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Bioengineering

Caratterizzazione dei cambiamenti conformazionali a singola molecola sotto il flusso di taglio con microscopia contro la fluorescenza

Published: January 25, 2020 doi: 10.3791/60784
Automatic Translation
1, *2, *3, 3, 1,2, 1,4
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University
* These authors contributed equally

Summary

Presentiamo un protocollo per l'immobilizzazione di singole macromolecole in dispositivi microfluidici e la quantificazione dei cambiamenti nelle loro conformazioni sotto il flusso di taglio. Questo protocollo è utile per caratterizzare le proprietà biomeccaniche e funzionali di biomolecole come proteine e DNA in un ambiente di flusso.

Abstract

Il comportamento di una singola molecola in perturbazione meccanica è stato ampiamente caratterizzato per comprendere molti processi biologici. Tuttavia, metodi come la microscopia a forza atomica hanno una risoluzione temporale limitata, mentre il trasferimento di energia a risonanza del Fàrster (FRET) consente solo di dedurre le conformazioni. La microscopia a fluorescenza, d'altra parte, consente la visualizzazione in tempo reale in situ di singole molecole in varie condizioni di flusso. Il nostro protocollo descrive i passaggi per catturare i cambiamenti conformazionali di singole biomolecole in diversi ambienti di flusso di taglio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Il flusso di taglio viene creato all'interno di canali microfluidici e controllato da una pompa di siringa. Come dimostrazioni del metodo, il fattore von Willebrand (VWF) e il DNA lambda sono etichettati con biotina e fluoroforo e quindi immobilizzati sulla superficie del canale. Le loro conformazioni sono continuamente monitorate sotto flusso di taglio variabile utilizzando la riflessione interna totale (TIRF) e la microscopia a fluorescenza confocale. Le dinamiche reversibili di svelamento di VWF sono utili per comprendere come la sua funzione è regolata nel sangue umano, mentre la conformazione del DNA lambda offre approfondimenti sulla biofisica delle macromolecole. Il protocollo può anche essere ampiamente applicato per studiare il comportamento dei polimeri, in particolare dei biopolimeri, in condizioni di flusso variabili e per studiare la reologia dei fluidi complessi.

Introduction

Sono stati ampiamente studiati i meccanismi di risposta alle biomolecole agli stimoli ambientali. In un ambiente di flusso in particolare, le forze di taglio e di allungamento regolano i cambiamenti conformazionali e potenzialmente la funzione delle biomolecole. Esempi tipici includono lo srotolamento indotto dalla cesoia del DNA lambda e il fattore von Willebrand (VWF). Il DNA Lambda è stato utilizzato come strumento per comprendere le dinamiche conformazionali delle singole catene polimeriche flessibili e la reologia delle soluzioni polimeriche1,2,3,4. VWF è un sensore di flusso naturale che aggrega le piastrine nei siti ferita dei vasi sanguigni con tassi di taglio anomali e modelli di flusso. Lo srotolamento di VWF è essenziale per attivare l'associazione delle piastrine al dominio A1 e il binding del collagene al dominio A3. Inoltre, l'elevata diffusione del dominio A2 indotto dalla cesoia consente la scissione di VWF, che regola la sua distribuzione del peso molecolare in circolazione5,6. Pertanto, la visualizzazione diretta di come queste molecole si comportano sotto il flusso può migliorare notevolmente la nostra comprensione fondamentale della loro biomeccanica e funzione, che a sua volta può consentire nuove applicazioni diagnostiche e terapeutiche.

Le metodologie tipiche per caratterizzare le conformazioni a singola molecola includono pinzette ottiche/magnetiche, microscopia a forza atomica (AFM) e trasferimento di energia a risonanza di rete (FRET)7a singola molecola. La spettroscopia a forza singola è un potente strumento per studiare la forza e il movimento associati ai cambiamenti conformazionali delle biomolecole. Tuttavia, manca la capacità di mappare le conformazioni molecolari complessive8. AFM è in grado di imaging ad alta risoluzione spaziale, ma è limitato nella risoluzione temporale9,10. Inoltre, il contatto tra la punta e il campione può confondere la risposta indotta dal flusso. Altri metodi come FRET e nanoporanalytics determinano gli stati di ripiegamento e dispiegamento delle proteine a singola molecola in base al rilevamento della distanza intramolecolare e dei volumi esclusi. Tuttavia, questi metodi sono ancora nella loro infanzia e limitati nella loro osservazione diretta di conformazioni a singola molecola11,12,13,14.

D'altra parte, osservare direttamente le macromolecole ad alta risoluzione temporale e spaziale nell'ambito della microscopia a fluorescenza ha migliorato la nostra comprensione della dinamica a singola molecola in molti processi biologici15,16. Ad esempio, Fu et al. ha recentemente raggiunto la visualizzazione simultanea dell'allungamento del VWF e del legame del recettore delle piastrine per la prima volta. Nel loro lavoro, le molecole VWF sono state immobilizzate sulla superficie di un canale microfluidico attraverso interazioni biotina-streptavidine e immagini sotto microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF) in diversi ambienti di flusso di taglio17. Applicando un metodo simile a quello di Fu, qui dimostriamo che le conformazioni del VWF e del DNA lambda possono essere osservate direttamente sia nella microscopia TIRF che confocale a fluorescenza. Come illustrato nella Figura 1,i dispositivi microfluidici vengono utilizzati per creare e controllare il flusso di taglio e le biomolecole vengono immobilizzate sulla superficie del canale. Al momento dell'applicazione di tassi di taglio variabili, le conformazioni della stessa molecola vengono registrate per misurare la lunghezza dell'estensione, mostrata anche nella Figura 1. Il metodo potrebbe essere ampiamente applicato per esplorare altri comportamenti polimerici in ambienti di flusso complessi per studi reologici e biologici.

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Protocol

1. Preparazione di VWF

  1. Ricostituire il VWF plasma umano per prepararlo alle reazioni di etichettatura. Aggiungete 100 l'l di acqua deionizzata (DI) a 100 g di VWF liofilizzato per creare una soluzione di stock da 1 mg/mL VWF.
  2. Dialyze Soluzione di stock VWF al fine di rimuovere l'eccesso di glicina, aumentando così l'efficienza di etichettatura della biotina e del fluoroforo.
    1. Trasferire 50 l di VWF in un'unità di dialisi da 0,1 ml con un taglio e guarnizione di peso molecolare di 10.000 unità molecolari. Conservare la soluzione di stock rimanente a -20 gradi centigradi. Lo stock di VWF sarà stabile fino a 1 anno a -20 gradi centigradi.
    2. Eseguire la dialisi in 500 mL di 1x di salina sterile con buffer di fosfato (PBS) (0,01 M disodio fosfato, 0,0018 fosfato monopotassio, 0,0027 Clidrato di potassio, 0,137 M di cloruro di sodio, pH 7,4 a 25 gradi centigradi) Ripetere la dialisi per un'ora aggiuntiva utilizzando 500 mL di PBS fresco.
  3. Iniziare la reazione di etichettatura biotina. Preparare una soluzione da 2 mM di NHS-PEG4-biotin a sciogliendo il solido in acqua DI immediatamente prima della reazione. Consentire a NHS-PEG4-biotina di rimanere in acqua per un tempo prolungato causerà l'idrolizzare il gruppo NHS-ester, riducendo così l'efficienza di etichettatura.
    1. Aggiungete 2,5 ll di 2 mM NHS-PEG4-biotinall all'unità di dialisi contenente la soluzione di stock VWF. Ciò si tradurrà in un eccesso molare di biotina di 20 volte rispetto ai monomeri VWF. Le aree primarie di VWF reagiranno con i gruppi NHS-ester, legandosi in modo covalente ai gruppi peg4-biotin tramite collegamenti intermedi.
    2. Posizionare l'unità di dialisi all'interno di un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Sigillare l'unità di dialisi con il tappo corrispondente. Fissare il gruppo tube-dialisi con Parafilm. Mantenere in posizione verticale e lasciare a temperatura ambiente per 40 min.
  4. Iniziare la reazione di etichettatura del fluoroforo. Preparare una soluzione di 2,8 mM di Alexa 488 tetrafluorophenyl-ester (TFP-ester) colorante fluorescente (eccitazionemax 498 nm,massimo di emissione 519 nm) disrisolvendo il solido fluoroforo nell'acqua DI. Eseguire questa operazione immediatamente prima della reazione per evitare che il gruppo TFP-ester si istitri.
    1. Aggiungere 2,9 litri del fluoroforo di 2,8 mM all'unità di dialisi. Ciò si tradurrà in un eccesso molare di fluoroforo 34 volte rispetto ai monomeri VWF. Le restanti ammine primarie di VWF reagiranno con i gruppi TFP-ester, legandosi in modo covalente ai fluorofori tramite collegamenti a metà.
    2. Aggiungere 2,0 lofan di bicarbonato di sodio da 1 M (sciolto nell'acqua DI) all'unità di dialisi. Questo regola il pH della reazione più vicino a 8.0, che aumenta l'efficienza del TFP-ester e la reazione dell'ammina primaria.
    3. Fissare l'unità di dialisi in un tubo di microcentrifuga proprio come nel passaggio 1.3.2. Conservare al buio per evitare il fotosbiancamento e lasciare a temperatura ambiente per 1 h e 30 min.
  5. Collocare l'unità di dialisi in 900 mL di 1x PBS sterile e dialpare durante la notte a 4 gradi centigradi. Ciò produrrà circa 70 l di VWF etichettato ad una concentrazione di 0,71 mg/mL o 2,84 M (concentrazione di monani).
  6. Trasferire vWF etichettato in un tubo di microcentrismo. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e proteggere dalla luce. Conservare a 4 gradi centigradi. Per lo stoccaggio a lungo termine, aggiungere l'azide di sodio dell'agente antimicrobico a una concentrazione finale dello 0,02% (w/v).
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. Preparazione del DNA Lambda

  1. Biotinylate lambda lineare DNA riempiendo i suoi siti finali coesivi (siti cos) con nucleotidi biotina-14-dCTP secondo i protocolli standard, ripetuto qui al passo 2.118. Compilare il resto dei siti cos con nucleotidi dATP, dTTP e dGTP.
    1. Preparare 1 mM di soluzioni di dATP, dTTP, dGTP e biotina-14-dCTP in un buffer di reazione 10x (500 mM di cloruro di sodio, 100 mM di cloruro di Tris, 100 mM di cloruro di magnesio, 10 mM dithiothreitol, pH 7,9 a 25 gradi centigradi).
    2. Mettete 48 lun di 500 ng/L di DNA lambda in un tubo PCR e riscaldate per 5 min a 65 gradi. I siti cos del DNA lambda circolare si separeranno sotto il calore, linearizzando la molecola e rendendo gli sbalzi a filamento singolo pronti per la biotinylazione. Subito dopo, mettere sul ghiaccio per evitare che i siti cos si ri-annealing.
    3. Aggiungete al DNA lambda di 5 ll di 1 mM dATP, dTTP e dGTP e di 4 MM biotina-14-dCTP. Aggiungete anche 2,5 L di 5 frammenti di Klenow U/L (3'à5' exo-) per catalizzare la sintesi del DNA.
    4. Incubare la miscela di reazione per 1 h a 37 .
    5. Aggiungete 1,2 m di EDTA. Quindi riscaldare la miscela di reazione per 5 minuti a 70 gradi centigradi. Questo disattiverà il frammento di Klenow e la reazione biotinylazione.
  2. Rimuovere i nucleotidi in eccesso dal DNA lambda utilizzando una colonna di spin che può contenere 10-70 l e ha un taglio di peso molecolare di 6.000.
    1. Posizionare la colonna all'interno di un tubo di microcentrifuga da 2 mL. Centrifugare la colonna e il tubo a 1000 x g per 2 min. Dispose di flow-through che si raccoglie nel tubo.
    2. Sostituire il buffer di colonna con una soluzione 1x dello stesso buffer di reazione dal passaggio 2.1.1. A tale scopo, aggiungere 500 l- l of 1x buffer alla colonna. Centrifuga per 1 min a 1000 x g. Eliminare il flusso attraverso. Ripetere queste 2 volte in modo che alla colonna sia stato aggiunto un totale di 1500 l.
    3. Collocare la colonna in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Aggiungere con attenzione la soluzione dal passaggio 2.1.5 allo strato superiore della colonna. Centrifuga per 4 min a 1000 x g.
    4. Raccogliere il flusso attraverso (40-70 l) dal tubo di microcentrifuga e posizionare in un tubo PCR. Questo contiene il DNA lambda purificato e biotinylato.
  3. Etichettare il DNA lambda con colorante fluorescente YOYO-1 (massimoeccitazione - 490 nm,numero massimo di emissioni - 509 nm) secondo i protocolli standard, ripetuto qui nel passaggio 2.3.120.
    1. Preparare una soluzione di coloranti YOYO-1 e DNA lambda con un rapporto molare da coloranti a coppia base di 1:10. Si supponga che nessun DNA sia stato perso nella fase di purificazione per calcolare la concentrazione della coppia di basi del DNA lambda. Il DNA lambda a lunghezza intera ha 48.502 coppie di basi.
      NOTA: Ad esempio, se dal punto 2.2.4 è stato recuperato il valore 50OL della soluzione, aggiungere 7,4 DI YOYO-1.
    2. Riscaldare la soluzione per 2 h a 50 gradi centigradi al buio per completare la reazione.
    3. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e proteggere dalla luce. Conservare a 4 gradi centigradi. La soluzione è ora pronta per essere iniettata in dispositivi microfluidici.
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

3. Creazione di stampi di canale microfluidico in wafer di silicio

  1. Utilizzare la fotolitografia per creare canali microfluidici con dimensioni appropriate (Figura 2) su un wafer di silicio master secondo i protocolli standard19.

4. Preparazione del dispositivo microfluidico polidimetilsilàxana (PDMS)

  1. Aggiungere 5 parti in silicone elastomer base a 1 parte agente di polimerità (per massa) in una barca di pesatura. Mescolare accuratamente il contenuto per 1 min per creare una soluzione PDMS pre-curata.
  2. Mettere il wafer di silicio maestro in un piatto di plastica Petri. Versare la soluzione PDMS sul wafer per creare uno strato da 5 mm. Coprire il piatto e lasciare in un desiccatore sotto vuoto per 1 h per rimuovere le bolle d'aria.
  3. Incubato coperto piatto Petri a 60 gradi durante la notte per curare PDMS in un solido flessibile. La cura si tradurrà in canali microfluidici modellati nel PDMS nell'interfaccia PDMS-wafer.
  4. Tagliare rettangoli da 20 x 10 mm nel PDMS, intorno a ogni canale microfluidico, utilizzando un rasoio. Rimuovere i blocchi PDMS rettangolari con una pinzetta.
  5. Utilizzare un ago di estremità smussato da 25 G con spigoli affilati per perforare un foro di 0,5 mm di diametro ad un'estremità del canale, assicurandosi che il foro passi completamente attraverso il blocco PDMS (Figura 2). Utilizzare un ago sottile per perforare PDMS dal foro. Ripetere l'operazione all'altra estremità del canale. Questo creerà un ingresso e presa per il flusso attraverso il canale.
  6. Pulire la superficie del blocco PDMS con nastro adesivo in vinile. Soffiare il gas di azoto compresso su un n. 1 1/2, 22 x 50 mm coverslip per rimuovere i detriti.
  7. Posizionare il blocco PDMS con il lato del canale verso l'alto e il coperchio nella camera di una macchina per il collegamento al plasma. Inizia il trattamento.
  8. Quando il trattamento è completo, posizionare rapidamente il blocco PDMS su un coperchio in modo che il canale sia in contatto con lo slip. Applicare la pressione lungo i bordi del blocco. Posizionare l'assieme coverslip-PDMS su una piastra calda a 115 gradi centigradi per 15 min per rafforzare il legame permanente.
  9. Inserire 10 cm di lunghezza, 0,25 mm di diametro interno tubing nel foro di uscita nella parte superiore del blocco PDMS. Ciò consente al fluido di fluire facilmente fuori dal canale. Il dispositivo è ora completo.

5. Trattamento della superficie del dispositivo microfluidico

  1. Iniettare l'albumina del siero bovino (BSA-biotin) disciolto nello sterile 1x PBS nell'insediazione del dispositivo microfluidico per gli esperimenti VWF. Iniettare <10 - L di 1 mg/mL BSA-biotin per esperimenti sul DNA lambda. Trattenere alcuni microlitri di BSA-biotina nella punta della pipetta dopo l'iniezione e lasciare che la punta rimanga incorporata nell'inseridio.
    1. Tenere sempre una goccia d'acqua DI intorno alla punta. Ciò impedirà alle bolle d'aria di entrare nel canale. Applicare questa tecnica ogni volta che una nuova soluzione viene iniettata nel canale.
    2. Lasciare incubare BSA-biotina nel dispositivo per 2 h. La BSA non si legherà in modo specifico alla superficie coverslip (Figura 3A).
  2. Rimuovere la punta della pipetta. Iniettare <10 - L di casocarina soluzione di blocco nel canale e lasciarlo incubare per 30 min. La caseina bloccherà eventuali siti liberi, riducendo il legame non specifico di biomolecole alla superficie (Figura 3B).
  3. Rimuovere la punta e iniettare <10 - L of 10 g/mL streptavidin disciolto in sterile 1x PBS nel canale per gli esperimenti VWF. Utilizzare 100 streptavidina di g/mL per gli esperimenti sul DNA lambda. Incubare per 10 min. La streptavidina si legherà ai gruppi di biotina della BSA-biotina (Figura 3C).
  4. Rimuovere la punta e iniettare <10 - L of 1x detergente (0.05% Tween 20 in PBS) nel canale per lavare via lo streptavidino in eccesso.
  5. Rimuovere la punta e iniettare <10 - L di VWF da 28,4 nM diluito nella soluzione caseina o DNA lambda dal passaggio 2.3.3. Incubare VWF per 3 min. Incubare il DNA lambda per 45 min (Figura 3D).
  6. Rimuovere la mancia e iniettare <10 - L di biotina libera da 5 mM diluita in soluzione caseina. La biotina gratuita bloccherà i siti di legame della streptavidina in eccesso sulla superficie del canale (Figura 3E).

6. Visualizzazione del DNA VWF e Lambda in microscopia a fluorescenza

  1. Preparare 1 mL di soluzione di blocco della caseina con 2,2 mM di acido protocatechuic e 37 nM protocatechuate-3,4-diossigenasi (per ridurre al minimo il fotobleaching). Caricare in una siringa e fissare in una pompa di siringa. Prendere 30 cm di lunghezza, 0,25 mm di diametro interno tubi e collegare un'estremità all'ago della siringa. Flusso nella soluzione per rimuovere le bolle d'aria. Attaccare l'altra estremità del tubo all'inserimento del dispositivo microfluidico. Si consiglia di farlo 3 minuti dopo il passaggio 5.6.
  2. Selezionare l'obiettivo di ingrandimento più alto (ad esempio, 60-100X) di una riflessione interna totale (TIRF) o al microscopio a fluorescenza confocale. Aggiungere una goccia di olio di immersione sul suo obiettivo, se necessario. Posizionare il dispositivo microfluidico sullo stadio del microscopio in modo che il coperchio sia a filo con l'obiettivo.
  3. Avviare la microscopia del campo luminoso. Regolare la messa a fuoco in modo che tutte le funzioni, come detriti e bolle, siano visibili. Quindi regolare lo stage nella direzione X e Y fino a quando il bordo del canale microfluidico è visibile e seziona il fotogramma.
  4. Passare al canale 488 (FITC). Regolare il livello di z e l'angolo TIRF in base alle esigenze fino a quando non si possono distinguere singole molecole verdi e globulari. Si tratta di molecole di DNA VWF o lambda.
  5. Regola il tempo di esposizione e l'intensità del laser per visualizzare le molecole fluorescenti senza fotoblilare troppo rapidamente. Regolare il contrasto per visualizzare le molecole in modo più chiaro.
  6. Avviare il flusso dalla pompa della siringa in modo che la caseina di blocco della soluzione scorra nel canale e fuori dalla presa. Eseguire questa operazione esattamente 5 minuti dopo il passaggio 5.6. Arrestare e avviare il flusso per osservare i cambiamenti nella conformazione delle molecole. Quando si applica il flusso, utilizzare velocità comprese tra 5.000 e 30.000 l/h. Ripetere questo in varie aree del dispositivo microfluidico. Continuare questo processo per individuare le molecole che possono estendere e rilassarsi su più cicli di arresto e di flusso di partenza.
  7. Notare quanto tempo ci vuole perché le molecole raggiungano la massima estensione e si rilassino completamente nei globuli. Registra video del comportamento continuo delle molecole sotto il flusso di taglio, selezionando il miglior tempo di esposizione, la frequenza di esposizione e la durata del video che cattureranno l'intera gamma di comportamenti estensioni e ridurranno al minimo il fotosbiancamento.
  8. Salvare i video con nome . File AVI con una barra della scala.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

7. Analisi dell'immagine dei cambiamenti conformazionali

  1. Calcolare la velocitàSymbol 1di taglio della parete ( ) applicata alle macromolecole utilizzando la portata (Q) e l'altezza (h) e la larghezza (w) del canale microfluidico rettangolare. Per eseguire questa operazione, utilizzare l'equazione seguente:
    Equation 1
  2. Determinare la lunghezza di qualsiasi biomolecola in vari tassi di taglio utilizzando un codice MATLAB personalizzato (vedere File supplementari). Creare un'analisi dei video con titolo cartella che includa i seguenti codici MATLAB: main.m, save_each_frame.m, get_length.m e get_length.fig. Creare una sottocartella all'interno di video di analisi intitolata video e aggiungere . file AVI da analizzare in esso.
  3. Aprire main.m utilizzando MATLAB 2019a ed eseguire il codice. Digitare il nome del file video da analizzare nella finestra di comando in Immettere il file di dati da analizzare:.
  4. Nell'interfaccia utente grafica aperta (GUI), impostare la soglia (testo nella casella in alto a destra della finestra) a 20 e fare clic sul pulsante Imposta soglia per confermare.
  5. Usa il cursore dati nella barra degli strumenti superiore della finestra per scegliere un pixel in un punto qualsiasi della barra della scala. Fare clic su Punto iniziale nella sezione Barra della scala a destra della finestra. La posizione (x,y) del pixel scelto apparirà a destra del pulsante. Fare clic sul pulsante Dimensione pixel (m). Le dimensioni in pixel devono essere misurate una sola volta in ogni video.
  6. Scegli qualsiasi pixel sulla molecola di interesse. Fare clic su Punto iniziale nella sezione VWF. Dopo che la posizione del pixel scelto appare sulla casella di testo a destra, fare clic su Estremità sinistra, Fine destra e Lunghezza stringa per ottenere la lunghezza molecolare nell'immagine.
    NOTA: questo passaggio può essere utilizzato per analizzare i cambiamenti conformazionali di qualsiasi biomolecola, nonostante il codice abbia una sezione specifica denominata VWF.
  7. Controllare due volte l'estremità sinistra e destra della molecola. Eseguire lo zoom avanti e utilizzare il cursore dati per verificare la posizione in pixel di interesse. Scegliere manualmente il pixel come fine e ricalcolare la lunghezza (in pixel) quando necessario.
  8. Registrate la dimensione in pixel in formato m e lunghezza della stringa in numero di pixel in un foglio di Excel e calcolate la lunghezza della stringa in m.
  9. Ripetere i passaggi precedenti per ogni immagine. Usa ultimo, Successivo nell'angolo in basso a destra della GUI per passare da un'immagine all'altra nello stesso file video. Fare clic su Chiudi per chiudere la finestra GUI.

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Representative Results

Osservare il comportamento dinamico di biomolecole come VWF e DNA lambda dipende fortemente dall'ottimizzazione del loro legame alla superficie del dispositivo. L'incubazione di trattamenti superficiali per i tempi raccomandati nel dispositivo microfluidico è fondamentale per ottenere il legame con alcuni punti di ancoraggio, in modo che le molecole possano estendere liberamente e rilassarsi al momento del flusso mutevole. Se le proteine o il DNA sono legati troppo fortemente con più collegamenti, si estenderanno a lunghezze limitate o non si estenderanno affatto. Ciò si verifica in particolare con VWF quando rimane senza flusso sulla superficie del dispositivo per più di 3 minuti prima del blocco gratuito della biotina. Più lungo è la stagnazione del VWF sulla superficie, più gruppi di biotina VWF si legano ai gruppi di streptavidin di superficie e minore è la flessibilità di svelatura della molecola. Se le molecole sono legate troppo debolmente, d'altra parte, si staccano sul flusso e scompaiono dalla vista. Ciò può verificarsi se il DNA VWF o lambda viene incubato per periodi troppo brevi, causando la formazione di un numero troppo basso di interazioni biotina-streptavidin. Le molecole possono anche liberarsi quando vengono applicati tassi di taglio estremamente elevati (>200,000 s-1),indebolendo le interazioni biotina-streptavidin.

Una molecola ideale si lega a tal punto che può dipanarsi e rilassarsi su più cicli di arresto e di partenza del flusso. La flessibilità di una molecola per cambiare la conformazione come questa è spesso dimostrata dalla sua capacità di estendere ad aumentare le lunghezze come tassi di taglio più elevati sono applicati all'interno di una gamma di flusso crescente. Le immagini di VWF ottenute con microscopia TIRF dimostrano questa relazione nel Video 1. La curva di estensione rispetto al tasso di taglio di questa stessa molecola VWF nella Figura 4 acquisisce con precisione il comportamento indotto dalla cesoia di una molecola VWF ed è utile per caratterizzare le proprietà biomeccaniche della proteina. Le immagini del DNA lambda ottenute con microscopia a fluorescenza confocale mostrano allo stesso modo una maggiore estensione su tassi di taglio più elevati e rilassamento graduale oltre 2 min, come viene catturato nei Video 2 e Video 3. Anche le caratteristiche di recidiva del DNA lambda dopo il flusso interrotto sono rappresentate graficamente nella Figura 5.

Figure 1
Figura 1: Schemi dell'esperimento di flusso a singola molecola nel canale microfluidico sotto microscopia a fluorescenza. La superficie del canale è rivestita con BSA-biotina e bloccata con la caseina. La Streptavidina è legata alla biotina sulla superficie del canale e anche al DNA VWF/lambda biotinyale per immobilizzare singole molecole sulla superficie. Quando la velocità di taglio aumenta da A a C, la molecola viene estesa da uno stato piegato a uno stato allungato lungo la direzione del flusso da sinistra a destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Dimensioni del canale microfluidico. La forma e la struttura del dispositivo microfluidico PDMS vengono visualizzate insieme alle dimensioni del canale. L'altezza del canale è di 50 m e varia da 0,1 a 1,0 mm di larghezza. La regione di restringimento al centro del canale è di 0,7 mm di lunghezza. L'uscita e l'uscita hanno un diametro di 0,5144 mm (25 G). La direzione del flusso è da sinistra a destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Passaggi di trattamento delle superfici per l'immobilizzazione a singola molecola. Tutti i passaggi si verificano a temperatura ambiente. (A). LA BSA-biotina viene rivestita sulla superficie per 2 h. (B). La caseina viene iniettata nel canale per 30 min per bloccare la superficie. (C). Lo Streptavidin viene incubato nel canale per 10 min per legarsi con la biotina BSA. (D). Dopo aver lavato via le molecole in eccesso nei precedenti passi, il fluoroforo e la biotina etichettati VWF/lambda DNA vengono iniettati nel canale e immobilizzati attraverso il legame con streptavidin. (E). La biotina libera fluisce, bloccando siti di legame di streptavidin extra per ridurre al minimo la sua interferenza con la molecola durante i cambiamenti conformazionali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Comportamento di estensione di VWF in flusso di taglio. La molecola si svela in modo reversibille a 7 diverse velocità di taglio: 0 s-1, 33.333 s-1, 66.667 s-1, 100.000 s-1, 133.333 s-1, 166.667 s-1 e 200.000 s-1. La lunghezza della molecola allungata aumenta da 0,52 m a zero tasso di taglio a 3,44 m a 200.000 s-1 tasso di taglio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Comportamento di rilassamento del DNA lambda dopo l'arresto del flusso di taglio. Il flusso con 33.000 s-1 e 66.667 s-1 tassi di taglio vengono applicati da 0 a 30 s alla stessa molecola. Il rilassamento è registrato da 30 s a 150 s. Con una velocità di taglio di 66.667 s-1, la molecola di DNA si allunga fino a 15,00 m e si rilassa a 5,83 m dopo che il flusso è stato fermato per 2 min. Con una velocità di taglio di 33.333 s-1, la molecola si estende solo fino a 8,75 m e ha una lunghezza di 3,33 m dopo 2 min di rilassamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1
Video 1: Srotolamento reversibile di VWF con tassi di taglio crescenti utilizzando la microscopia tiorescenza totale della pressione interna (TIRF). La molecola al centro della vista si dipana in modo reversibilmente a una lunghezza diversa a tassi di taglio 33.333 s-1,66.667 s-1, 100.000 s-1 e 133.333 s-1. Una pompa di siringa viene utilizzata per controllare la portata da cui vengono calcolate le velocità di taglio. La direzione del flusso è da sinistra a destra. Le immagini vengono scattate con intervalli di 15 s per consentire processi di rilassamento e di estensione completi. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Video 2
Video 2: Rilassamento del DNA lambda dopo 33.333 s-1 tasso di taglio. Le immagini vengono scattate in microscopia a fluorescenza confocale. Il DNA lambda è allungato sotto 33.333 s-1 flusso di taglio e rilassato di nuovo a uno stato piegato dopo che il flusso è stato fermato a 30 s. La durata del rilassamento è di 2 minuti. Le immagini vengono scattate con intervalli di 30 s in mezzo. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Video 3
Video 3: Rilassamento del DNA lambda dopo 66.667 s-1 tasso di taglio. Le impostazioni sono identiche a quelle del Video 2, ad eccezione della frequenza di taglio iniziale. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

File supplementari: codici MATLAB. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Per ottenere dati di alta qualità dei cambiamenti conformazionali a singola molecola utilizzando la microscopia a fluorescenza come descritto in questo metodo, è fondamentale incubare la molecola per la quantità di tempo appropriato, ridurre al minimo le sue interazioni non specifiche con la superficie e definire le impostazioni del microscopio che riducono il fotosbiancamento. La capacità della molecola di cambiare liberamente la conformazione è correlata al numero di interazioni biotina-streptavidina formate tra la molecola e la superficie. Come accennato in precedenza, questo deve essere controllato incubando la molecola senza flusso per la quantità di tempo appropriato. Inoltre, proteine o DNA possono non specificamente legarsi al coperchio se il coperchio non è bloccato in modo efficace. Senza la soluzione di blocco raccomandata, le molecole possono attaccarsi al vetro in modo non specifico e non rispondere a qualsiasi portata applicata. L'applicazione del blocco caseina durante il trattamento superficiale precoce e il mantenimento della sua presenza durante il flusso è essenziale per ridurre queste interazioni non specifiche. Infine, catturare il comportamento continuo e dinamico di una singola molecola richiede frequenti emozioni da fluoroforo durante l'acquisizione dell'immagine. Ciò può causare un rapido fotosbiancamento se l'intensità del laser, il tempo di esposizione e la frequenza di esposizione sono troppo elevati. È quindi necessario regolare queste impostazioni in tandem e strategizzare come ridurre i loro valori senza compromettere il tempo o la risoluzione dell'immagine dei dati.

Se l'estensione e il rilassamento della molecola non sono osservati, devono essere seguiti ulteriori passi. Incubare la molecola nel dispositivo per tempi più lunghi e più brevi rispetto a quanto consigliato nel protocollo. Per ogni volta che viene testato, variare le concentrazioni di BSA-biotina e streptavidin da fattori di 10. Questi test possono essere necessari per ottimizzare il numero di punti di ancoraggio biotina-streptavidin formati tra la molecola e la superficie. Ad esempio, se la densità di etichettatura della biotina è molto elevata, a causa delle deviazioni dalle concentrazioni raccomandate o dai reagenti nel protocollo di etichettatura, potrebbero essere necessari tempi di incubazione molecolari più brevi e concentrazioni di biotina e streptavidina inferiori. Per migliorare ulteriormente il successo dell'esperimento, scansiona l'intero dispositivo microfluidico alla ricerca di molecole che si dipanano in modo reversibilmente. La superficie non può essere trattata uniformemente con streptavidina o blocco di caseina, causando molecole in determinate aree di avere maggiori risposte di srotolamento rispetto ad altri.

Questo metodo è limitato dalla mancanza di informazioni sulle dimensioni e sui punti di tethering della molecola, dalla difficoltà di produrre la velocità di taglio 0 s-1 e dalla risoluzione ottica dei microscopi a fluorescenza. Il lavoro precedente ha mostrato una grande variazione nel comportamento di svelamento di VWF, potenzialmente spiegato dall'ampia distribuzione nel numero e nella posizione dei punti di tether biotina-streptavidin e dal peso molecolare di ciascuna molecola VWF18. Al momento, il metodo che presentiamo non può definire punti di tether e dimensioni molecolari. Tuttavia, le simulazioni di dinamiche browniane di un modello VWF a grana grossa pubblicata da Wang e altri incorporano queste variabili e possono essere eseguite insieme ai risultati sperimentali per spiegare tale variazione18. Inoltre, il flusso non si ferma istantaneamente quando la pompa della siringa viene fermata, confondendo l'osservazione delle dinamiche di rinculo. Ciò è dovuto alla deformazione e alla leggera dilatazione del canale PDMS durante il periodo di flusso previsto. Quando la pompa viene arrestata, il fluido continua a fluire fino a quando il PDMS non è completamente rilassato. Un sistema migliorato dovrebbe utilizzare PDMS più rigida o microcanali fabbricati in materiali plastici duri, consentendo al fluido di raggiungere più rapidamente una velocità di taglio 0 s-1. Infine, si possono risolvere solo molecole la cui dimensione è sullo stesso ordine di grandezza della risoluzione ottica del microscopio a fluorescenza, che non può essere inferiore a poche centinaia di nanometri. Quindi, c'è un requisito di dimensione minima per le molecole che possono essere osservate direttamente con questo metodo.

Il protocollo attuale riguarda principalmente la quantificazione dei cambiamenti conformazionali delle molecole di proteine e DNA sotto flusso fisiologico. Tuttavia, il metodo può anche essere utilizzato per visualizzare le interazioni in tempo reale tra molecole biologiche e caratterizzare ulteriormente la proteina e la funzione del DNA. Per esempio, Fu et al. hanno dimostrato che il VWF legato può attivarsi in un flusso di taglio elevato e catturare ulteriormente la molecola di adesione piastrinica GPIb - in condizioni di flusso variabili17. Questo evento vincolante viene mantenuto anche quando VWF è legato alla superficie da collegamenti biotina-streptavidin, dimostrando l'efficacia di questo protocollo per studiare le funzioni e i meccanismi fisiologicamente rilevanti17. Simili intuizioni meccanicistiche potrebbero essere ottenute studiando le interazioni tra DNA svelato e proteine regolatorie negli ambienti di flusso21,22. Inoltre, il nostro metodo riguarda principalmente l'osservazione dei cambiamenti conformazionali nelle macromolecole. Tuttavia, si potrebbe adattarlo allo scopo di studiare molecole più piccole che sono abbastanza grandi da essere risolte sotto la microscopia a fluorescenza. Ad esempio, attaccando in modo non covalente o covalente una piccola molecola a un DNA lambda molto più grande e immobilizzato, si potrebbe aumentare la sensibilità all'taglio della molecola più piccola e osservarne più facilmente il comportamento. In conclusione, altri metodi di caratterizzazione a singola molecola, come AFM o pinzette ottiche, forniscono dati ad alta risoluzione sulle proprietà strutturali e funzionali delle macromolecole; tuttavia, questi metodi alternativi non possono osservare i cambiamenti dinamici e conformazionali delle proteine e del DNA che avvengono in un ambiente di flusso fisiologico, come viene presentato in questo protocollo.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione della National Science Foundation DMS-1463234, National Institutes of Health grants HL082808 e AI133634, e finanziamenti interni della Lehigh University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Labeling Kit Invitrogen A30006
Bio-Spin P-6 Gel Columns Bio-Rad 7326221
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Use as free biotin in Step 5.6
Biotin-14-dCTP AAT Bioquest 17019
BSA-Biotin Sigma-Aldrich A8549
Coverslips VWR 48393-195 No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP Set Invitrogen 10297018
Float Buoys for Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69588
Klenow Fragment (3'→5' exo-) New England BioLabs M0212S Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2
Lambda DNA New England BioLabs N3011S
Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69570 10K MWCO, 0.1 mL volume
NEBuffer 4 New England BioLabs B7004S
NHS-PEG4-Biotin Thermo Scientific 21330
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase Sigma-Aldrich P8279
Protocatechuic acid Santa Cruz Biotechnology sc-205818
Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication The Dow Chemical Company 4019862
Streptavidin Sigma-Aldrich 85878
The Blocking Solution CANDOR Bioscience 110 050 Use as casein blocking solution throughout protocol
Vinyl Cleanroom Tape Fisher Scientific 19-120-3217
von Willebrand Factor, Human Plasma Millipore Sigma 681300
YOYO-1 Dye AAT Bioquest 17580
0.25 mm Inner Diameter Tubing Cole-Parmer EW-06419-00
25 Gauge Needle Thomas Scientific JG2505X

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References

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Bioingegneria Numero 155 fattore von Willebrand DNA lambda microfluidica flusso di taglio TIRF microscopia a fluorescenza confocale
Caratterizzazione dei cambiamenti conformazionali a singola molecola sotto il flusso di taglio con microscopia contro la fluorescenza
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Pisapati, A. V., Wang, Y., Blauch,… More

Pisapati, A. V., Wang, Y., Blauch, M. E., Wittenberg, N. J., Cheng, X., Zhang, X. F. Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60784, doi:10.3791/60784 (2020).

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