuert. Als Demonstrationen der Methode werden von Willebrand-Faktor (VWF) und Lambda-DNA mit Biotin und Fluorophor gekennzeichnet und dann auf der Kanaloberfläche immobilisiert. Ihre Konformationen werden unter variablem Scherstrom kontinuierlich mit Derinkintheitierreflexion (TIRF) und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie überwacht. Die reversible Entwirrungsdynamik von VWF ist nützlich, um zu verstehen, wie seine Funktion im menschlichen Blut reguliert wird, während die Konformation der Lambda-DNA Einblicke in die Biophysik von Makromolekülen bietet. Das Protokoll kann auch weit verbreitet werden, um das Verhalten von Polymeren, insbesondere Biopolymeren, unter unterschiedlichen Strömungsbedingungen zu untersuchen und die Rheologie komplexer Flüssigkeiten zu untersuchen.
Introduction
Mechanismen, wie Biomoleküle auf Umweltreize reagieren, wurden umfassend untersucht. Insbesondere in einer Strömungsumgebung regulieren Scher- und Dehnungskräfte die Konformationsveränderungen und potenziell die Funktion von Biomolekülen. Typische Beispiele sind das scherinduzierte Entwirren der Lambda-DNA und der von Willebrand-Faktor (VWF). Lambda DNA wurde als Werkzeug verwendet, um die konforme Dynamik einzelner, flexibler Polymerketten und die Rheologie von Polymerlösungen1,2,3,4zu verstehen. VWF ist ein natürlicher Strömungssensor, der Blutplättchen an Wundstellen von Blutgefäßen mit abnormalen Scherraten und Strömungsmustern aggregiert. Die Auflösung von VWF ist für die Aktivierung der Bindung von Thrombozyten an die A1-Domäne und der Kollagenbindung an den A3-Bereich unerlässlich. Darüber hinaus ermöglicht die hochscherinduzierte A2-Domänenentfaltung die Spaltung von VWF, das seine Molekulargewichtsverteilung im Umlaufreguliert 5,6. Die direkte Visualisierung des Verhaltens dieser Moleküle unter fließendem Fluss kann unser grundlegendes Verständnis ihrer Biomechanik und Funktion erheblich verbessern, was wiederum neuartige diagnostische und therapeutische Anwendungen ermöglichen kann.
Typische Methoden zur Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationen sind optische/magnetische Pinzette, Atomkraftmikroskopie (AFM) und einmolekulare Förster-Resonanzenergieübertragung (FRET)7. Die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Kraft und Bewegung zu untersuchen, die mit den konformen Veränderungen von Biomolekülen verbunden sind. Es fehlt jedoch die Fähigkeit, allgemeine molekulare Konformationen8abzubilden. AFM ist in der Lage, Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung, ist aber in der zeitlichen Auflösung9,10begrenzt. Darüber hinaus kann der Kontakt zwischen der Spitze und der Probe die durch den Durchfluss induzierte Reaktion verwirren. Andere Methoden wie FRET und Nanopore Analytics bestimmen die Faltung und Entfaltung von Einzelmolekülproteinen auf der Grundlage des Nachweises von intramolekularer Entfernung und ausgeschlossenen Volumina. Diese Methoden stecken jedoch noch in den Kinderschuhen und sind in ihrer direkten Beobachtung der Einzelmolekül-Konformationen11,12,13,14begrenzt.
Andererseits hat die direkte Beobachtung von Makromolekülen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung unter Fluoreszenzmikroskopie unser Verständnis der Einzelmoleküldynamik in vielen biologischen Prozessenverbessert 15,16. So haben Fu et al. kürzlich erstmals eine gleichzeitige Visualisierung der VWF-Dehnung und der Thrombozytenrezeptorbindung erreicht. In ihrer Arbeit wurden VWF-Moleküle auf der Oberfläche eines mikrofluidischen Kanals durch Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen immobilisiert und unter totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) in unterschiedlichen Scherflussumgebungen abgebildet17. Mit einer ähnlichen Methode wie Fu zeigen wir hier, dass Konformationen von VWF- und Lambda-DNA sowohl unter TIRF- als auch in der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie direkt beobachtet werden können. Wie in Abbildung 1dargestellt, werden mikrofluidische Vorrichtungen verwendet, um den Scherfluss zu erzeugen und zu steuern, und Biomoleküle werden auf der Kanaloberfläche immobilisiert. Bei Anwendung unterschiedlicher Scherraten werden Konformationen desselben Moleküls aufgezeichnet, um die Verlängerungslänge zu messen, siehe auch abbildung 1. Die Methode könnte weit verbreitet angewendet werden, um andere Polymerverhalten unter komplexen Strömungsumgebungen sowohl für rheologische als auch für biologische Studien zu untersuchen.
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Protocol
1. Vorbereitung von VWF
- Rekonstituieren Sie menschliches Plasma VWF, um es für die Etikettierungsreaktionen vorzubereiten. Fügen Sie 100 l deionisiertes (DI) Wasser zu 100 g lyophilisiertem VWF hinzu, um eine VWF-Lagerlösung mit 1 mg/ml zu erstellen.
- Dialyze VWF-Lagerlösung, um überschüssiges Glycin zu entfernen und damit die Biotin- und Fluorophor-Etikettierungseffizienz zu erhöhen.
- Übertragen Sie 50 l VWF-Lagerlösung in eine 0,1 ml Dialyseeinheit mit einem 10.000 Molekulargewichtsabschaltung und Abdichtung mit Kappe. Bewahren Sie die Reststofflösung bei -20 °C auf. Die VWF-Aktie bleibt bis zu einem Jahr bei -20 °C stabil.
- Dialyse in 500 ml 1x steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS) (0,01 M Dinatriumphosphat, 0,0018 Monokaliumphosphat, 0,0027 M Kaliumchlorid, 0,137 M Natriumchlorid, pH 7,4 bei 25 °C) bei 1 h bei 4 °C mit langsamem Rühren laufen lassen. Wiederholen Sie die Dialyse für eine zusätzliche Stunde mit 500 ml frischem PBS.
- Beginnen Sie mit der Biotin-Etikettierungsreaktion. Bereiten Sie eine 2 mMLösung von NHS-PEG 4-Biotin vor, indem Sie den Feststoff in DI-Wasser unmittelbar vor der Reaktion auflösen. Wenn NHS-PEG 4-Biotin längere Zeit im Wasser bleiben kann, wird die NHS-Ester-Gruppe hydrolysieren, wodurch die Etikettiereffizienz verringert wird.
- Fügen Sie der Dialyseeinheit, die die VWF-Lagerlösung enthält, 2,5 l von 2 mM NHS-PEG4-Biotin hinzu. Dies führt zu einem 20-fachen Molarenüberschuss an Biotin im Vergleich zu VWF-Monomeren. Primäre Afine von VWF reagieren mit den NHS-Ester-Gruppen undbinden damit über Amid-Verbindungen kovalent an PEG 4-Biotin-Gruppen.
- Legen Sie die Dialyseeinheit in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Versiegeln Sie die Dialyseeinheit mit der entsprechenden Kappe. Sichern Sie die Rohrdialyse-Baugruppe mit Parafilm. Aufrecht halten und bei Raumtemperatur 40 min lassen.
- Starten Sie die Fluorophor-Etikettierungsreaktion. Bereiten Sie eine 2,8 mM Lösung von Alexa 488 Tetrafluorphenyl-Ester (TFP-Ester) Fluoreszenzfarbstoff (Erregungmax = 498 nm, Emissionmax = 519 nm) durch Auflösung des Fluorophorfestes in DI-Wasser vor. Tun Sie dies unmittelbar vor der Reaktion, um zu verhindern, dass die TFP-Ester-Gruppe hydrolysiert.
- Fügen Sie der Dialyseeinheit 2,9 l des 2,8 mM 488 Fluorophors hinzu. Dies wird zu einem 34-fachen molaren Überschuss an Fluorophor im Vergleich zu VWF-Monomeren führen. Verbleibende primäre Afine von VWF werden mit den TFP-Ester-Gruppen reagieren und damit kovalent über Amid-Verbindungen an Fluorophore binden.
- Die Dialyseeinheit wird mit 2,0 l von 1 M Natriumbicarbonat (in DI-Wasser gelöst) hinzugefügt. Dadurch wird der pH-Wert der Reaktion näher an 8,0 angepasst, was die Effizienz der TFP-Ester- und primären Aminreaktion erhöht.
- Sichern Sie die Dialyseeinheit in einem Mikrozentrifugenrohr wie in Schritt 1.3.2. Im Dunkeln aufbewahren, um Photobleichungen zu verhindern und bei Raumtemperatur für 1 h und 30 min aufbewahren.
- Die Dialyseeinheit in 900 ml 1x steriles PBS und Dialyse über Nacht bei 4 °C aufstellen. Dies ergibt etwa 70 l gekennzeichneten VWF bei einer Konzentration von 0,71 mg/ml bzw. 2,84 m (Monomerkonzentration).
- Übertragen Sie beschriftete VWF in ein Mikrozentrifugenrohr. Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie und schützen Sie vor Licht. Bei 4 °C lagern. Zur Langzeitlagerung antimikrobielles Mittel Natriumazid zu einer Endkonzentration von 0,02% (w/v) hinzufügen.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
2. Vorbereitung der Lambda-DNA
- Biotinylat lineare Lambda-DNA, indem seine kohäsiven Endstandorte (cos sites) mit Biotin-14-dCTP-Nukleotiden nach Standardprotokollen gefüllt werden, die hier in Schritt 2.118wiederholt werden. Füllen Sie die restlichen cos-Sites mit dATP-, dTTP- und dGTP-Nukleotiden aus.
- 1 mM Lösungen von dATP, dTTP, dGTP und biotin-14-dCTP in einem 10x Reaktionspuffer (500 mM Natriumchlorid, 100 mM Trishydrochlorid, 100 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Dithiothreitol, pH 7,9 bei 25 °C) vorbereiten.
- Legen Sie 48 l 500 ng/l Lambda-DNA in ein PCR-Röhrchen und erhitzen Sie 5 min bei 65 °C. Die cos-Standorte der kreisförmigen Lambda-DNA trennen sich unter Hitze, linearisieren das Molekül und machen einsträngige Überhänge bereit für die Biotinylierung. Unmittelbar danach auf Eis legen, um zu verhindern, dass cos-Sites wieder glühen.
- Fügen Sie der Lambda-DNA 5 l von 1 mM dATP, dTTP und dGTP und 4 l mit 1 mM Biotin-14-dCTP hinzu. Fügen Sie auch 2,5 l von 5 U/ L Klenow Fragment (3''5' exo-) hinzu, um die DNA-Synthese zu katalysieren.
- Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch für 1 h bei 37 °C.
- Fügen Sie 1,2 l von 0,5 M EDTA hinzu. Dann erhitzen Sie das Reaktionsgemisch 5 min bei 70 °C. Dadurch werden die Klenow-Fragment- und Biotinylierungsreaktion deaktiviert.
- Entfernen Sie überschüssige Nukleotide aus Lambda-DNA mit einer Spin-Säule, die 10-70 l aufnehmen kann und eine Cut-off-Datei von 6.000 Molekulargewichthatungen hat.
- Platzieren Sie die Säule in einem 2 ml Mikrozentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie die Säule und das Rohr bei 1000 x g für 2 min. Entsorgen Sie den Durchfluss, der sich im Rohr sammelt.
- Ersetzen Sie den Spaltenpuffer durch eine 1x-Lösung desselben Reaktionspuffers aus Schritt 2.1.1. Fügen Sie der Spalte dazu 500 L 1x Puffer hinzu. Zentrifuge für 1 min bei 1000 x g. Entsorgen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie diese 2 weiteren Male, so dass der Spalte insgesamt 1500 l hinzugefügt wurden.
- Legen Sie die Säule in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie die Lösung aus Schritt 2.1.5 vorsichtig der obersten Ebene der Spalte hinzu. Zentrifuge für 4 min bei 1000 x g.
- Sammeln Sie den Durchfluss (40-70 l) aus dem Mikrozentrifugenrohr und legen Sie sie in ein PCR-Rohr. Diese enthält die gereinigte, biotinylierte Lambda-DNA.
- Label Lambda DNA mit fluoreszierendem YOYO-1 Farbstoff (Erregungmax = 490 nm, Emissionmax = 509 nm) nach Standardprotokollen, hier in Schritt 2.3.120wiederholt.
- Bereiten Sie eine Lösung aus YOYO-1 Farbstoff und Lambda-DNA mit einem Farbstoff zu Basis paar Molar Verhältnis von 1:10. Angenommen, im Reinigungsschritt ging keine DNA verloren, um die Konzentration der Lambda-DNA des Basispaares zu berechnen. Lambda DNA in voller Länge hat 48.502 Basenpaare.
HINWEIS: Wenn z. B. 50 l lösungsmenge aus Schritt 2.2.4 wiederhergestellt wurden, fügen Sie 7,4 l mit 500 -M YOYO-1 Farbstoff hinzu. - Erhitzen Sie die Lösung für 2 h bei 50 °C im Dunkeln, um die Reaktion zu vervollständigen.
- Bedecken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie und schützen Sie vor Licht. Bei 4 °C lagern. Die Lösung kann nun in mikrofluidische Geräte injiziert werden.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
- Bereiten Sie eine Lösung aus YOYO-1 Farbstoff und Lambda-DNA mit einem Farbstoff zu Basis paar Molar Verhältnis von 1:10. Angenommen, im Reinigungsschritt ging keine DNA verloren, um die Konzentration der Lambda-DNA des Basispaares zu berechnen. Lambda DNA in voller Länge hat 48.502 Basenpaare.
3. Erstellen von mikrofluidischen Kanalformen in Siliziumwafern
- Verwenden Sie die Photolithographie, um mikrofluidische Kanäle mit entsprechenden Abmessungen (Abbildung 2) auf einem Master-Siliziumwafer nach Standardprotokollen19zu erstellen.
4. Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidische Vorrichtung
- Fügen Sie 5 Teile Silikon-Elastomer-Basis zu 1 Teil-Härtungsmittel (nach Masse) in einem Wägeboot. Rühren Sie den Inhalt gründlich für 1 min, um vorgehärtete PDMS-Lösung zu erstellen.
- Legen Sie den Master-Silizium-Wafer in eine Kunststoff-Petrischale. Gießen Sie die PDMS-Lösung über den Wafer, um eine 5-mm-Schicht zu erstellen. Bedecken Sie die Schale und lassen Sie in einem Trockentrockner unter Vakuum für 1 h Luftblasen zu entfernen.
- Bedeckte Petrischale bei 60 °C über Nacht inkubieren, um PDMS in einen flexiblen Feststoff auszuhärten. Die Aushärtung führt dazu, dass an der PDMS-Wafer-Schnittstelle mikrofluidische Kanäle in das PDMS eingegossen werden.
- Schneiden Sie 20 x 10 mm Rechtecke mit einem Rasiermesser in das PDMS um jeden mikrofluidischen Kanal. Entfernen Sie die rechteckigen PDMS-Blöcke mit einer Pinzette.
- Verwenden Sie eine 25 G stumpfe Endnadel mit geschärften Kanten, um ein Loch mit einem Durchmesser von 0,5 mm an einem Ende des Kanals zu stanzen, um sicherzustellen, dass das Loch vollständig durch den PDMS-Block verläuft (Abbildung 2). Verwenden Sie eine dünne Nadel, um PDMS aus Loch auszustechen. Wiederholen Sie dies am anderen Ende des Kanals. Dadurch wird ein Ein- und Auslass für den Durchfluss durch den Kanal erstellt.
- Reinigen Sie die Oberfläche des PDMS-Blocks mit Vinyl-Reinraumband. Druckstickstoffgas über einen Deckel der Nr. 1 1/2, 22 x 50 mm blasen, um Schmutz zu entfernen.
- Legen Sie den PDMS-Block mit der Kanalseite nach oben und den Deckelrutsch in die Kammer einer Plasma-Bindungsmaschine. Beginnen Sie die Behandlung.
- Wenn die Behandlung abgeschlossen ist, legen Sie den PDMS-Block schnell auf einen Deckel, so dass der Kanal mit dem Schlupf in Berührung kommt. Wenden Sie Druck entlang der Kanten des Blocks an. Legen Sie die Coverslip-PDMS-Baugruppe 15 min bei 115 °C auf eine Kochplatte, um die Dauerbindung zu verstärken.
- Legen Sie 10 cm lange, 0,25 mm Innendurchmesser Rohre in das Auslassloch an der Oberseite des PDMS-Blocks ein. Dadurch kann Flüssigkeit leicht aus dem Kanal fließen. Das Gerät ist nun fertig.
5. Behandlung der Oberfläche von mikrofluidischen Geräten
- Injizieren Sie in sterile 1x PBS gelöste Injizung von 10 g/ml biotinylatiertem Rinderserumalbumin (BSA-Biotin) in den Einlass von mikrofluidischen Geräten für VWF-Experimente. Injizieren Sie <10 l von 1 mg/ml BSA-Biotin für Lambda-DNA-Experimente. Halten Sie nach der Injektion ein paar Mikroliter BSA-Biotin in der Pipettenspitze zurück und lassen Sie die Spitze in den Einlass einbetten.
- Halten Sie immer ein Tröpfchen DI-Wasser um die Spitze. Dadurch wird verhindert, dass Luftblasen in den Kanal gelangen. Wenden Sie diese Technik jedes Mal an, wenn eine neue Lösung in den Kanal injiziert wird.
- BSA-Biotin 2 h im Gerät brüten lassen. Die BSA bindet nicht spezifisch an die Deckbedeckungsoberfläche (Abbildung 3A).
- Entfernen Sie die Pipettespitze. In jilt;10 l Casein-Blockierlösung in den Kanal einspritzen und 30 min inkubieren lassen. Das Großstein wird alle freien Standorte blockieren und die unspezifische Bindung von Biomolekülen an die Oberfläche reduzieren (Abbildung 3B).
- Entfernen Sie die Spitze und injizieren Sie <10 l von 10 g/ml Streptavidin, gelöst in sterilem 1x PBS, in den Kanal für VWF-Experimente. Verwenden Sie 100 g/ml Streptavidin für Lambda-DNA-Experimente. 10 min inkubieren. Das Streptavidin bindet an die Biotingruppen des BSA-Biotins (Abbildung 3C).
- Entfernen Sie die Spitze und injizieren <10 l 1x Waschmittellösung (0,05% Tween 20 in PBS) in den Kanal, um überschüssiges Streptavidin wegzuwaschen.
- Entfernen Sie die Spitze und injizieren Sie <10 l von entweder 28,4 nM VWF verdünnt in Casein-Lösung oder Lambda-DNA aus Schritt 2.3.3. Inkubieren SIE VWF für 3 min. Inkubieren Lambda DNA für 45 min (Abbildung 3D).
- Entfernen Sie die Spitze und injizieren <10 l von 5 mM freies Biotin in Casein-Lösung verdünnt. Freies Biotin blockiert überschüssige Streptavidin-Bindungsstellen auf Kanaloberfläche (Abbildung 3E).
6. Visualisierung der VWF- und Lambda-DNA unter Fluoreszenzmikroskopie
- Bereiten Sie 1 ml Casein-Blockierlösung mit 2,2 mM Protokateatchusäure und 37 nM Protocatechuat-3,4-Dioxygenase vor (zur Minimierung der Photobleichung). In eine Spritze geben und in einer Spritzenpumpe sichern. Nehmen Sie 30 cm lange, 0,25 mm Innendurchmesser Schläuche und befestigen Sie ein Ende an der Spritzennadel. Durchfluss in der Lösung, um Luftblasen zu entfernen. Befestigen Sie das andere Ende des Rohres am Einlass des mikrofluidischen Geräts. Es wird empfohlen, dies 3 Minuten nach Schritt 5.6 zu tun.
- Wählen Sie das höchste Vergrößerungsobjektiv (d. h. 60-100X) einer gesamten inneren Reflexion (TIRF) oder eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops aus. Fügen Sie bei Bedarf einen Tropfen Tauchöl auf sein Ziel. Stellen Sie das mikrofluidische Gerät auf die Mikroskopstufe, so dass der Deckelschlupf bündig mit dem Objektiv ist.
- Starten Sie die Hellfeldmikroskopie. Passen Sie den Fokus so an, dass alle Features, wie Schmutz und Blasen, sichtbar sind. Passen Sie dann die Bühne in X- und Y-Richtung an, bis der Rand des mikrofluidischen Kanals sichtbar ist und den Rahmen zerschneidet.
- Wechseln Sie zum 488-Kanal (FITC). Passen Sie den Z-Level- und TIRF-Winkel nach Bedarf an, bis einzelne grüne, kugelförmige Moleküle unterschieden werden können. Dabei handelt es sich entweder um VWF- oder Lambda-DNA-Moleküle.
- Passen Sie Belichtungszeit und Laserintensität an, um fluoreszierende Moleküle zu visualisieren, ohne sie zu schnell zu photobleicht zu machen. Stellen Sie den Kontrast ein, um Moleküle auch klarer zu visualisieren.
- Startfluss von der Spritzenpumpe, so dass die Casein-Blockierlösung in den Kanal und aus dem Auslass fließt. Tun Sie dies genau 5 Minuten nach Schritt 5.6. Stoppen und starten Sie den Fluss, um die Veränderungen in der Konformation von Molekülen zu beobachten. Bei der Anwendung des Durchflusses werden Die Raten zwischen 5.000 und 30.000 l/h verwendet. Wiederholen Sie dies in verschiedenen Bereichen des mikrofluidischen Geräts. Setzen Sie diesen Prozess fort, um Moleküle zu lokalisieren, die sich auf mehrere Zyklen des Anhaltens und Startens des Flusses ausdehnen und entspannen können.
- Beachten Sie, wie lange es dauert, bis Moleküle die maximale Ausdehnung erreichen und sich vollständig in Globuli entspannen. Nehmen Sie Videos über das kontinuierliche Verhalten von Molekülen unter Scherfluss auf und wählen Sie die beste Belichtungszeit, Belichtungshäufigkeit und Videodauer aus, die den gesamten Bereich des Erweiterungsverhaltens erfassen und Photobleichungen minimieren.
- Speichern Sie die Videos als . AVI-Dateien mit einer Maßstabsleiste.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
7. Bildanalyse von Konformationsänderungen
- Berechnen Sie die
Wandscherrate ( ), die auf Makromoleküle angewendet wird, mit der Durchflussrate (Q) und der Höhe (h) und der Breite (w) des rechteckigen mikrofluidischen Kanals. Verwenden Sie dazu die folgende Gleichung:
- Bestimmen Sie die Länge eines Biomoleküls unter verschiedenen Scherraten mit einem angepassten MATLAB-Code (siehe Ergänzende Dateien). Erstellen Sie einen Ordner mit dem Titel Videos Analyse, die die folgenden MATLAB-Codes enthält: main.m, save_each_frame.m, get_length.m und get_length.fig. Erstellen Sie einen Unterordner in der Videoanalyse mit dem Titel Videos, und fügen Sie hinzu. AVI-Dateien, die darin analysiert werden sollen.
- Öffnen Sie main.m mit MATLAB 2019a und führen Sie den Code aus. Geben Sie den Namen der zu analysierenden Videodatei in das Befehlsfenster unter Bitte geben Sie die zu analysierende Datendatei ein:.
- Legen Sie in der geöffneten grafischen Benutzeroberfläche (GUI) den Schwellenwert (Text im Feld oben rechts im Fenster) auf 20 fest und klicken Sie auf die Schaltfläche Schwellenwert festlegen, um dies zu bestätigen.
- Verwenden Sie den Datencursor in der oberen Werkzeugleiste des Fensters, um ein Pixel an einer beliebigen Stelle auf der Maßstabsleiste auszuwählen. Klicken Sie im Abschnitt Maßstabsleiste auf der rechten Seite des Fensters auf Startpunkt. Die (x,y) Position des gewählten Pixels wird rechts neben der Schaltfläche angezeigt. Klicken Sie auf die Pixel-Schaltfläche . Die Pixelgröße muss nur einmal in jedem Video gemessen werden.
- Wählen Sie ein beliebiges Pixel auf dem Molekül von Interesse. Klicken Sie auf Startpunkt im VWF-Bereich. Nachdem die Position des gewählten Pixels im Textfeld rechts angezeigt wird, klicken Sie auf das linke Ende, das rechte Ende und die String-Länge, um die molekulare Länge im Bild zu erhalten.
HINWEIS: Dieser Schritt kann verwendet werden, um die konformen Veränderungen eines Biomoleküls zu analysieren, obwohl der Code einen bestimmten Abschnitt namens VWFenthält. - Überprüfen Sie das linke und rechte Ende des Moleküls. Vergrößern Sie den Datencursor, um die Pixelposition zu überprüfen. Wählen Sie das Pixel manuell als Ende aus und berechnen Sie bei Bedarf die Länge (in Pixel).
- Zeichnen Sie die Pixelgröße in der Pixelzahl und die Zeichenfolgenlänge in Pixelzahl in ein Excel-Blatt auf, und berechnen Sie die Zeichenfolgenlänge in m.
- Wiederholen Sie die obigen Schritte für jedes Bild. Verwenden Sie die Schaltfläche Letzte, Weiter in der unteren rechten Ecke der GUI, um zwischen Bildern in derselben Videodatei zu wechseln. Klicken Sie auf Schließen, um das GUI-Fenster zu schließen.
Wandscherrate ( ), die auf Makromoleküle angewendet wird, mit der Durchflussrate (Q) und der Höhe (h) und der Breite (w) des rechteckigen mikrofluidischen Kanals. Verwenden Sie dazu die folgende Gleichung:
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Representative Results
Die Beobachtung des dynamischen Verhaltens von Biomolekülen wie VWF und Lambda DNA hängt in hohem Maße von der Optimierung ihrer Bindung an die Geräteoberfläche ab. Die Inkubation von Oberflächenbehandlungen für die empfohlenen Zeiten im mikrofluidischen Gerät ist entscheidend, um eine Bindung mit wenigen Verankerungspunkten zu erhalten, so dass moleküle sich bei wechselndem Fluss frei ausdehnen und entspannen können. Wenn die Proteine oder die DNA zu stark mit mehreren Verbindungen gebunden sind, werden sie sich entweder auf begrenzte Längen ausdehnen oder gar nicht. Dies tritt insbesondere bei VWF auf, wenn es vor der freien Biotinblockierung mehr als 3 min ohne Durchfluss auf der Geräteoberfläche bleibt. Je länger VWF an der Oberfläche stagniert, desto mehr VWF-Biotingruppen binden sich an die Oberflächen-Streptavidin-Gruppen und desto weniger Flexibilität muss das Molekül auflösen. Wenn Moleküle zu schwach gebunden sind, lösen sie sich dagegen beim Fließen und verschwinden aus dem Blickfeld. Dies kann auftreten, wenn VWF oder Lambda DNA für zu kurze Zeiträume inkubiert wird, wodurch zu wenige Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen entstehen. Moleküle können sich auch befreien, wenn extrem hohe Scherraten (>200.000 s-1) angewendet werden, wodurch die Wechselwirkungen zwischen Biotin-Streptavidin geschwächt werden.
Ein ideales Molekül bindet sich so weit, dass es sich auf mehreren Zyklen des Anhaltens und Startens des Flusses entwirren und entspannen kann. Die Flexibilität eines Moleküls, eine solche Konformation zu ändern, zeigt sich oft in seiner Fähigkeit, sich auf zunehmende Längen auszudehnen, da höhere Scherraten in einem Bereich zunehmender Strömung angewendet werden. Bilder von VWF mit TIRF-Mikroskopie zeigen diese Beziehung in Video 1. Die Verlängerungs-/Scherratenkurve desselben VWF-Moleküls in Abbildung 4 erfasst präzise das scherinduzierte Verhalten eines VWF-Moleküls und ist nützlich, um die biomechanischen Eigenschaften des Proteins zu charakterisieren. Bilder von Lambda-DNA, die mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie gewonnen wurden, zeigen ebenfalls eine erhöhte Erweiterung bei höheren Scherraten und allmählicher Entspannung über 2 min, wie in Video 2 und Video 3erfasst wird. Die Rückstoßeigenschaften der Lambda-DNA nach gestopptem Fluss werden auch in Abbildung 5grafisch dargestellt.
Abbildung 1: Schemata des Einzelmolekül-Flow-Experiments im mikrofluidischen Kanal unter Fluoreszenzmikroskopie. Die Kanaloberfläche ist mit BSA-Biotin beschichtet und mit Casein verstopft. Streptavidin wird mit Biotin auf der Kanaloberfläche und auch biotinylierter VWF/Lambda-DNA zur Demobilisierung einzelner Moleküle auf der Oberfläche verbunden. Wenn die Scherrate von A nach Cansteigt, wird das Molekül von einem gefalteten Zustand in einen länglichen Zustand entlang der Strömungsrichtung von links nach rechts gestreckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Mikrofluidische Kanalabmessungen. Form und Struktur des mikrofluidischen PDMS-Geräts werden zusammen mit den Kanalabmessungen dargestellt. Der Kanal ist 50 'm hoch und reicht von 0,1 bis 1,0 mm Breite. Der Verengungsbereich in der Mitte des Kanals ist 0,7 mm lang. Der Einlass und der Auslass haben einen Durchmesser von 0,5144 mm (25 G). Die Strömungsrichtung ist von links nach rechts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Oberflächenbehandlungsschritte für die Immobilisierung von Einzelmolekülen. Alle Schritte erfolgen bei Raumtemperatur. (A). BSA-Biotin wird auf der Oberfläche für 2 h beschichtet. (B). Casein wird 30 minuten lang in den Kanal injiziert, um die Oberfläche zu blockieren. (C). Streptavidin wird im Kanal für 10 min inkubiert, um mit BSA-Biotin zu binden. (D). Nach dem Abwaschen überschüssiger Moleküle in den ersten Schritten wird Fluorophor- und Biotin-gekennzeichnete VWF/Lambda-DNA in den Kanal injiziert und durch Bindung mit Streptavidin immobilisiert. (E). Freies Biotin wird einfließen, das zusätzliche Streptavidin-Bindungsstellen blockiert, um seine Interferenz mit dem Molekül bei Konformationsänderungen zu minimieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Erweiterungsverhalten von VWF unter Scherstrom. Das Molekül löst sich reversibel bei 7 verschiedenen Scherraten auf: 0 s-1, 33.333 s-1, 66.667 s-1, 100.000 s-1, 133.333 s-1, 166.667 s-1 und 200.000 s-1. Die Länge des gestreckten Moleküls steigt von 0,52 m bei null Scherrate auf 3,44 m bei einer Scherrate von 200.000 s-1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Entspannungsverhalten der Lambda-DNA nach Stopp des Scherflusses. Durchfluss mit 33.000 s-1 und 66.667 s-1 Scherraten werden von 0 bis 30 s auf das gleiche Molekül angewendet. Entspannung wird von 30 s bis 150 s aufgezeichnet. Bei einer Scherrate von 66.667 s-1 längsicht das DNA-Molekül auf 15,00 m und entspannt sich nach 2 min- und 2 min wieder auf 5,83 m. Bei einer Scherrate von 33.333 s-1 erstreckt sich das Molekül nur auf 8,75 m und ist nach 2 mEntspannung 3,33 m lang. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video 1: Reversible Entwirrung von VWF unter steigenden Scherraten mit der gesamten inneren Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF). Das Molekül in der Mitte der Ansicht entwirrt sich reversibel auf unterschiedliche Länge bei Scherraten 33.333 s-1, 66.667 s-1, 100.000 s-1 und 133.333 s-1. Eine Spritzenpumpe wird verwendet, um den Durchfluss zu steuern, aus dem Scherraten berechnet werden. Die Strömungsrichtung ist von links nach rechts. Die Bilder werden mit 15 s Intervallen aufgenommen, um vollständige Entspannungs- und Erweiterungsprozesse zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video 2: Entspannung der Lambda-DNA nach 33.333 s-1 Scherrate. Die Bilder werden unter konfokaler Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen. Lambda DNA werden unter 33.333 s-1 Scherfluss gedehnt und entspannt zurück in einen gefalteten Zustand, nachdem der Fluss bei 30 s gestoppt wird. Dauer der Entspannung ist 2 min. Strömungsrichtung ist von links nach rechts. Die Bilder werden mit 30 s Intervallen dazwischen aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Video 3: Entspannung der Lambda-DNA nach 66.667 s-1 Scherrate. Die Einstellungen sind mit denen in Video 2 identisch, mit Ausnahme der anfänglichen Scherrate. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
Ergänzende Dateien: MATLAB-Codes. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Um qualitativ hochwertige Daten von konbildenden Veränderungen einzelner Moleküle mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie zu erhalten, wie in dieser Methode beschrieben, ist es wichtig, das Molekül für die entsprechende Zeit zu inkubieren, seine unspezifischen Wechselwirkungen mit der Oberfläche zu minimieren. und stellen Sie Mikroskopeinstellungen ein, die das Photobleichen reduzieren. Die Fähigkeit des Moleküls, die Konformation frei zu verändern, hängt mit der Anzahl der Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen zusammen, die zwischen dem Molekül und der Oberfläche gebildet werden. Wie bereits erwähnt, muss dies durch Inkubation des Moleküls ohne Durchfluss für die entsprechende Zeit gesteuert werden. Darüber hinaus kann Protein oder DNA nichtspezifisch an den Deckslip binden, wenn der Deckslip nicht effektiv blockiert wird. Ohne die empfohlene Blockierlösung können Moleküle nicht spezifisch am Glas befestigt werden und nicht auf die angewendete Durchflussrate reagieren. Die Anwendung des Caseinblocks während der frühen Oberflächenbehandlung und die Aufrechterhaltung seiner Präsenz während des Durchflusses ist wichtig, um diese unspezifischen Wechselwirkungen zu reduzieren. Schließlich erfordert die Erfassung des kontinuierlichen, dynamischen Verhaltens eines einzelnen Moleküls eine häufige Fluorophor-Aufregung während der Bildaufnahme. Dies kann zu einer schnellen Photobleiche führen, wenn die Laserintensität, die Belichtungszeit und die Belichtungshäufigkeit zu hoch sind. Daher ist es notwendig, diese Einstellungen im Tandem anzupassen und zu strategen, wie ihre Werte reduziert werden können, ohne die Zeit- oder Bildauflösung der Daten zu beeinträchtigen.
Wenn die Ausdehnung und Entspannung des Moleküls nicht beobachtet wird, sollten zusätzliche Schritte befolgt werden. Inkubieren Sie das Molekül im Gerät für längere und kürzere Zeiten als im Protokoll empfohlen. Für jedes Mal, das getestet wird, variieren BSA-Biotin und Streptavidin Konzentrationen durch Faktoren von 10. Diese Tests können notwendig sein, um die Anzahl der Biotin-Streptavidin-Verankerungspunkte zu optimieren, die zwischen molekül und oberfläche gebildet werden. Ist beispielsweise die Biotin-Etikettierungsdichte aufgrund von Abweichungen von den empfohlenen Konzentrationen oder Reagenzien im Etikettierungsprotokoll sehr hoch, können kürzere molekulare Inkubationszeiten und niedrigere BSA-Biotin- und Streptavidinkonzentrationen erforderlich sein. Um den Erfolg des Experiments weiter zu verbessern, scannen Sie das gesamte mikrofluidische Gerät nach Molekülen, die sich reversibel auflösen. Die Oberfläche darf nicht gleichmäßig mit Streptavidin oder Kaseinblock behandelt werden, was dazu führt, dass Moleküle in bestimmten Bereichen größere Entwirrungsreaktionen haben als andere.
Diese Methode wird durch einen Mangel an Informationen über die Größe und die Haltepunkte des Moleküls, die Schwierigkeit bei der Erzeugung von 0 s-1 Scherrate und die optische Auflösung von Fluoreszenzmikroskopen begrenzt. Frühere Arbeiten haben eine große Variation im Entwirrungsverhalten von VWF gezeigt, möglicherweise erklärt durch die breite Verteilung in Anzahl und Lage von Biotin-Streptavidin-Tetherpunkten und das Molekulargewicht jedes VWF-Moleküls18. Im Moment kann die von uns vorliegende Methode keine Tetherpunkte und molekulare Größe definieren. Allerdings enthalten Brownsche Dynamiksimulationen eines grobkörnigen VWF-Modells, das von Wang et al. veröffentlicht wurde, diese Variablen und können zusammen mit experimentellen Befunden durchgeführt werden, um diese Variation zu erklären18. Darüber hinaus stoppt der Durchfluss nicht sofort, wenn die Spritzenpumpe angehalten wird, was die Beobachtung der Rückstoßdynamik verwirrt. Dies ist auf die Verformung und leichte Erweiterung des PDMS-Kanals während der vorgesehenen Strömungsperiode zurückzuführen. Wenn die Pumpe angehalten wird, fließt die Flüssigkeit weiter, bis das PDMS vollständig entspannt ist. Ein verbessertes System sollte starreres PDMS oder Mikrokanäle verwenden, die in hartplastiken Materialien hergestellt werden, sodass Flüssigkeit schneller eine Scherrate von 0 s-1 erreichen kann. Schließlich kann man nur Moleküle auflösen, deren Größe in der gleichen Größenordnung liegt wie die optische Auflösung des Fluoreszenzmikroskops, die nicht kleiner als ein paar hundert Nanometer sein darf. Somit gibt es eine Mindestgrößenanforderung für die Moleküle, die mit dieser Methode direkt beobachtet werden können.
Das aktuelle Protokoll betrifft hauptsächlich die Quantifizierung von konformen Veränderungen von Protein- und DNA-Molekülen unter physiologischem Fluss. Die Methode kann jedoch auch verwendet werden, um Echtzeit-Wechselwirkungen zwischen biologischen Molekülen zu visualisieren und die Protein- und DNA-Funktion weiter zu charakterisieren. Zum Beispiel haben Fu et al. gezeigt, dass gebundene VWF unter hohem Scherstrom aktivieren und das Thrombozytenadhäsionsmolekül GPIb unter unterschiedlichen Strömungsbedingungen weiter erfassen kann17. Dieses Bindungsereignis bleibt auch dann erhalten, wenn VWF durch Biotin-Streptavidin-Verbindungen an die Oberfläche gebunden ist, was die Wirksamkeit dieses Protokolls zur Untersuchung physiologisch relevanter Funktionen und Mechanik17demonstriert. Ähnliche mechanistische Erkenntnisse konnten bei der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen entwirrter DNA und regulatorischen Proteinen in Strömungsumgebungen gewonnen werden21,22. Darüber hinaus bezieht sich unsere Methode hauptsächlich auf die Beobachtung konformationaler Veränderungen in Makromolekülen. Dennoch könnte man es anpassen, um kleinere Moleküle zu untersuchen, die groß genug sind, um unter Fluoreszenzmikroskopie gelöst zu werden. Zum Beispiel könnte man durch nicht kovalente oder kovalente Anheftung eines kleinen Moleküls an eine viel größere, immobilisierte Lambda-DNA die Scherempfindlichkeit des kleineren Moleküls erhöhen und sein Verhalten leichter beobachten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass andere Einzelmolekülcharakterisierungsmethoden, wie AFM oder optische Pinzetten, hochauflösende Daten über die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von Makromolekülen liefern; Diese alternativen Methoden können jedoch nicht die dynamischen, konformen Veränderungen von Proteinen und DNA beobachten, die in einer physiologischen Strömungsumgebung stattfinden, wie in diesem Protokoll dargelegt.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch eine Nationale Wissenschaftsstiftung unterstützt, die DMS-1463234, die Nationalen Gesundheitsinstitute HL082808 und AI133634 und die interne Finanzierung der Lehigh University gewährt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
References
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