אנו מציגים פרוטוקול לשתק קרו יחיד במכשירים מיקרופלואידים וכביכמת שינויים בקונמציות שלהם תחת זרימת הטיה. פרוטוקול זה שימושי לאפיון המאפיינים הביומכאני והפונקציונלי של biomolecules כגון חלבונים ו-DNA בסביבת זרימה.
התנהגות מולקולה בודדת תחת הפרטורציה מכנית התאפיין באופן נרחב בהבנת תהליכים ביולוגיים רבים. עם זאת, שיטות כגון מיקרוסקופ של כוח אטומי יש ברזולוציה מוגבלת בזמן, בעוד Förster העברת אנרגיה (לדאוג) רק לאפשר את התצורות להיות משתמעת. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית, מצד שני, מאפשר בזמן אמת הדמיה באתרו של מולקולות יחיד בתנאי זרימה שונים. הפרוטוקול שלנו מתאר את השלבים ללכידת שינויים בbiomolecules בודדים תחת סביבות זרימת הטיה שונות באמצעות מיקרוסקופ קרינה. זרימת ההטיה נוצרת בתוך ערוצי microflu, ונשלטת על ידי משאבת מזרק. כמו הפגנות של השיטה, וון וילבלאנד מקדם (vwf) ו-DNA למדא מתויגים עם ביוטין ו fluorophore ולאחר מכן לקיבוע על פני הערוץ. הקונמציות שלהם מנוטרים ברציפות באמצעות הטיה משתנה באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת (TIRF) ומיקרוסקופ מיקרומוקד. הדינמיקה להתיר הפיך של VWF הם שימושיים להבנת כיצד תפקידה מוסדר בדם האדם, תוך היווצרות של DNA למדא מציע תובנות לביופיזיקה של קרו. הפרוטוקול יכול גם להיות מיושם באופן נרחב כדי ללמוד את ההתנהגות של פולימרים, במיוחד biopolymers, בתנאי זרימה שונים לחקור rheology של נוזלים מורכבים.
מנגנונים של כמה biomolecules להגיב לגירויים סביבתיים נחקרו רבות. בסביבת זרימה בפרט, הטיה והכוחות הelongational מווסת את השינויים המומסבותית והעלולים לתפקד כbiomolecules. דוגמאות טיפוסיות כוללות להטות המושרה לאחר למבדה DNA ו פון Willebrand פקטור (VWF). DNA למדא שימש כלי כדי להבין את הדינמיקה של הפרט, שרשראות פולימר גמיש ו rheology של פתרונות פולימריים1,2,3,4. VWF הוא חיישן זרימה טבעי כי אגרגטים טסיות באתרי הפצע של כלי הדם עם שיעורי גזירה חריגים דפוסי זרימה. להתיר של VWF חיוני בהפעלת האיגוד של טסיות לתחום A1 וכריכת קולגן לתחום A3. בנוסף, גבוהה המושרה להטות את התחום A2 התגלגלות מאפשר את המחשוף של vwf, אשר מווסת את התפלגות המשקל המולקולרי שלה במחזור5,6. כך, הדמיה ישירה של איך אלה מולקולות להתנהג תחת זרימה יכול לשפר מאוד את ההבנה הבסיסית של הביומכניקה שלהם ותפקוד, אשר בתורו יכול לאפשר אבחון הרומן ויישומים טיפוליים.
מתודולוגיות טיפוסיות לאפיון הקונמציות חד-מולקולות כוללות פינצטה אופטית/מגנטית, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ומולקולה חד-שגרתית של העברת אנרגיית תהודה (סריג)7. מולקולה בודדת ספקטרוסקופיית כוח הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור את הכוח ואת התנועה הקשורים השינויים הקונפורבית של biomolecules. עם זאת, היא חסרה את היכולת למפות הקונמציות מולקולריות הכולל8. Afm מסוגל הדמיה עם רזולוציה מרחבית גבוהה אבל הוא מוגבל ברזולוציה הטמפורלית9,10. בנוסף, קשר בין העצה לבין המדגם עשוי לבלבל את התגובה הנגרמת על ידי זרימה. שיטות אחרות כמו nanopore וניתוחים לקבוע קיפול חלבון יחיד מולקולה ומדינות התפתחות מבוסס על זיהוי של מרחק מולקולרי מתוך וכולל כמויות. עם זאת, שיטות אלה עדיין בחיתוליו ומוגבלות בהתבוננות ישירה של קונמציות בודדות של מולקולה אחת11,12,13,14.
מצד שני, התבוננות ישירה בקרו באמצעות הזמן הגבוה והרזולוציה המרחבית תחת מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית השתפרה בהבנת הדינמיקה של מולקולה בודדת בתהליכים ביולוגיים רבים15,16. לדוגמה, פו et al. לאחרונה השיגה ויזואליזציה סימולטני של התארכות VWF ומחייב קולטן טסיות בפעם הראשונה. בעבודתם, מולקולות VWF היו מנוכי על פני השטח של ערוץ microflu, באמצעות האינטראקציות biotin-streptavidin והתמונה תחת סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ (TIRF) בסביבות משתנות זרימת הטיה17. החלת שיטה דומה כמו פו של, אנחנו כאן להפגין כי קונמציות של VWF ו-DNA למדא ניתן לראות ישירות תחת השני TIRF ו-מיקרוסקופ הקונטמוקד. בדומה למוצג באיור 1, התקנים מיקרופלואידים משמשים ליצירה ולבקרה של זרימת הטיה, וbiomolecules מנודים על פני הערוץ. עם היישום של שיעורי גזירה שונים, תצורות של מולקולה זהה נרשמות למדוד את אורך ההארכה, המוצג גם באיור 1. השיטה יכולה להיות מיושמת באופן נרחב כדי לחקור התנהגויות פולימר אחרות מתחת לסביבות זרימה מורכבות עבור מחקרים מרטילוגיים וביולוגיים.
כדי להשיג נתונים באיכות גבוהה של מולקולה בודדת שינויים באמצעות מיקרוסקופ הזריחה כפי שמתואר בשיטה זו, זה קריטי כדי לסקול את המולקולה למשך הזמן המתאים, למזער את האינטראקציות הלא ספציפיות שלה עם פני השטח ולבסס הגדרות מיקרוסקופ הפחתת הלבנת התמונות. היכולת של המולקולה לשנות באופן חופשי את הקש…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע מענק DMS-1463234, המכונים הלאומיים לבריאות מענקים HL082808 ו AI133634, ואת Lehigh באוניברסיטת מימון פנימי.
Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |