Tek makromoleküllerin mikroakışkan cihazlarda immobilize edilebisi ve konformasyonlarındaki değişiklikleri kesme akışı altında ölçen bir protokol sayılmısAk. Bu protokol, bir akış ortamında proteinler ve DNA gibi biyomoleküllerin biyomekanik ve fonksiyonel özelliklerini karakterize etmek için yararlıdır.
Mekanik tedirginlik altında tek moleküllü davranış birçok biyolojik süreçleri anlamak için yaygın olarak karakterize edilmiştir. Ancak, atomik kuvvet mikroskobu gibi yöntemler insidansı sınırlı zamansal çözünürlüğe sahipken, Förster rezonans enerji transferi (FRET) sadece konformasyonların çıkarılsın. Floresan mikroskopi, diğer taraftan, çeşitli akış koşullarında tek moleküllerin yerinde görselleştirme gerçek zamanlı sağlar. Protokolümüz, floresan mikroskobu kullanarak farklı kesme akış ortamları altında tek biyomoleküllerin konformasyonel değişikliklerini yakalama adımlarını açıklamaktadır. Kesme akışı mikroakışkan kanallar içinde oluşturulur ve bir şırınga pompası tarafından kontrol edilir. Yöntemin gösterimleri olarak von Willebrand faktörü (VWF) ve lambda DNA’sı biotin ve florofor ile etiketlenir ve kanal yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiştir. Konformasyonları toplam iç yansıma (TIRF) ve konfokal floresan mikroskopisi kullanılarak değişken kesme akışı altında sürekli olarak izlenir. VWF’nin geri dönüşümlü çözülme dinamikleri, işlevinin insan kanında nasıl düzenlendiğini anlamak için yararlıdır, lambda DNA’sının konformasyonu ise makromoleküllerin biyofiziği hakkında öngörüler sunar. Protokol aynı zamanda polimerlerin, özellikle de biyopolimerlerin, değişen akış koşullarındaki davranışlarını incelemek ve karmaşık sıvıların reolojisini araştırmak için de yaygın olarak uygulanabilir.
Biyomoleküllerin çevresel uyaranlara nasıl tepki verecek mekanizmaları geniş ölçüde incelenmiştir. Özellikle bir akış ortamında, kesme ve uzama kuvvetleri konformasyonel değişiklikleri ve potansiyel olarak biyomoleküllerin işlevini düzenler. Tipik örnekler lambda DNA ve von Willebrand faktörü (VWF) kesme kaynaklı çözülme içerir. Lambda DNA bireysel, esnek polimer zincirleri ve polimer çözeltileri1,2,3,4reolojikonformasyon dinamikleri anlamak için bir araç olarak kullanılmıştır. VWF anormal kesme hızları ve akış desenleri ile kan damarlarının yara sitelerinde trombositler toplar doğal bir akış sensörüdür. VWF’nin çözülmesi, trombositlerin A1 etki alanına ve kollajenin A3 etki alanına bağlanmasını aktive etmek için gereklidir. Buna ek olarak, yüksek makas kaynaklı A2 etki alanı açılmak VWF dekolte sağlar, hangi dolaşımda moleküler ağırlık dağılımı nı düzenleyen5,6. Böylece, bu moleküllerin akış altında nasıl hareket ettiklerine doğrudan görselleştirme, biyomekanik ve işlevleri ne kadar temel anlayışlarımızı geliştirebilir, bu da yeni tanı ve tedavi uygulamaları sağlayabilir.
Tek moleküllü konformasyonları karakterize eden tipik metodolojiler arasında optik/manyetik cımbız, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (FRET)7sayılabilir. Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi biyomoleküllerin konformasyonel değişiklikleri ile ilişkili kuvvet ve hareketi araştırmak için güçlü bir araçtır. Ancak, genel moleküler konformasyonlar8harita yeteneği yoksun. AFM yüksek uzamsal çözünürlükile görüntüleme yeteneğine sahiptir ancak zamansal çözünürlük9sınırlıdır ,10. Buna ek olarak, uç ve örnek arasındaki temas akış tarafından indüklenen yanıt ı bozabilir. FRET ve nanopore analitiği gibi diğer yöntemler, moleküler mesafe ve dışlanmış hacimlerin tespitine dayalı olarak tek moleküllü protein katlama ve açılma durumlarını belirler. Ancak, bu yöntemler hala emekleme döneminde ve tek moleküllü konformasyonlar onların doğrudan gözlem sınırlıdır11,12,13,14.
Öte yandan, floresan mikroskopisi altında yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğe sahip makromoleküllerin doğrudan gözlemlenmesi, birçok biyolojik süreçte tek moleküllü dinamikleri anlamamızı geliştirmiştir15,16. Örneğin, Fu ve ark. son zamanlarda ilk kez VWF uzama ve trombosit reseptör bağlama eşzamanlı görselleştirme elde etti. Çalışmalarında, VWF molekülleri biotin-streptavidin etkileşimleri yoluyla bir mikroakışkan kanalın yüzeyinde immobilize edildi ve değişen kesme akış ortamlarında toplam iç yansıma floresansı (TIRF) mikroskopi altında görüntülendi17. Fu’s gibi benzer bir yöntem uygulayarak, burada VWF ve lambda DNA konformasyonları doğrudan TIRF ve konfokal floresan mikroskopi altında görülebilir göstermektedir. Şekil 1’degösterildiği gibi, mikroakışkan cihazlar kesme akışını oluşturmak ve kontrol etmek için kullanılır ve biyomoleküller kanal yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiştir. Değişen kesme hızlarının uygulanması üzerine, aynı molekülün konformasyonları, Şekil 1’dede gösterilen uzatma uzunluğunu ölçmek için kaydedilir. Yöntem, hem reolojik hem de biyolojik çalışmalar için karmaşık akış ortamları altında diğer polimer davranışlarını araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir.
Bu yöntemde açıklandığı gibi floresan mikroskobu kullanılarak tek moleküllü konformasyonel değişikliklerin yüksek kaliteli veri elde etmek için, molekülü uygun süre için kuluçkaya yatırmak, yüzeyle nonspesifik etkileşimlerini en aza indirmek çok önemlidir. ve fotobeyaztlamayı azaltan mikroskop ayarlarını kurun. Molekülün konformasyonu serbestçe değiştirebilme yeteneği, molekül ile yüzey arasında oluşan biyotin-streptavidin etkileşimlerinin sayısı ile ilgilidir. Daha önce de belirti…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma kısmen Ulusal Bilim Vakfı hibe DMS-1463234, Ulusal Sağlık Enstitüleri HL082808 ve AI133634 hibe ve Lehigh Üniversitesi iç finansman tarafından desteklenmiştir.
Alexa Fluor 488 Labeling Kit | Invitrogen | A30006 | |
Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Use as free biotin in Step 5.6 |
Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
Coverslips | VWR | 48393-195 | No. 1 ½, 22 x 50 mm |
dNTP Set | Invitrogen | 10297018 | |
Float Buoys for Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69588 | |
Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England BioLabs | M0212S | Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2 |
Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
Mini Dialysis Device | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO, 0.1 mL volume |
NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication | The Dow Chemical Company | 4019862 | |
Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
The Blocking Solution | CANDOR Bioscience | 110 050 | Use as casein blocking solution throughout protocol |
Vinyl Cleanroom Tape | Fisher Scientific | 19-120-3217 | |
von Willebrand Factor, Human Plasma | Millipore Sigma | 681300 | |
YOYO-1 Dye | AAT Bioquest | 17580 | |
0.25 mm Inner Diameter Tubing | Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
25 Gauge Needle | Thomas Scientific | JG2505X |