Summary
这里介绍的是一个记录肌肉速度恢复周期（MVRCs）的协议，这是一种检查肌肉膜特性的新方法。MVRCs支持在体内评估肌肉膜电位和肌肉电导道功能与病理学相关的改变，并且它能够显示神经源性肌肉的肌肉去极化。
Abstract
虽然传统的神经传导研究 （NCS） 和肌电图 （EMG） 适合神经肌肉疾病的诊断，但它们提供有关肌肉纤维膜特性和基础疾病机制的信息有限。肌肉速度恢复周期 （MVRC） 说明了肌肉作用电位的速度如何取决于先前动作电位之后的时间。MVRC 与跟随作用电位的膜电位变化密切相关，从而提供有关肌肉纤维膜特性的信息。MVRC 可通过体内多纤维束的直接刺激和记录快速、轻松地进行记录。MVRCs有助于了解几种神经肌肉疾病的疾病机制。对通道病变患者的研究已经证明了特定性辐射通道突变对肌肉兴奋性的不同影响。MVRC 以前已在神经原性肌肉患者中测试过。在先前的研究中，肌肉相对折射期（MRRP）被延长，与健康对照组相比，患者早期超常性（ESN）和晚期超常性（LSN）减少。因此，MVRCs可以提供体内膜去极化的证据，在完整的人体肌肉纤维，其降低兴奋性的基础。此处介绍的协议描述了如何记录 MVRC 并分析录制。MVRC 可以作为一种快速、简单和有用的方法，用于揭示各种神经肌肉疾病的疾病机制。
Introduction
神经传导研究 （NCS） 和肌电图 （EMG） 是用于诊断神经肌肉疾病的传统电生理学方法。NCS能够检测神经中的斧状损失和脱骨髓，而EMG可以区分肌肉中是否因神经损伤而出现肌病或神经原性变化。然而，NCS或EMG提供有关肌肉纤维膜特性和基础疾病机制的有限信息。这些信息可以通过细胞内电极在肌肉活检2，3，4的分离肌肉中实现。然而，使用患者完整肌肉的录音的方法具有临床意义。
第二肌肉纤维作用的速度可能变化作为前5个后延迟的函数，并且这个速度恢复功能（或恢复周期）已被证明在营养不良或萎缩的肌肉中发生变化。然而，单肌肉纤维的这种记录的产量太低，不能用作临床工具6。然而，Z'Graggen和Bostock后来发现，通过直接刺激和从同一束肌肉纤维中记录获得的多纤维记录，提供了一种在体内获得这种记录的快速而简单的方法。该方法7、8、9、10、11采用一系列具有不同相互刺激间隔（ISI）的成对脉冲电刺激。
评估的 MVRC 参数包括：1） 肌肉相对耐火期 （MRRP），这是肌肉作用电位之后的持续时间，直到下一个动作潜力可以引起;2） 早期超常性（ESN）;和 3） 晚期超常法 （LSN）。ESN 和 LSN 是耐火期之后的周期，其中作用电位在肌肉膜上进行速度比正常快。肌肉t-小管中的去极化后电位和钾积累分别被假设为两个超常期的主要原因。
MVRCs对肌肉疾病的广泛适用，已表明在检测缺血7、10、12和肾衰竭13的膜去极化，以及提供有关严重疾病肌病14和包括体肌炎15的肌肉膜异常的信息。此后，引入了频率斜带和间歇性 15 Hz 和 20 Hz 仿真协议。MVRC， 与这些附加协议一起，已经证明了在遗传性肌肉离子通道（即钠通道肌张力，对肌肌体肌张力16，肌营养不良症17，安徒生-Tawil综合征18和肌张力热质19）中各种肌肉离子通道中功能丧失或机能增益突变的不同影响。
在最近的一项研究中，首次显示了MVRC对神经生成肌肉的适用性。术语"神经性肌肉"是指骨骼肌的继发性变化，在前角细胞或运动斧子受伤后，这些骨骼肌肉会发展成变性和再生。在EMG中，电检的特点是自发活动（即颤动[fibs]和正锐波[psws]），而具有较长持续时间和增加振幅的大型电机单元电位存在内刺21。EMG的变化在肌肉中是明显的，但肌肉纤维膜电位的潜在细胞变化仅在对分离的肌肉组织2、3、4的实验研究中得到证明。MVRC 提供对体内人体肌肉膜特性的进一步洞察，有关变性过程。
本文详细介绍了MVRC的方法。它还从先前报道的研究22和健康对照对象中总结了一组患者的神经原性肌肉的变化，从而能够确定该方法是否适合计划内的研究。
录制使用作为软件程序一部分的录制协议执行。其他使用的设备是隔离的线性双极恒恒电流刺激器、50 Hz 噪声消除器、隔离的肌电图放大器和模拟数字转换器。
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Protocol
所有受试者必须在考试前提供书面同意，并且协议必须得到相应的当地道德审查委员会的批准。此处描述的所有方法均获得区域科学道德委员会和丹麦数据保护局的批准。
1. 编写主题
- 评估受试者的病史，以确保他们除了将被调查的疾病组之外，没有任何以前的神经系统疾病。
- 详细告知受试者有关考试情况，并请求获得书面同意。
- 告知受试者在腿部肌肉中插入两根针头，肌肉纤维会受到弱电流刺激。
- 说明这种感觉可能会感到有点不舒服。
- 告知受试者，在录制过程中，如果有任何不适，可以随时关闭刺激。
- 用酒精清洁受试者的小腿。
- 将刺激的单极针电极（25 mm x 26 G）插入前骨肌肉和粘合表面电极上，作为阳极 1 厘米远端至单极针（图 1）。
- 将接地电极远端置于阳极。
- 沿肌肉纤维插入记录的同心针电极（25 毫米 x 30 G）约 2 厘米接近刺激的单极针电极（图 1）。
- 将记录同心针和接地电极连接到前置放大器。
- 要求受试者在考试期间保持安静，避免移动。
- 将刺激器的输出归零，并将刺激电极连接到刺激器（图1）。
- 使用加热灯将皮肤温度保持在 32~36 °C 之间。
2. MVRC的录制
- 使用肌肉兴奋性记录协议启动半自动记录软件并打开刺激器。刺激将从 2.5 mA 开始，1 Hz。
- 通过点击插入键手动增加刺激强度，直到记录响应（最大 = 10 mA）。
- 如有必要，调整刺激和记录针头，直到记录刺激强度小于 10 mA 的可接受响应。肌肉动作潜力的形状应该是三脚的，如果可能的话，并且稳定。避免整个肌肉的大抽搐。
- 如果电位出现倒挂，则通过点击减键 （-） 反转肌肉动作潜力。
注： 屏幕上会出现一条洋红色水平线，指示动作电位宽度。
- 使用鼠标拖动线条，调整洋红色线的位置和长度。绿色水平线表示基线。
- 单击"确定"开始录制 MVRC。
- 从主选项中选择刺激响应关系。
- 通过点击插入键达到最大 10 mA 或可容忍，增加刺激强度。
- 单击"确定"开始降序刺激响应曲线。
- 当测试刺激达到零时，单击"确定"。
- 将刺激强度设置为稳定延迟的水平。
- 单击"确定"返回到主菜单。
- 选择 RC 选项1/2/5 调理刺激。
- 从恢复周期选项中选择协议（例如，启动快速恢复周期 [跳过备用延迟]），这是默认值。
注： 记录自动持续 34 个步骤，减少刺激间隔 （ISIs）。 - 确保在记录期间肌肉活动电位稳定且针头未移动。完成 34 个步骤后，屏幕将自动更改为主选项。
- 单击"完成录制"关闭文件|好的，除非正在执行加速频率或 20 Hz s 的录制。
- 单击"关闭文件并保存数据"按钮完成录制并保存数据。
3. MVRC分析
- 启动分析软件程序以脱机执行分析。
- 选择将分析的录制，然后单击"确定"按钮。
- 单击"文件"菜单中的"加载参数"。
- 为分析选择 MANAL9 选项。如果列表中不存在此内容，请单击"浏览"以查找此文件。单击"确定"继续。
- 当出现 MAnal9 肌肉兴奋性分析的描述时，单击"确定"继续。
- 如果电势倒置，则通过键入 MM-1 反转肌肉活动潜力。
- 右键单击鼠标可使洋红色线条可见。将窗口设置为峰值响应的基部，宽度与该高度的动作势的宽度大致对应。用鼠标拖动以调整窗口。窗口确定测量高度和延迟的延迟，如淡蓝色线所示，绿线表示基线。单击"确定"继续。
- 单击"确定"以重新测量延迟和峰值。此操作将自动完成。
注： 在显示重新测量的延迟时，延迟的测量时间比原始延迟短。这是因为仅对调节刺激的反应就从对调节反应加上测试中减去。这可确保调理刺激不会干扰延迟测量。如提示框所示，通过将光标（垂直红线）定位在点上并点击+键，可以消除单个坏点。坏点将替换为同一通道中任意一侧的值平均值。如果没有坏点，则将 DE（显示端）设置为刚到所需的最后一个延迟之后。 - 单击"确定"以创建 RMC 文件。
- 忽略"创建 RCC 或 RMC"窗体中显示的大多数选项，因为这些选项与 C 光纤的测量有关，而不是 MVRC。 保存 RMC 文件后，提示框提供不同的选项
- 如果记录频率斜坡和/或重复刺激数据，请按照说明进行分析。否则，选择"直接转到"以创建 MEM 文件选项以创建 MEM 文件。单击"确定"继续。
- 单击"保存并退出"以继续。
- 单击"确定"将 RMC 数据添加到 MEM 文件。
- 单击"从输入 RMC 文件添加"以将其数据添加到 MEM 文件，然后更改目录以保存复合 MEM 文件。然后，单击"保存并退出"以保存它。
- 单击"确定"以保存重新测量的 QZD 文件，以便使用+符号与原始 QZD 文件进行区分。
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Representative Results
以下结果从最近的一项研究22中得到一组患者，其中所有部位都出现纤维/pws，显示大量变性活动。结果表明，使用本协议中描述的MVRC技术，对脱密度后肌肉纤维的变化进行了评估。MVRCs 显示与神经源性肌肉纤维中静膜电位去极化一致的变化。
14名患者与29名健康受试者进行了比较。主题人口统计表1所示。图 2显示了来自健康受试者和患者的记录。图3和表2说明了患者MVRC与健康受试者的比较。MRRP被延长，与健康对照相比，患者的ESN和LSN减少（表2，图3）。
图 1：MVRC 设置的图片。（A） 隔离线性双极常流刺激器、（B） 50 Hz 噪声消除器、（C） 隔离 EMG 放大器和 （D） 模拟到数字转换器。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：MVRC 录制示例。记录后一个条件刺激（红色），两个调理刺激（绿色），和五个条件刺激（蓝色）从一个 （A） 健康的主题和 （B） 患者与L5放射病。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：具有1、2和5个调节刺激的MVRC。（A） MVRC 在 14 名患者 （灰色线） 相比平均值 29 健康对照 （填充黑色方块）.根据 2-1，000 ms（对数刻度）的 ISI 绘制延迟百分比变化的图形表示。（B，C）： 与 （A） 相同，但有 2 和 5 个调节刺激。请点击此处查看此图的较大版本。
| 健康控制 （n=29） |
患者 （n=14） |
|
| 年龄（年） | 55.7 × 14.9 | 58.9 × 16.3 |
| 性别（M/F） | 14/15 | 9/5 |
| 疾病持续时间（月） | - | 3.4 × 2.7 |
| MRC 分数 | - | 3.0 × 1.1 |
| 病因 | - | 穿孔神经病变 （9） L5 根关联 |
表1：人口统计和临床特征。值列为均值 = 标准差。此表已由 Witt 等人22修改。
| 健康控制 （n=29） |
患者 （n=14） |
t 检验的 p 值 | |
| MRRP （毫秒） | 3.5 × 0.4 | 7.6 × 3.1 | p = 6.8-8 |
| ESN （%） | 11.3 × 2.1 | 7.6 × 2.3 | p = 5.5-5 |
| ESN （毫秒） | 7.8 × 1.3 | 12.7 × 2.5 | p = 1.6-8 |
| 5ESN （%） | 13.7 × 2.5 | 1.0 × 0.6 | p = 9.3-10 |
| LSN （%） | 4.1 × 1.4 | 2.8 × 1.7 | p = 0.017 |
| XLSN （%） | 2.9 × 0.7 | 1.0 × 1.6 | p = 1.8-10 |
| 5XLSN （%） | 8.0 × 1.4 | 2.8 × 1.6 | p = 2.2-11 |
表2：健康对照组与患者之间的MVRC参数比较。MRRP = 肌肉相对折射期;ESN （%） – 在 ISI 的 <15 ms. ESN （ms）中，肌肉作用潜力的延迟降低，以非空调刺激的百分比表示，ISI 对应于 ESN （%）. 5ESN = 五个调节刺激后的早期超常值峰值。LSN （%） = 在 ISI 100~150 ms 之间，一次调节刺激后肌肉活动潜力的延迟降低，以非空调刺激的百分比表示。 XLSN （%） = 两次调理刺激后肌肉作用潜能的延迟降低，在 ISI 的 100-150 ms 5XLSN （%） 之间占一个条件刺激的百分比 = 五个调节刺激后肌肉作用潜能的延迟降低，作为 ISI 100-150 ms 之间的一个调节刺激的百分比。
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Discussion
MVRC，如记录软件中编程，是一个高度自动化的过程，但需要小心才能获得可靠的结果。在记录阶段，在调整针头时，避免刺激端板区域或神经非常重要。这通常会导致整个肌肉的大抽搐，这增加了在记录 MVRC 期间刺激和/或记录针头的位移风险。迄今为止，该方法已应用于几个肌肉，有更好的描述端板区;然而，端板可能分散（即，在前叶肌肉）。因此，需要特别注意。
为了避免刺激端板或神经而不是肌肉纤维，在观察肌肉抽搐时应小心谨慎。刺激的单极针，以及记录同心针，以定位不导致抽搐的部位。此外，应该询问受试者是否感到疼痛。MVRC 记录不会引起任何不愉快，除非端板区域或神经受到刺激，而不是肌肉纤维。
MVRCs 方法的局限性是在一个站点中执行记录，并且只检查少数肌肉纤维，这不一定代表整个肌肉。这种限制在病理学不扩散的紊乱中尤其重要。先前的研究发现，肌萎缩性侧索硬化症患者与健康控制患者之间，尽管肌肉萎缩，但出乎意料地没有区别。这可能是因为在MVRCs记录23的站点没有记录去性活动。也不能排除，针头可以调整到更健康的地方，有更优的反应。
MVRC 的另一个限制是，在调整记录针以获得测量的稳定响应时，可能会发现健康的肌肉纤维。克服这种限制的一个方法可能是从多相电位进行记录。但是，如果存在未区分的峰值，则这可能会在确定准确延迟方面出现问题。此外，虽然我们打算刺激和记录从同一束肌肉纤维，这些可能不是完全相同的。在正在进行的实验24期间，刺激的捆绑可能含有不同的纤维。
MVRC 提供的信息是传统的电生理方法无法获取的。因此，当前使用中没有其他方法可以与 MVRC 进行比较。早先的报告6，使用单纤维针电极记录从同一肌肉纤维的两个站点，是困难得多。在118项肌肉纤维研究中，只有43项得到良好的记录，而且这种方法尚未在研究实验室或诊所中采用。另一种类似但非自动化的方法使用了8个不同的IS，从20毫秒到2毫秒25。作者报告说，录音需要20-60分钟，而这种方法记录MVRC与34个ISIs在大约10分钟。分析也快速且高度自动化。
总之，MVRC是一种可能提供宝贵信息来理解神经肌肉疾病的基本机制的方法。对于已识别了一个子通道基因突变的患者，该方法还提供了关于这些特定突变对体内肌肉膜兴奋性的影响的数据。这与体外表达研究一起，能够更准确地了解这些患者的肌肉病理生理学。这种方法有可能提供这些通道在正常肌肉生理学中的作用，从而改善对一般肌肉疾病的理解。有必要与其他患者群体和较大的群体进行进一步研究。记录不同肌肉的MVRC的研究也是有道理的。
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Disclosures
H.B. 因销售本研究中使用的 Qtrac 软件而从 UCL 获得版税。其他作者没有潜在的利益冲突。所有作者都批准了最后一篇文章。
Acknowledgments
这项研究的财政支持主要来自伦德贝克基金会的两项赠款（助学金号R191-2015-931和助学金号R290-2018-751）。此外，该研究还得到了诺和诺德基金会挑战计划（赠款号NNF14OC0011633）的财政支持，作为国际糖尿病神经病变联合会的一部分。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 Hz Noise Eliminator | Digitimer Ltd | Humbug | |
| Analogue-to-Digital Converter | National Instruments | NI-6221 | |
| Analysing software program | Digitimer Ltd (copyright Institute of Neurology, University College, London) | QtracP, MANAL9 | |
| Disposable concentric needle electrode, 25 mm x 30G | Natus | Dantec DCN | |
| Disposable monopolar needle electrode, 25 mm x 26G | Natus | TECA elite | |
| Isolated EMG amplifier | Digitimer Ltd | D440 | |
| Isolated linear bipolar constant-current stimulator | Digitimer Ltd | DS5 | |
| Software and recording protocol | Digitimer Ltd (copyright Institute of Neurology, University College, London) | QtracW software, M3REC3 recording protocol written by Hugh Bostock, Istitute of Neurology, London, UK) |
References
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