Summary
우리는 미세 유체 장치에서 단일 거대 분자를 고정시키고 전단 흐름하에서 적합성의 변화를 정량화하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 유동 환경에서 단백질 및 DNA와 같은 생체 분자의 생체 역학 적 및 기능적 특성을 특성화하는 데 유용합니다.
Abstract
기계적 섭동 하에서 단일 분자 거동은 많은 생물학적 과정을 이해하는 것이 널리 특징지어졌다. 그러나, 원자력 현미경 검사법과 같은 방법은 시간적 분해능이 제한되어 있는 반면, Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 적합성만 유추할 수 있습니다. 형광 현미경 검사법은, 다른 한편으로는, 각종 교류 조건에 있는 단 하나 분자의 situ 가시화에서 실시간 허용합니다. 우리의 프로토콜은 형광 현미경 검사법을 사용하여 다른 전단 흐름 환경에서 단일 생체 분자의 형태 변화를 포착하는 단계를 설명합니다. 전단 흐름은 미세 유체 채널 내부에서 생성되며 주사기 펌프에 의해 제어됩니다. 방법의 데모로, 폰 윌레브란트 인자 (VWF) 및 람다 DNA는 비오틴과 플루오로포어로 표지된 다음 채널 표면에 고정됩니다. 이들의 적합성은 총 내부 반사(TIRF) 및 공초점 형광 현미경 을 사용하여 가변 전단 흐름 하에서 지속적으로 모니터링됩니다. VWF의 가역적 해명 역학은 그 기능이 인간의 혈액에서 어떻게 조절되는지 이해하는 데 유용하며 람다 DNA의 형태는 거대 분자의 생물 물리학에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 다양한 유동 조건에서 폴리머, 특히 생체 고분자의 거동을 연구하고 복잡한 유체의 유변학을 조사하기 위해 널리 적용될 수 있습니다.
Introduction
생체 분자가 환경 자극에 반응하는 방식의 메커니즘은 널리 연구되었습니다. 특히 유동 환경에서 전단 및 연신력은 형태 변화와 잠재적으로 생체 분자의 기능을 조절합니다. 대표적인 예로는 람다 DNA 및 폰 윌레브란트 인자(VWF)의 전단 유도 해명이 있다. 람다 DNA는 개별, 유연한 폴리머 사슬의 형태 역학 및 폴리머 용액1,2,3,4의변성학을 이해하는 도구로 사용되어 왔다. VWF는 비정상적인 전단 속도 및 흐름 패턴으로 혈관의 상처 부위에 혈소판을 응집시키는 자연 유량 센서입니다. VWF의 해명은 A1 도메인에 혈소판의 결합을 활성화하고 A3 도메인에 결합하는 콜라겐을 활성화시키는 데 필수적이다. 또한, 높은 전단 유도 A2 도메인 전개는 순환5,6에서분자량 분포를 조절VWF의 분열을 허용한다. 따라서, 이 분자가 흐름의 밑에 어떻게 작동하는지의 직접적인 시각화는 그(것)들의 생체 역학 및 기능에 대한 우리의 근본적인 이해를 크게 향상할 수 있고, 이는 차례차례로 새로운 진단 및 치료 응용을 가능하게 할 수 있습니다.
단일 분자 적합성을 특성화하는 일반적인 방법론으로는 광학/자기 핀셋, 원자력 현미경 검사법(AFM) 및 단일 분자 Förster 공명 에너지 전달(FRET)7이포함됩니다. 단 하나 분자 힘 분광학은 생체 분자의 형태 변화와 관련되었던 힘 그리고 운동을 조사하는 강력한 공구입니다. 그러나, 전체 분자 적합성을 매핑하는 능력이 부족하다8. AFM은 높은 공간 해상도로 이미징이 가능하지만 시간해상도9,10으로제한됩니다. 또한, 팁과 샘플 사이의 접촉은 흐름에 의해 유도된 반응을 혼동시킬 수 있다. FRET 및 nanopore 분석과 같은 다른 방법은 분자 내 거리 및 제외 된 볼륨의 검출에 따라 단일 분자 단백질 접기 및 전개 상태를 결정합니다. 그러나, 이들 방법은 아직 초기 단계에 있으며 단일 분자 적합성11,12,13,14의직접적인 관찰에 제한적이다.
한편, 형광 현미경 검사법에 의하여 높은 시간 및 공간 분해능을 가진 거대분자를 직접 관찰하는 것은 많은 생물학적 과정에서 단일 분자 역학에 대한 우리의 이해를 향상시켰습니다15,16. 예를 들어, Fu et al. 최근 처음으로 VWF 신장 및 혈소판 수용체 결합의 동시 시각화를 달성했다. 그들의 작업에서, VWF 분자는 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 미세유체 채널의 표면에 고정되었고, 다양한 전단 유동 환경에서 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 이미지화되었다17. Fu's와 유사한 방법을 적용하여, 우리는 여기에서 VWF와 람다 DNA의 적합성이 TIRF 및 공초점 형광 현미경 검사법 하에서 직접 관찰될 수 있음을 보여줍니다. 그림 1과같이 미세 유체 장치는 전단 흐름을 생성하고 제어하는 데 사용되며 생체 분자는 채널 표면에 고정됩니다. 다양한 전단 속도의 적용시, 동일한 분자의 적합성은 연장 길이를 측정하기 위해 기록되며, 또한 그림 1에도시된 바와 같습니다. 이 방법은 유변학 및 생물학적 연구를 위해 복잡한 흐름 환경에서 다른 폴리머 거동을 탐구하기 위해 널리 적용될 수 있습니다.
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Protocol
1. VWF 준비
- 인간 플라즈마 VWF를 재구성하여 라벨링 반응을 준비합니다. 1mg/mL VWF 스톡 솔루션을 만들기 위해 100 μL의 탈이온화(DI) 물을 100 μg의 동열VWF에 추가합니다.
- 초과 글리신을 제거하기 위해 VWF 스톡 솔루션을 투석하여 비오틴 및 플루오로포어 라벨링 효율을 높입니다.
- VWF 스톡 솔루션 50 μL을 0.1 mL 투석 장치로 10,000 분자량 컷오프 및 캡으로 밀봉합니다. 남은 재고 용액을 -20 °C에 보관하십시오. VWF 재고는 -20 °C에서 최대 1 년 동안 안정될 것입니다.
- 투석을 500 mL의 1x 멸균 인산완충식염수(PBS)(0.01 M 디소듐 인산염, 0.0018 모노포타슘 인산염, 0.0027 M 염화칼륨, 염화나트륨 염화나트륨, pH 7.4°C 에서 25°C)에서 25°C에서 25°C에서 투석을 실행합니다. 신선한 PBS 500 mL를 사용하여 추가 시간 동안 투석을 반복하십시오.
- 비오틴 라벨링 반응을 시작합니다. 반응 직전에 DI 물에서 고체를 용해시킴으로써 NHS-PEG 4-비오틴의 2 mM 용액을 준비한다. NHS-PEG4-비오틴이 장시간 물에 남아 있게 하면 NHS-에스테르 그룹이 가수분해되어 라벨링 효율이 감소합니다.
- VWF 스톡 솔루션을 포함하는 투석 장치에 2mM NHS-PEG4-biotin 의 2.5 μL을 추가하십시오. 이것은 VWF 단량체에 비해 비오틴의 20 배 어금니 초과 귀착될 것입니다. VWF의 1 차 아민은 NHS-에스테르 그룹과 반응하여 아미드 링키지를 통해 PEG4-비오틴그룹에 공유결합합니다.
- 투석 장치를 1.5 mL 미세 원심 분리튜브 내부에 놓습니다. 투석 유닛을 해당 캡으로 밀봉합니다. 파라필름으로 튜브 투석 어셈블리를 고정합니다. 똑바로 세워서 실온에서 40분 동안 그대로 둡니다.
- 형광피 표지 반응을 시작합니다. 2.8 mM용액을 DI 수역에서 용해시킴으로써 알렉사 488 테트라플루오로페닐(TFP-에스테르) 형광 염료(여기최대 = 498 nm, 방출최대 = 519 nm)를 준비한다. TFP-에스테르 그룹이 가수분해되는 것을 방지하기 위해 반응 직전에 이 작업을 수행합니다.
- 투석 부에 2.8 mM 488 불소의 2.9 μL을 추가합니다. 이것은 VWF 단량체에 비해 불소의 34 배 어금니 초과 귀착될 것입니다. VWF의 잔류 1 차 아민은 TFP-에스테르 그룹과 반응하여 아미드 링키지를 통해 형광단에 공유결합합니다.
- 투석 장치에 중탄산나트륨 1m(DI 물에 용해)의 2.0 μL을 추가합니다. 이는 반응의 pH를 8.0에 가깝게 조정하여 TFP-에스테르 및 1차 아민 반응의 효율을 증가시킨다.
- 1.3.2단계에서와 마찬가지로 투석 부를 마이크로원지 튜브에 고정합니다. 광표백을 방지하기 위해 어둠 속에서 보관하고 1 시간 30 분 동안 실온에서 둡니다.
- 투석 유닛을 1x 멸균 PBS의 900 mL에 놓고 4 °C에서 밤새 투석을 합니다. 이는 0.71 mg/mL 또는 2.84 μM(단량체 농도)의 농도로 표기된 VWF의 약 70 μL을 생성합니다.
- 라벨이 부착된 VWF를 마이크로원심지 튜브로 옮김. 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 빛으로부터 보호하십시오. 4 °C에서 보관하십시오. 장기 보관을 위해, 0.02%(w/v)의 최종 농도에 항균제 나트륨 아지드를 추가하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
2. 람다 DNA 준비
- 표준 프로토콜에 따라 비오틴-14-dCTP 뉴클레오티드로 응집성 끝 부위(cos sites)를 채우음으로써 선형 람다 DNA를 바이오티니레이트, 2.118단계에서반복한다. dATP, dTTP 및 dGTP 뉴클레오티드로 코스 사이트의 나머지 부분을 채웁니다.
- dATP, dTTP, dGTP 및 비오틴-14-dCTP의 1mMM 솔루션을 10배 반응 완충액(염화나트륨 500m, 100 mM 트리스 염화화물, 100 mM 염화마그네슘, 100 mM 디티오트레이톨, 25°C에서 pH 7.9)에 준비한다.
- PCR 튜브에 500 ng/μl 람다 DNA 48 μL을 넣고 65°C에서 5분 동안 가열합니다. 원형 람다 DNA의 코스 사이트는 열에서 분리되어 분자를 선형화하고 단일 가닥 돌출부를 생체 이식에 사용할 준비가 만듭니다. 그 직후, 코스 사이트가 다시 어닐링되지 않도록 얼음 위에 놓습니다.
- 람다 DNA에 1 mM dATP, dTTP 및 dGTP 및 1 mM의 4 μL의 1 μL을 첨가합니다. 또한 DNA 합성을 촉매하기 위해 5 U/μL Klenow 단편(3'à5' 엑소-)의 2.5 μL을 추가합니다.
- 37°C에서 1시간 동안 반응 혼합물을 배양한다.
- 0.5 M EDTA의 1.2 μL을 추가합니다. 그런 다음 반응 혼합물을 70°C에서 5분 동안 가열합니다. 이것은 Klenow 단편 및 생물 성 반응을 비활성화합니다.
- 10-70 μL을 보유할 수 있고 6,000 분자량 컷오프가 있는 스핀 컬럼을 사용하여 람다 DNA에서 과잉 뉴클레오티드를 제거합니다.
- 컬럼을 2mL 미세원원지 튜브 안에 놓습니다. 2 분 동안 1000 x g에서 컬럼과 튜브를 원심 분리. 튜브에 모이는 흐름을 처리합니다.
- 2.1.1단계에서 동일한 반응 버퍼의 1x 용액으로 컬럼 버퍼를 교체합니다. 열에 1x 버퍼의 500 μL을 추가하여 이 작업을 수행합니다. 1000 x g에서1 분 동안 원심 분리기 . 플로우스루를 폐기합니다. 총 1500 μL이 열에 추가되도록 이 2번 더 반복합니다.
- 컬럼을 1.5mL 미세원원지 튜브에 놓습니다. 2.1.5단계에서 부터 열을 맨 위 층으로 조심스럽게 추가합니다. 1000 x g에서4 분 동안 원심 분리기 .
- 미세원심지 튜브로부터 유동관통(40-70 μL)을 수집하고 PCR 튜브에 놓습니다. 이것은 정제된, 생체 활성 람다 DNA를 포함합니다.
- 표준 프로토콜에 따라 형광 YOYO-1 염료 (여기최대 = 490 nm, 방출최대 = 509 nm)를 가진 람다 DNA를 라벨, 단계 2.3.120에서여기에서 반복.
- YOYO-1 염료와 람다 DNA의 용액을 염료 대 염기 쌍 몰 비 1:10으로 준비합니다. 람다 DNA의 염기 쌍 농도를 계산하기 위해 정제 단계에서 DNA가 손실되지 않았다고 가정합니다. 전체 길이 람다 DNA에는 48,502 개의 염기 쌍이 있습니다.
참고: 예를 들어, 2.2.4단계에서 50 μL의 용액을 회수한 경우, 500 μM YOYO-1 염료의 7.4 μL을 첨가한다. - 용액을 50°C에서 2시간 동안 가열하여 반응을 완료합니다.
- 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 빛으로부터 보호하십시오. 4 °C에서 보관하십시오. 이제 이 솔루션은 미세 유체 장치에 주입할 준비가 되었습니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
- YOYO-1 염료와 람다 DNA의 용액을 염료 대 염기 쌍 몰 비 1:10으로 준비합니다. 람다 DNA의 염기 쌍 농도를 계산하기 위해 정제 단계에서 DNA가 손실되지 않았다고 가정합니다. 전체 길이 람다 DNA에는 48,502 개의 염기 쌍이 있습니다.
3. 실리콘 웨이퍼의 미세 유체 채널 금형 생성
- 표준 프로토콜19에따라 마스터 실리콘 웨이퍼상에 적절한 치수(그림2)를가진 미세 유체 채널을 만들기 위해 포토리소그래피를 사용한다.
4. 다각형 실록산 (PDMS) 미세 유체 장치의 제조
- 계량 보트에 1 부분 경화제 (질량별)에 5 부분 실리콘 엘라스토머 베이스를 추가합니다. 내용물1분 동안 철저히 저어서 미리 경화된 PDMS 용액을 만듭니다.
- 마스터 실리콘 웨이퍼를 플라스틱 페트리 접시에 놓습니다. PDMS 용액을 웨이퍼 위에 붓고 5mm 층을 만듭니다. 접시를 덮고 기포를 제거하기 위해 1 시간 동안 진공 상태의 건조기에서 둡니다.
- PDMS를 유연한 고체로 경화시키기 위해 하룻밤 동안 60°C에서 페트리 접시를 인큐베이팅하였다. 경화는 PDMS-웨이퍼 인터페이스에서 PDMS로 성형된 미세 유체 채널을 초래합니다.
- 면도기를 사용하여 각 미세 유체 채널 주위의 PDMS에 20 x 10mm 직사각형을 잘라냅니다. 핀셋이 있는 직사각형 PDMS 블록을 제거합니다.
- 날카로운 가장자리가 있는 25G 무딘 엔드 니들을 사용하여 채널의 한쪽 끝에 직경 0.5mm의 구멍을 뚫고 구멍이 PDMS 블록을 완전히 통과하도록합니다(그림 2). 구멍에서 PDMS를 펀치 얇은 바늘을 사용합니다. 채널의 다른 쪽 끝에서 이 작업을 반복합니다. 이렇게 하면 채널을 통과하는 흐름에 대한 입구와 출구가 생성됩니다.
- 비닐 클린룸 테이프로 PDMS 블록의 표면을 청소합니다. 압축 질소 가스를 No. 1 1/2, 22 x 50mm 커버슬립에 불어 이물질을 제거합니다.
- 채널 측면과 커버슬립을 플라즈마 본딩 기계의 챔버에 배치하여 PDMS 블록을 배치합니다. 치료를 시작합니다.
- 처리가 완료되면 채널이 슬립과 접촉할 수 있도록 PDMS 블록을 커버슬립에 빠르게 놓습니다. 블록 의 가장자리를 따라 압력을 가합니다. 커버슬립-PDMS 어셈블리를 115°C에서 15분 동안 핫 플레이트에 놓고 영구 결합을 강화합니다.
- PDMS 블록 상단의 출구 구멍에 길이 10cm, 내경 0.25mm 튜브를 삽입합니다. 이를 통해 유체가 채널 밖으로 쉽게 흘러나올 수 있습니다. 이제 장치가 완료되었습니다.
5. 미세 유체 장치의 표면 처리
- VWF 실험을 위해 멸균 1x PBS에 용해된 10 μg/mL 의 10 μL/mL 바이오티니 버알부민(BSA-biotin)을 주입합니다. 람다 DNA 실험을 위해 1 mg/mL BSA-비오틴을 10 μL 주입하십시오. 주입 후 파이펫 팁에 BSA-비오틴의 몇 마이크로 리터를 보류하고 팁이 입구에 내장 된 상태로 유지 될 수 있도록.
- 항상 팁 주위에 DI 물 방울을 유지합니다. 이렇게 하면 기포가 채널로 유입되는 것을 방지할 수 있습니다. 채널에 새 용액을 주입할 때마다 이 기술을 적용합니다.
- BSA-비오틴이 2시간 동안 장치에서 배양되도록 허용합니다. BSA는 커버슬립 표면에 구체적으로 결합하지않습니다(그림 3A).
- 파이펫 팁을 제거합니다. 채널에 카제인 차단 용액을 <10 μL을 주입하고 30 분 동안 배양 할 수 있습니다. 카제인은 임의의 자유 부위를 차단하여, 표면에 생체 분자의 비특이적 결합을 감소시킵니다(도3B).
- 팁을 제거하고 VWF 실험을 위해 멸균 1x PBS에 용해된 10 μg/mL 스트렙타비딘의 <10 μL을 주입합니다. 람다 DNA 실험에는 100 μg/mL 스트렙타비딘을 사용하십시오. 10 분 동안 배양하십시오. 스트렙타비딘은 BSA-비오틴의 비오틴 그룹에 결합한다(그림3C).
- 팁을 제거하고 1x 세제 용액 (PBS에서 0.05 % 트웬 20)의 <10 μL을 채널에 주입하여 과도한 스트렙타비딘을 씻어 냅니다.
- 팁을 제거하고 2.3.3 단계에서 카제인 용액 또는 람다 DNA에 희석 된 28.4 nM VWF 중 10 μL을 주입하십시오. VWF를 3분 동안 인큐베이트합니다. 45분 동안 람다 DNA를 인큐베이트(그림3D).
- 팁을 제거하고 카제인 용액에 희석된 5 mMM 무비자 비오틴의 <10 μL을 주입합니다. 자유 비오틴은 채널 표면상에서 과도한 스트렙타비딘 결합 부위를 차단한다(그림3E).
6. 형광 현미경 검사법에 의하여 VWF와 람다 DNA를 가시화
- 2.2 mM protocatechuic 산 및 37 nM protocatechuate-3,4-dioxygenase (광 표백을 최소화하기 위해)로 카제인 차단 용액 1 mL을 준비합니다. 주사기에 적재하고 주사기 펌프에 고정하십시오. 길이 30cm, 내경 0.25mm 튜브를 가지고 주사기 바늘에 한쪽 끝을 부착하십시오. 기포를 제거하기 위해 솔루션의 흐름. 튜브의 다른 쪽 끝을 미세 유체 장치의 입구에 부착합니다. 5.6단계 이후 3분 후에 이 작업을 수행하는 것이 좋습니다.
- 총 내부 반사(TIRF) 또는 공초점 형광 현미경의 가장 높은 배율 목표(즉, 60-100X)를 선택합니다. 필요한 경우 목표에 침지 오일 한 방울을 추가합니다. 미유체 장치를 현미경 단계에 놓아 커버슬립이 목표와 플러시되도록 합니다.
- 밝은 필드 현미경 검사를 시작합니다. 이물질 및 거품과 같은 모든 피쳐가 표시되도록 초점을 조정합니다. 그런 다음 미세 유체 채널의 가장자리가 보이고 프레임을 이등분할 때까지 X 및 Y 방향으로 스테이지를 조정합니다.
- 488 채널(FITC)으로 전환합니다. 개별 녹색, 구형 분자가 구별 될 수 있을 때까지 필요에 따라 Z 레벨 및 TIRF 각도를 조정합니다. 이들은 VWF 또는 람다 DNA 분자입니다.
- 노출 시간과 레이저 강도를 조정하여 너무 빨리 광표백하지 않고 형광분자를 시각화합니다. 대조를 조정하여 분자를 보다 명확하게 시각화합니다.
- 카제인 차단 용액이 채널로 유입되고 출구 밖으로 유입되도록 주사기 펌프에서 흐름을 시작합니다. 5.6단계 후 정확히 5분 후에 이 작업을 수행합니다. 멈추고 흐름을 시작하여 분자의 형태 변화를 관찰하십시오. 흐름을 적용할 때 5,000~30,000 μL/h 사이의 사용 속도는 미세 유체 장치의 다양한 영역에 걸쳐 이 것을 반복합니다. 이 프로세스를 계속하여 흐름을 멈추고 시작하는 여러 주기에 연장하고 이완할 수 있는 분자를 찾습니다.
- 분자가 최대 확장에 도달하고 소구로 완전히 이완하는 데 걸리는 시간을 기록하십시오. 전단 흐름 하에서 분자의 지속적인 거동에 대한 비디오를 녹화하여 최적의 노출 시간, 노출 빈도 및 비디오 지속 시간을 선택하여 확장 동작의 전체 범위를 캡처하고 광 표백을 최소화합니다.
- 비디오를 로 저장합니다. 축척 바가 있는 AVI 파일입니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
7. 형태 변화의 이미지 분석
- 직사각형 미세 유체
채널의 유량(Q)과높이(h)및폭(w)을이용하여 거대분자에 적용된 벽 전단률() 을 계산한다. 다음 방정식을 사용하여 다음 을 수행합니다.
- 사용자 지정된 MATLAB 코드를 사용하여 다양한 전단 속도 하에서 생체 분자의 길이를 결정합니다(추가 파일참조). [, save_each_frame, get_length, get_length. 비디오 분석 제목 비디오 내에서 하위 폴더를 만들고 추가합니다. AVI 파일을 분석할 수 있습니다.
- MATLAB 2019a를 사용하여 main.m을 열고 코드를 실행합니다. 분석할 데이터 파일을 입력하십시오 아래의 명령 창에서 분석할 비디오 파일의 이름을 입력합니다.
- 열린 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)에서 임계값(창 오른쪽 상단의 상자에 있는 텍스트)을 20으로 설정하고 임계값 설정 버튼을 클릭하여 확인합니다.
- 창의 상단 도구 모음에서 데이터 커서를 사용하여 배율 표시줄의 아무 곳이나 하나의 픽셀을 선택합니다. 창 오른쪽에 있는 배율 막대 섹션에서 시작 점을 클릭합니다. 선택한 픽셀의 (x,y) 위치가 버튼 오른쪽에 나타납니다. 픽셀 크기(μm) 버튼을 클릭합니다. 픽셀 크기는 각 비디오에서 한 번만 측정하면 됩니다.
- 관심 분자의 픽셀을 선택합니다. VWF 섹션에서 시작점을 클릭합니다. 선택한 픽셀의 위치가 오른쪽 텍스트 상자에 나타나면 왼쪽 끝, 오른쪽 끝 및 문자열 길이를 클릭하여 이미지의 분자 길이를 가져옵니다.
참고: 이 단계는 VWF라는특정 섹션을 갖는 코드에도 불구하고 모든 생체 분자의 형태 변화를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. - 분자의 왼쪽과 오른쪽 끝을 다시 확인합니다. 데이터 커서를 확대하여 사용하여 관심 있는 픽셀 위치를 확인합니다. 픽셀을 끝으로 수동으로 선택하고 필요한 경우 길이(픽셀)를 다시 계산합니다.
- 픽셀 크기를 μm으로 기록하고 문자열 길이를 픽셀 번호로 Excel 시트에 기록하고 문자열 길이를 μm으로 계산합니다.
- 모든 이미지에 대해 위의 단계를 반복합니다. GUI의오른쪽 하단에 있는 마지막 - 다음 단추를 사용하여 동일한 비디오 파일의 이미지 간에 전환할 수 있습니다. 닫기를 클릭하여 GUI 창을 닫습니다.
채널의 유량(Q)과높이(h)및폭(w)을이용하여 거대분자에 적용된 벽 전단률() 을 계산한다. 다음 방정식을 사용하여 다음 을 수행합니다.
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Representative Results
VWF 및 람다 DNA와 같은 생체 분자의 동적 거동을 관찰하는 것은 장치 표면에 대한 결합을 최적화하는 데 크게 의존합니다. 미세 유체 장치에서 권장 시간 동안 표면 처리를 배양하는 것은 분자가 변화하는 흐름에 따라 자유롭게 확장하고 릴렉스 할 수 있도록 몇 가지 앵커리지 포인트와 결합을 얻는 데 중요합니다. 단백질 또는 DNA가 다중 연결로 너무 강하게 결합되는 경우에, 그(것)들은 한정된 길이로 연장하거나 전혀 확장되지 않을 것입니다. 이는 특히 VWF가 자유 비오틴 차단 전에 3분 이상 장치 표면에 흐르지 않고 남아 있을 때 발생합니다. 폭스바겐F가 표면에 정체된 상태로 오래 지속될수록, 더 많은 VWF 비오틴 그룹이 표면 스트렙타비딘 그룹에 결합하고 분자가 해명할 수 있는 유연성이 줄어듭니다. 분자가 너무 약하게 결합되면, 다른 한편으로는, 그(것)들은 교류에 따라 분리하고 보기에서 사라집니다. 이것은 VWF 또는 람다 DNA가 너무 짧은 기간 동안 배양되는 경우에 생길 수 있습니다, 양식에 너무 적은 비오틴 연쇄상 구균 상호 작용을 일으키는 원인이 되는. 분자는 또한 매우 높은 전단 속도 (>200,000s-1)가적용될 때 자유로이 깨질 수 있으며, 비오틴-스트렙타비딘 상호 작용을 약화시입니다.
이상적인 분자는 흐름을 멈추고 시작하는 여러 주기에 따라 해명하고 휴식을 취할 수있는 정도로 결합합니다. 이와 같은 변형을 변경하는 분자의 유연성은 증가 하는 흐름의 범위 내에서 적용 되는 높은 전단 속도 증가 길이 확장 하는 능력에 의해 종종 입증 된다. TIRF 현미경으로 얻은 VWF의 이미지는 비디오 1에서이러한 관계를 보여줍니다. 도 4에서 동일한 VWF 분자의 전단 속도 곡선 대 확장은 VWF 분자의 전단 유도 거동을 정밀하게 포착하고 단백질의 생체역학적 특성을 특성화하는 데 유용하다. 공초점 형광 현미경으로 얻은 람다 DNA의 이미지는 비디오 2 및 비디오 3에서캡처된 바와 같이 2분 이상 높은 전단 속도 및 점진적이완이 가능한 연장을 유사하게 보여준다. 중지된 흐름 후 람다 DNA의 반동 특성도 그림 5에그래픽으로 표현됩니다.
그림 1: 형광 현미경 검사법의 밑에 미세 유체 채널에 있는 단 하나 분자 교류 실험의 회로도. 채널 표면은 BSA-비오틴으로 코팅되고 카제인으로 차단됩니다. 스트렙타비딘은 채널 표면에 비오틴과 결합되어 표면에 단일 분자를 고정시키기 위해 VWF/람다 DNA를 생체로 살균합니다. 전단 속도가 A에서 C로증가하면 분자는 접힌 상태에서 왼쪽에서 오른쪽으로 유동 방향을 따라 길쭉한 상태로 늘어납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 미세 유체 채널 치수입니다. PDMS 미세유체 장치의 형상 및 구조는 채널 치수와 함께 도시된다. 채널의 높이는 50 μm이며 폭은 0.1mm에서 1.0mm사이입니다. 채널 중앙의 좁혀지는 영역은 길이가 0.7mm입니다. 입구와 출구는 직경이 0.5144 mm (25G)입니다. 흐름 방향은 왼쪽에서 오른쪽으로 향합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 단일 분자 고정화를 위한 표면 처리 단계. 모든 단계는 실온에서 발생합니다. (A). BSA-비오틴은 2 시간동안표면에 코팅된다. 카제인은 표면을 차단하기 위해 30 분 동안 채널에 주입된다. (C).스트렙타비딘은 BSA-비오틴과 결합하기 위해 10분 동안 채널에서 배양된다. (D).이전 단계에서 과잉 분자를 씻어 낸 후, VWF/람다 DNA를 표지한 플루오로포어 및 비오틴 DNA를 채널내로 주입하고 스트렙타비딘과의 결합을 통해 고정시된다. (E).프리 비오틴이 유입되어 추가 스트렙타비딘 결합 부위를 차단하여 형태 변화 시 분자와의 간섭을 최소화합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 전단 흐름 하에서 VWF의 확장 거동. 분자는 7 개의 다른 전단 속도에서 가역적으로 해명합니다 : 0 s-1,33,333 s-1,66,667 s-1,100,000 s-1,133,333 s-1,166,667 s-1 및 200,000 s-1. 연신 분자의 길이는 0.52 μm에서 0.52 μm에서 200,000 s-1 전단 속도에서 3.44 μm로 증가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 전단 흐름이 멈춘 후 람다 DNA의 이완 동작. 33,000s-1 및 66,667 s-1 전단 속도를 가진 흐름은 동일한 분자에 0에서 30s까지 적용됩니다. 휴식은 30s에서 150 s까지 기록됩니다. 66,667s-1 전단 속도에서 DNA 분자는 15.00 μm로 구예하고 2 분 동안 흐름이 중단 된 후 5.83 μm로 다시 이완됩니다. 33,333s-1 전단 속도에서 분자는 8.75 μm까지만 확장되며 2 분 이완 후 길이가 3.33 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경을 사용하여 전단 속도를 증가시키는 VWF의 가역적 해명. 뷰의 중간에 있는 분자는 전단 속도 33,333 s-1,66,667 s-1,100,000s-1 및 133,333 s-1에서상이한 길이로 해명한다. 주사기 펌프는 전단 속도가 계산되는 유량을 제어하는 데 사용됩니다. 흐름 방향은 왼쪽에서 오른쪽으로 향합니다. 이미지는 완벽한 휴식 및 확장 프로세스를 허용하기 위해 15s 간격으로 촬영됩니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
비디오 2: 33,333 s-1 전단 속도 후 람다 DNA의 이완. 심상시 공초점 형광 현미경 검사법 하에 촬영됩니다. 람다 DNA는 33,333s-1 전단 흐름 이하로 뻗어 30초에서 흐름이 정지된 후 접힌 상태로 다시 이완된다. 이미지는 그 사이에 30s 간격으로 촬영됩니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
비디오 3: 66,667s-1 전단 속도 후 람다 DNA의 이완. 설정은 초기 전단 속도를 제외하고 비디오 2의 설정과 동일합니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
보조 파일: MATLAB 코드. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 방법에 설명된 바와 같이 형광 현미경을 사용하여 단일 분자 구성 변화의 고품질 데이터를 얻으려면 적절한 시간 동안 분자를 배양하고 표면과의 비특이적 상호 작용을 최소화하는 것이 중요합니다. 그리고 광 표백을 줄이는 현미경 설정을 설정합니다. 자유롭게 변형을 변경하는 분자의 능력은 분자와 표면 사이에 형성 된 비오틴 스트렙타비딘 상호 작용의 수와 관련이 있습니다. 앞서 언급했듯이, 이것은 적절한 시간 동안 유동없이 분자를 배양함으로써 조절되어야 한다. 추가적으로, 단백질 DNA는 커버슬립이 효과적으로 막이지 않는 경우에 커버슬립에 비특이적으로 결합할 수 있습니다. 권장 차단 솔루션이 없으면 분자가 유리에 비특이적으로 부착될 수 있으며 적용된 유량에 반응하지 않을 수 있습니다. 초기 표면 처리 중에 카제인 블록을 적용하고 유동 중에 그 존재를 유지하는 것은 이러한 비특이적 상호 작용을 감소시키는 데 필수적입니다. 마지막으로, 단일 분자의 연속적인 동적 동작을 캡처하려면 이미지 캡처 중에 형광포극이 자주 발생합니다. 레이저 강도, 노출 시간 및 노출 빈도가 너무 높으면 빠른 광표백을 일으킬 수 있습니다. 따라서 이러한 설정을 동시에 조정하고 데이터의 시간 이나 이미지 해상도를 손상시키지 않으면서 값을 줄이는 방법을 전략화해야 합니다.
분자의 확장 및 이완이 관찰되지 않으면 추가 단계를 따라야합니다. 프로토콜에서 권고되는 것보다 더 길고 짧은 시간 동안 장치에 분자를 배양합니다. 테스트 될 때마다, BSA-비오 틴과 스트렙 타 비딘 농도의 요인에 의해 다양 10. 이러한 시험은 분자와 표면 사이에 형성된 비오틴-스트렙타비딘 앵커리지 포인트의 수를 최적화하는 데 필요할 수 있다. 예를 들어, 비오틴 라벨링 밀도가 매우 높은 경우, 라벨링 프로토콜에서 권장 농도 또는 시약의 편차로 인해, 분자 배양 시간이 짧고 BSA-비오틴 및 스트렙타비딘 농도가 필요할 수 있다. 실험의 성공을 더욱 향상시키기 위해 전체 미세 유체 장치를 가역적으로 해명하는 분자를 스캔합니다. 표면은 스트렙타비딘 또는 카제인 블록으로 균일하게 처리되지 않을 수 있으며, 특정 지역의 분자가 다른 사람보다 더 큰 해명 반응을 일으킵니다.
이 방법은 분자의 크기 및 테더링 지점에 대한 정보의 부족, 0s-1 전단 속도 및 형광 현미경의 광학 분해능 을 생성하는 데 어려움에 의해 제한됩니다. 이전 연구는 VWF의 해명 거동에 큰 변화를 보였으며, 잠재적으로 각 VWF 분자18의비체-스트렙타비딘 테더 포인트 및 분자량의 수 및 위치의 광범위한 분포에 의해 설명되었다. 현재 우리가 제시하는 방법은 밧줄 점과 분자 크기를 정의 할 수 없습니다. 그러나, Wang et al.에 의해 간행된 거친 입자 VWF 모델의 브라운 역학 시뮬레이션은 이러한 변수를 통합하고 이러한 변형18을설명하기 위해 실험 결과와 함께 실행될 수 있다. 또한 주사기 펌프가 정지하면 흐름이 즉시 멈추지 않아 역역학의 관찰을 혼란스럽게 합니다. 이는 의도된 유동 기간 동안 PDMS 채널의 변형 및 약간의 팽창 때문입니다. 펌프가 정지되면 PDMS가 완전히 완화될 때까지 유체가 계속 흐르게 됩니다. 개선된 시스템은 단단한 플라스틱 재료로 제작된 보다 단단한 PDMS 또는 마이크로 채널을 사용해야 하므로 유체가0s-1 전단 속도에 더 빨리 도달할 수 있습니다. 마지막으로, 형광 현미경의 광학 해상도와 동일한 크기의 분자만 해결할 수 있으며, 이는 수백 나노미터보다 작지 않을 수 있습니다. 따라서, 이 방법으로 직접 관찰할 수 있는 분자에 대한 최소 크기 요구사항이 있다.
현재 프로토콜은 주로 생리적 흐름 하에서 단백질과 DNA 분자의 형태 변화의 정량화에 관한 것입니다. 그러나, 이 방법은 또한 생물학적 분자 간의 실시간 상호 작용을 시각화하고 단백질 및 DNA 기능을 더욱 특성화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, Fu et al.은 테더드 VWF가 높은 전단 흐름 하에서 활성화될 수 있고 다양한 유동 조건 하에서 혈소판 접착 분자 GPIbα를 추가로 포착할 수 있음을 보여주었다17. 이러한 결합 이벤트는 VWF가 비오틴-스트렙타비딘 링키지에 의해 표면에 결합되는 경우에도 보존되며, 생리학적으로 관련된 기능 및 역학을 연구하기 위한 이 프로토콜의 효과를 입증한다17. 유사한 기계론적 통찰력은 유동 환경에서 해명된 DNA와 조절 단백질 사이의 상호 작용을 연구하는 동안 얻을 수 있었다21,22. 추가적으로, 우리의 방법은 주로 거대분자에 있는 형태 변경을 관찰에 관한 것입니다. 그럼에도 불구하고, 형광 현미경 검사법하에서 해결될 수 있을 만큼 큰 더 작은 분자를 공부하기 위한 목적으로 그것을 적응시킬 수 있었습니다. 예를 들어, 작은 분자를 훨씬 더 크고 고정된 람다 DNA에 비공유적으로 또는 공유적으로 부착함으로써, 작은 분자의 전단 감도를 증가시키고 그 행동을 보다 쉽게 관찰할 수 있습니다. 결론적으로, AFM 또는 광학 핀셋과 같은 다른 단일 분자 특성 화 방법은 거대 분자의 구조적 및 기능적 특성에 대한 고해상도 데이터를 제공합니다. 그러나, 이 대체 방법은 이 프로토콜에 제시된 것과 같이 생리적인 교류 환경에서 일어나는 단백질 과 DNA의 동적, 형태 변경을 관찰할 수 없습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 보조금 DMS-1463234, 건강의 국립 연구소 보조금 HL082808 및 AI133634, 및 리하이 대학 내부 자금에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
| dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
| Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
| Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
| von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
| YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |
References
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