Summary

Floresan Mikroskopi ile Kesme Akışı Altında Tek Moleküllü Konformasyonel Değişikliklerin Karakterizasyonu

Published: January 25, 2020
doi:

Summary

Tek makromoleküllerin mikroakışkan cihazlarda immobilize edilebisi ve konformasyonlarındaki değişiklikleri kesme akışı altında ölçen bir protokol sayılmısAk. Bu protokol, bir akış ortamında proteinler ve DNA gibi biyomoleküllerin biyomekanik ve fonksiyonel özelliklerini karakterize etmek için yararlıdır.

Abstract

Mekanik tedirginlik altında tek moleküllü davranış birçok biyolojik süreçleri anlamak için yaygın olarak karakterize edilmiştir. Ancak, atomik kuvvet mikroskobu gibi yöntemler insidansı sınırlı zamansal çözünürlüğe sahipken, Förster rezonans enerji transferi (FRET) sadece konformasyonların çıkarılsın. Floresan mikroskopi, diğer taraftan, çeşitli akış koşullarında tek moleküllerin yerinde görselleştirme gerçek zamanlı sağlar. Protokolümüz, floresan mikroskobu kullanarak farklı kesme akış ortamları altında tek biyomoleküllerin konformasyonel değişikliklerini yakalama adımlarını açıklamaktadır. Kesme akışı mikroakışkan kanallar içinde oluşturulur ve bir şırınga pompası tarafından kontrol edilir. Yöntemin gösterimleri olarak von Willebrand faktörü (VWF) ve lambda DNA’sı biotin ve florofor ile etiketlenir ve kanal yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiştir. Konformasyonları toplam iç yansıma (TIRF) ve konfokal floresan mikroskopisi kullanılarak değişken kesme akışı altında sürekli olarak izlenir. VWF’nin geri dönüşümlü çözülme dinamikleri, işlevinin insan kanında nasıl düzenlendiğini anlamak için yararlıdır, lambda DNA’sının konformasyonu ise makromoleküllerin biyofiziği hakkında öngörüler sunar. Protokol aynı zamanda polimerlerin, özellikle de biyopolimerlerin, değişen akış koşullarındaki davranışlarını incelemek ve karmaşık sıvıların reolojisini araştırmak için de yaygın olarak uygulanabilir.

Introduction

Biyomoleküllerin çevresel uyaranlara nasıl tepki verecek mekanizmaları geniş ölçüde incelenmiştir. Özellikle bir akış ortamında, kesme ve uzama kuvvetleri konformasyonel değişiklikleri ve potansiyel olarak biyomoleküllerin işlevini düzenler. Tipik örnekler lambda DNA ve von Willebrand faktörü (VWF) kesme kaynaklı çözülme içerir. Lambda DNA bireysel, esnek polimer zincirleri ve polimer çözeltileri1,2,3,4reolojikonformasyon dinamikleri anlamak için bir araç olarak kullanılmıştır. VWF anormal kesme hızları ve akış desenleri ile kan damarlarının yara sitelerinde trombositler toplar doğal bir akış sensörüdür. VWF’nin çözülmesi, trombositlerin A1 etki alanına ve kollajenin A3 etki alanına bağlanmasını aktive etmek için gereklidir. Buna ek olarak, yüksek makas kaynaklı A2 etki alanı açılmak VWF dekolte sağlar, hangi dolaşımda moleküler ağırlık dağılımı nı düzenleyen5,6. Böylece, bu moleküllerin akış altında nasıl hareket ettiklerine doğrudan görselleştirme, biyomekanik ve işlevleri ne kadar temel anlayışlarımızı geliştirebilir, bu da yeni tanı ve tedavi uygulamaları sağlayabilir.

Tek moleküllü konformasyonları karakterize eden tipik metodolojiler arasında optik/manyetik cımbız, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (FRET)7sayılabilir. Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi biyomoleküllerin konformasyonel değişiklikleri ile ilişkili kuvvet ve hareketi araştırmak için güçlü bir araçtır. Ancak, genel moleküler konformasyonlar8harita yeteneği yoksun. AFM yüksek uzamsal çözünürlükile görüntüleme yeteneğine sahiptir ancak zamansal çözünürlük9sınırlıdır ,10. Buna ek olarak, uç ve örnek arasındaki temas akış tarafından indüklenen yanıt ı bozabilir. FRET ve nanopore analitiği gibi diğer yöntemler, moleküler mesafe ve dışlanmış hacimlerin tespitine dayalı olarak tek moleküllü protein katlama ve açılma durumlarını belirler. Ancak, bu yöntemler hala emekleme döneminde ve tek moleküllü konformasyonlar onların doğrudan gözlem sınırlıdır11,12,13,14.

Öte yandan, floresan mikroskopisi altında yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğe sahip makromoleküllerin doğrudan gözlemlenmesi, birçok biyolojik süreçte tek moleküllü dinamikleri anlamamızı geliştirmiştir15,16. Örneğin, Fu ve ark. son zamanlarda ilk kez VWF uzama ve trombosit reseptör bağlama eşzamanlı görselleştirme elde etti. Çalışmalarında, VWF molekülleri biotin-streptavidin etkileşimleri yoluyla bir mikroakışkan kanalın yüzeyinde immobilize edildi ve değişen kesme akış ortamlarında toplam iç yansıma floresansı (TIRF) mikroskopi altında görüntülendi17. Fu’s gibi benzer bir yöntem uygulayarak, burada VWF ve lambda DNA konformasyonları doğrudan TIRF ve konfokal floresan mikroskopi altında görülebilir göstermektedir. Şekil 1’degösterildiği gibi, mikroakışkan cihazlar kesme akışını oluşturmak ve kontrol etmek için kullanılır ve biyomoleküller kanal yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiştir. Değişen kesme hızlarının uygulanması üzerine, aynı molekülün konformasyonları, Şekil 1’dede gösterilen uzatma uzunluğunu ölçmek için kaydedilir. Yöntem, hem reolojik hem de biyolojik çalışmalar için karmaşık akış ortamları altında diğer polimer davranışlarını araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir.

Protocol

1. VWF Hazırlama Etiketleme reaksiyonları için hazırlamak için insan plazmavwf yeniden. 1 mg/mL VWF stok çözeltisi oluşturmak için 100 μL deiyonize (DI) suyu 100 μg lyophilized VWF ekleyin. Aşırı glisini gidermek için VWF stok çözeltisini diyalize çevirin, bu nedenle biyotin ve florofor etiketleme verimliliğini artırın. VWF stok çözeltisinin 50 μL’sini 10.000 moleküler ağırlık kesme ve kapaklı mühürleme ile 0,1 mL diyaliz ünitesine aktarın. Kalan stok çözelti…

Representative Results

VWF ve lambda DNA gibi biyomoleküllerin dinamik davranışlarını gözlemlemek cihaz yüzeyine bağlanmalarını optimize etmeye son derece bağlıdır. Mikroakışkan cihazda önerilen süreler için yüzey tedavileri inkübasyon birkaç ankraj noktaları ile bağlayıcı elde etmek için çok önemlidir, böylece moleküller serbestçe genişletmek ve akış değişen üzerine dinlenmek. Proteinler veya DNA birden fazla bağlantı ile çok güçlü bir şekilde bağlı ise, ya sınırlı uzunluklara kadar uzatır ya …

Discussion

Bu yöntemde açıklandığı gibi floresan mikroskobu kullanılarak tek moleküllü konformasyonel değişikliklerin yüksek kaliteli veri elde etmek için, molekülü uygun süre için kuluçkaya yatırmak, yüzeyle nonspesifik etkileşimlerini en aza indirmek çok önemlidir. ve fotobeyaztlamayı azaltan mikroskop ayarlarını kurun. Molekülün konformasyonu serbestçe değiştirebilme yeteneği, molekül ile yüzey arasında oluşan biyotin-streptavidin etkileşimlerinin sayısı ile ilgilidir. Daha önce de belirti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma kısmen Ulusal Bilim Vakfı hibe DMS-1463234, Ulusal Sağlık Enstitüleri HL082808 ve AI133634 hibe ve Lehigh Üniversitesi iç finansman tarafından desteklenmiştir.

Materials

Alexa Fluor 488 Labeling Kit Invitrogen A30006
Bio-Spin P-6 Gel Columns Bio-Rad 7326221
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Use as free biotin in Step 5.6
Biotin-14-dCTP AAT Bioquest 17019
BSA-Biotin Sigma-Aldrich A8549
Coverslips VWR 48393-195 No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP Set Invitrogen 10297018
Float Buoys for Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69588
Klenow Fragment (3'→5' exo-) New England BioLabs M0212S Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2
Lambda DNA New England BioLabs N3011S
Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69570 10K MWCO, 0.1 mL volume
NEBuffer 4 New England BioLabs B7004S
NHS-PEG4-Biotin Thermo Scientific 21330
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase Sigma-Aldrich P8279
Protocatechuic acid Santa Cruz Biotechnology sc-205818
Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication The Dow Chemical Company 4019862
Streptavidin Sigma-Aldrich 85878
The Blocking Solution CANDOR Bioscience 110 050 Use as casein blocking solution throughout protocol
Vinyl Cleanroom Tape Fisher Scientific 19-120-3217
von Willebrand Factor, Human Plasma Millipore Sigma 681300
YOYO-1 Dye AAT Bioquest 17580
0.25 mm Inner Diameter Tubing Cole-Parmer EW-06419-00
25 Gauge Needle Thomas Scientific JG2505X

References

  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
  4. Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
  5. Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
  6. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
  7. Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
  8. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  9. Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
  10. Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
  11. Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
  12. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  13. Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
  14. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
  15. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  16. Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
  17. Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
  18. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
  19. Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).
  20. Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
  21. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  22. Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).

Play Video

Cite This Article
Pisapati, A. V., Wang, Y., Blauch, M. E., Wittenberg, N. J., Cheng, X., Zhang, X. F. Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60784, doi:10.3791/60784 (2020).

View Video