Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera och analysera faryngala arch artärer 3, 4 och 6 av mus embryon med hela montera immunofluorescens, vävnad clearing, confocal mikroskopi och 3D återuppbyggnad.
Abstract
Felaktig bildning eller ombyggnad av faryngala ärrarterna (PAA) 3, 4 och 6 bidrar till några av de allvarligaste formerna av medfödd hjärtsjukdom. För att studera bildandet av PAA, utvecklade vi ett protokoll med hela montera immunofluorescens tillsammans med bensylalkohol/bensylbensoat (BABB) vävnad clearing och confocal mikroskopi. Detta möjliggör visualisering av faryngala arch enottel vid en fin cellulär upplösning samt 3D-anslutning av vaskulaturen. Med hjälp av programvara har vi upprättat ett protokoll för att kvantifiera antalet endotelceller (ECs) i PAA, samt antalet ECs inom vaskulärplexus som omger PAAs inom faryngala bågar 3, 4 och 6. När den tillämpas på hela embryot ger denna metod en omfattande visualisering och kvantitativ analys av embryonal vaskulatur.
Introduction
Under mus embryogenesis, svalgbåge artärer (PAA) uppstår som symmetriska, bi-laterala par av artärer som förbinder hjärtat med dorsala aortae1. Som embryot utvecklas, den första och andra par paas regress, medan3: e,4:eoch 6:e PAA genomgår en rad asymmetriska ombyggnad händelser för att bilda aorta arch artärer2.
PAAs 3, 4 och 6 utvecklas via vaskulogenes, vilket är de novo bildandet av blodkärl3. Defekter i bildandet eller ombyggnad av dessa ärkeartärer ger upphov till olika medfödda hjärtfel, såsom de som ses hos patienter med DiGeorge syndrom4,5. Därför kan förståelse mekanismer som reglerar utvecklingen av PAAs leda till en bättre förståelse av medfödd hjärtsjukdom (CHD) etiologi.
Aktuella metoder för att visualisera och analysera PAA utveckling inkluderar immunofluorescens av vävnadssektioner, vaskulära avgjutningar, Indien bläck injektion, högupplöst episkopisk mikroskopi, och / eller helmonterad immunhistochemistry1,4,5,6,7. Häri beskriver vi ett protokoll som kombinerar helmonterad immunofluorescens, konfokalmikroskopi och 3D-bildåtergivning för att samla in, analysera och kvantifiera volymetriska data, vaskulär konnektivitet och cellidentitet. Vidare beskriver vi en metod för att dela upp och kvantifiera antalet ECs i varje faryngala som ett sätt att studera bildandet av faryngala arch vaskulära plexus och dess ombyggnad i PAAs. Medan detta protokoll är utformat för att analysera PAA utveckling, det kan användas för att analysera andra utveckla vaskulära nätverk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djuranvändning och djurförsök godkändes av institutionsvårds- och användningskommittén vid Rutgers university.
1. Utarbetande av lösningar
- Förbered 1 L fosfatbuffrad koksaltlösning med 0,1% Triton-X-100 (PBST) och filtrera sterilisera. Denna lösning kan förvaras i rumstemperatur (RT) i minst ett år.
- Förbered 600 μl blockerande buffert bestående av 10% av det normala åsnaserumet i PBST. Gör denna lösning fräsch varje gång.
- Förbered 50 ml av följande metanol (MeOH) utspädningar i en flödeshuva: 25% MeOH i avjoniserat vatten (dH2O), 50% MeOH i dH2O och 75% MeOH i dH2O. Vortex att blanda. Förvaras på RT.
- Förbered 50 ml av följande bensylalkohol-bensoat (BABB) lösningar i 50 ml koniska rör.
- För 100% BABB, tillsätt 32 ml bensilbensoat till 16 ml bensylalkohol (2:1 volym per volymförhållande).
- För 50% BABB, tillsätt 16 ml bensylbensoat och 8 ml bensylalkohol till 24 ml MeOH.
- Täck koniska rör i aluminiumfolie för att skydda mot ljus. Dessa lösningar kan lagras på RT i upp till ett år.
VARNING: BABB är giftigt och frätande. Det ska hanteras och kasseras enligt MSDS.
2. Dissekering och fixering av embryon
OBS: Detta protokoll är lämpligt för E9.5 och E10.5 mus embryon (manliga eller kvinnliga) isolerade från någon mus stam. För yngre och äldre embryon bör inkubationstiderna bestämmas experimentellt för att maximera signal- och brusförhållandet mellan fluorescenssignal.
- Fyll en 35 mm och en 60 mm petriskål med 1x PBS och placera på is tills det behövs.
- Avliva en gravid mus via CO2 inandning. Utför cervikal störning som ett sekundärt mått på dödshjälp.
- Rengör bukområdet av dammen med 70% etanol. Nyp ihop buken med pincett och gör ett V-liknande snitt med kirurgisk sax från bukväggens botten vid mittlinjen; fortsätta att öppna brösthålan. Lyft bukvävnaden och flytta tarmarna åt sidan för att exponera livmoderhornen.
- Gör ett snitt vid basen av vaginalkanalen, och med pincett, dra livmodern bort från dammen. Gör ett extra snitt vid varje äggstock för att frigöra livmodern. Överför livmodern till en av de 60 mm petriskålar som innehåller kall 1x PBS.
- Med rak sax, skär livmoderväggen mellan varje implantationsställe. Plocka upp en decidua med ett glas pipet och överför till 35 mm petriskål med 1x PBS. Under ett dissekeringsmikroskop sätter du in rak sax i utrymmet mellan decidua och livmoderväggen. Klipp och ta bort livmoderväggen.
- Med fina pincett, ta bort decidua och Reicherts membran från embryot genom att noggrant göra tvärgående snitt längs vävnaden och dra vävnaden bort från äggulan säcken. Ta bort gulesäck och fostersäck genom att försiktigt dra bort vävnaden från embryot och göra nedskärningar på allantois och navelviska venen.
OBS: Gullksäckar kan användas för genotypning av embryon. - Överför varje embryo med en glaspip till enskilda 2 ml-rör fyllda med 1 ml 1x PBS. Märk varje rör med en unik identifierare.
- För att fixa embryon, ta försiktigt bort 1x PBS och tillsätt 4% paraformaldehyd (PFA) lösning i 1x PBS. Inkubera vid 4 °C med mild omrörning över natten.
OBS: 4% PFA fixering är lämplig för de antikroppar som nämns i detta protokoll. Fixeringsförfaranden bör dock optimeras för ytterligare antikroppar.
3. Embryo färgning
OBS: I detta avsnitt är embryon permeabiliserade och färgade med primära och sekundära antikroppar. Eftersom PAA utveckling fortsätter snabbt, skillnader i embryonala skede kommer att kraftigt påverka analysen nedströms. Embryona måste därför åldersmatchas genom att noggrant räkna somiter för att matcha kontroll och muterade par före ytterligare manipuleringar.
- För att tvätta embryon, ta försiktigt bort 4% PFA och tillsätt 1x PBS. Vänd försiktigt in röret/rören flera gånger. Placera rören(erna) höger sida upp och låt embryot (s) att sjunka. Upprepa tvätten 3 gånger. Placera rören/rören med embryon på is.
OBS: (Valfri stopppunkt) Efter tvättarna kan embryon torkas i graderade serier av MeOH i 30 min per spädning, som i avsnitt 1.3, och lagras vid -20 °C i 100% MeOH för senare användning i upp till 6 månader. - För E10.5-embryon, använd en glaspipa för att överföra ett embryo till en 35 mm petriskål fylld med kyld 1x PBS. Nyp försiktigt embryot strax ovanför bakbenet med fina pincett och gör ett tvärgående snitt för att ta bort den bakre halvan av embryot. Detta gör det möjligt för embryot att ligga platt i en sagittal position för steg 4.2. Placera tillbaka embryot i 2 ml-röret med färsk 1x PBS.
OBS: Ett kontroll- och mutantembryon kan paras ihop och färgas med samma antikroppslösning i ett rör, för steg 3.3 till och med 3.8.- Om färgning två embryon tillsammans, skär huvudet av ett embryo ovanför den första faryngala genom att nypa med fina pincett för att göra en tvärgående snitt. Detta kommer att skilja embryon av två olika genotyper inom varje rör.
- För att permeabilisera embryot(er), pipet ut 1x PBS från röret, var noga med att inte röra embryot (s). Tillsätt 1 ml PBST. Placera röret vid 4 °C med mild omrörning över natten.
OBS: (Valfri stopppunkt) Embryon kan förvaras i PBST-lösning vid 4 °C i flera dagar. - För att förhindra icke-specifik bindning av antikroppar, ta först bort PBST från röret, var noga med att inte vidröra embryot(erna). Tillsätt 600 μl blockerande buffertlösning till embryot/embryona. Blockera embryot vid 4 °C med mild omrörning över natten.
OBS: Blockeringslösningen måste snurras med toppfart på en centrifug på bänkskivan omedelbart före användning för att avlägsna skräp. - För att färga och kvantifiera ECs, använd antikroppar mot VEGFR2 och ERG. Antikroppslösningar tillverkas i blockeringsbufferten. Anti-VEGFR2 antikroppar späds 1:200 och ERG antikroppar späds 1:1000.
OBS: Antikroppslösningar måste snurras med toppfart på en centrifug med bänkskiva omedelbart före användning för att avlägsna partiklar.- För att ruva embryon med primära antikroppar, avlägsna blockerande buffertlösning från röret och var noga med att inte vidröra embryot/embryona. Tillsätt 600 μl primär antikroppslösning till varje rör. Inkubera embryon vid 4 °C med mild omrörning i 4-5 dagar.
- För att tvätta antikroppslösningens embryo(er) avlägsna först den primära antikroppslösningen från röret. Tvätta embryon varje timme med 1 ml PBST vid rumstemperatur (RT) med mild omrörning. Tvätta embryot 4-5 gånger under dagen och inkubera sedan vid 4 °C med mild agitation över natten. Upprepa tvättar följande dag.
- Gör sekundära antikroppslösningar genom att späda ut antigeten Alexa Fluor 488 och antimus Alexa Fluor 555 1:300 i blockeringsbuffert. Späd beståndet DAPI 1:1000 i blockeringsbuffert.
OBS: Antikroppslösningar måste snurras med toppfart på en centrifug med bänkskiva omedelbart före användning för att avlägsna partiklar. Dessutom kan andra Alexa Fluor färgämnen användas i stället för 488 eller 555.- För att ruva embryot/embryon med sekundära antikroppar, ta bort PBST från röret. Tillsätt 600 μl sekundär antikroppslösning till varje rör. Inkubera embryon vid 4 °C med mild omrörning i 4-5 dagar.
- För att tvätta antikroppslösningens embryo(er) avlägsna först den sekundära antikroppslösningen från röret. Tvätta embryot varje timme med 1 ml PBST vid RT med mild omrörning. Tvätta embryot 4-5 gånger under dagen och inkubera sedan vid 4 °C med mild agitation över natten. Upprepa tvättar följande dag.
4. Inbäddning av embryon i agaros
OBS: I avsnitt 4 kommer embryot/embryona att bäddas in i agaros. Denna inbäddningsprocess tjänar två syften: att på ett korrekt sätt orientera embryot före avbildning och att hjälpa till att lokalisera embryot efter att det har rensats i BABB (steg 5.2.2 - 5.3.2).
- Förbered 200 ml 1% agaroslösning genom att tillsätta 2 g agaros till 200 ml dH2O. Mikrovågsugn tills all agaros är upplöst.
OBS: Återstående agaros kan förvaras vid 4 °C och värmas upp för senare användning. - Med hjälp av en plast paraffin mögel och glas pipet, försiktigt överföra ett embryo till formen. Ta försiktigt bort PBST från embryot. Placera embryot i sagittalt läge. Snabbt, tillsätt ca 0,5 mL varm agarose till formen - precis tillräckligt för att täcka embryot och fylla formen. Se till att inga luftbubblor omger embryot.
- Placera formen på is och täck med aluminiumfolie tills agarose har stelnat.
OBS: Låt inte embryot torka efter avlägsnandet av PBST. Agaroslösningen måste vara tillräckligt varm för att förbli flytande när den tillsätts till embryot. Lägg precis tillräckligt agarose för att täcka embryot, men inte för mycket, annars blir det svårt att bilden. Bilddjup bestäms delvis av målets arbetsavstånd.
5. Uttorkning och vävnadsclearing
OBS: I detta avsnitt är embryon som torkas ut med metanolserier och rensas sedan i det organiska lösningsmedlet BABB och monteras mellan två täcken som separeras med en gummidistans. i detta protokoll Fast Well gummi distanser används. Fast Well stötfångaren har en dubbelsidig limyta. Distansen behövs för att skapa en brunn, där embryot kommer att placeras och hållas mellan två täcken.
-
Metanol uttorkning
- Märk nya 2 ml-rör, ett per embryo. Tillsätt 1 ml 25% MeOH per rör.
- Med hjälp av en ren skalpell, skär försiktigt agarose runt embryot, lämnar tillräckligt runt embryot så att den kan plockas upp av pincett. Använd fina pincett för att försiktigt ta tag i agarose med det inbäddade embryot och placera den i det märkta röret med 25% MeOH. Låt inte pincetten vidröra embryot.
- Inkubera embryon vid RT med mild agitation i 1 timme i mörker.
- Ta bort 25% MeOH från röret, var noga med att inte röra embryot. Tillsätt 1 ml 50% MeOH per rör. Inkubera vid RT med mild omrörning i 1 timme i mörker.
- Ta bort 50% MeOH från röret, var noga med att inte röra embryot. Tillsätt 1 ml 75% MeOH per rör. Inkubera vid RT med mild omrörning i 1 timme i mörker.
- Ta bort 75% MeOH från röret, var noga med att inte röra embryon (s). Tillsätt 1 ml 100% MeOH per rör. Inkubera vid RT med mild omrörning i 1 timme i mörker. Upprepa 100% MeOH tvätta två gånger.
-
Clearing med BABB
- Ta bort 100% MeOH från röret, var noga med att inte röra embryot. Tillsätt 1 ml 50% BABB per rör. Inkubera vid RT med mild omrörning i 1 timme i mörker.
- Ta bort 50% BABB från röret, var noga med att inte röra embryot. Tillsätt 1 ml 100% BABB per rör. Inkubera vid RT med mild omrörning i 1 timme i mörker. Upprepa 100% BABB tvätta två gånger.
OBS: (Valfri stopppunkt) Embryon kan förbli i 100% BABB i rör i ungefär en vecka. Längre förvaring kommer att orsaka BABB att lösa upp plast av rör.
-
Montering av embryon för avbildning
- Placera en Fast Well stötfångare på en 24 mm x 60 mm #1,5 glaslock slip, genom att skala bort plastlim från ena sidan. Se till att det inte finns några luftbubblor mellan täcket och stötfångaren genom att applicera ett skonsamt tryck på plastlimmet ovanpå gummistötfångaren. Märk täcket med embryonummer, genotyp och antikroppar som används för färgning.
OBS: Alla distanser kan placeras mellan täcken så länge den är tillräckligt tjock för att förhindra krossning eller mosning av ett embryo. Vi använder Fast Well distanser på grund av deras tjocklek och bekvämlighet, som inkluderar självhäftande ytor på vardera sidan av distansen för att säkra den till täckslipar. - Rör försiktigt ut och kassera 100% BABB från röret. Efter visualisering av agarosetedinded embryot i röret, använd fina pincett för att plocka upp agaros och försiktigt överföra embryot på täcket inuti Fast Well - låt inte pincetten röra vid embryot.
- Ta bort det andra plastlimmet från stötfångaren och placera det andra täcket ovanpå. Ta bort luftbubblor genom att försiktigt trycka på täcket. Var noga med att inte krossa glaset.
OBS: Proverna kan förvaras plant i en glidhållare i mörker på RT i upp till ett år om tätningen är tät.
- Placera en Fast Well stötfångare på en 24 mm x 60 mm #1,5 glaslock slip, genom att skala bort plastlim från ena sidan. Se till att det inte finns några luftbubblor mellan täcket och stötfångaren genom att applicera ett skonsamt tryck på plastlimmet ovanpå gummistötfångaren. Märk täcket med embryonummer, genotyp och antikroppar som används för färgning.
6. Insamling av uppgifter
OBS: I följande steg kommer endottel av faryngala bågar 3, 4 och 6 att avbildas med konfokalmikroskopi.
-
Placering av diabilder på mikroskopstadiet
- För att avbilda embryon, använd ett konfokalmikroskop utrustat med ett 20x vattennedsänkningsmål, numerisk bländare 0,95, arbetsavstånd 0,95 mm och NIS-Elements AR 5.11.01 64-bitarsprogramvara.
- Med hjälp av bredfältsfluorescens, visuellt lokalisera svalg bågarna. Centrera fältvyn runt den4: e PAA.
- Om målets synfält inte fångar hela faryngala bågområdet, ta och sy en stor panel av bilder med 1% överlappning. För att förhindra förflyttning av provet under förvärvet av den stora bilden, försiktigt säkra locket slip montering till scenen med gjutning lera.
-
Ställa in anskaffningsparametrar
- Ställ in hålstorleken på 1,0.
- Under fliken ND Acquisition ställer du in de övre och nedre gränserna för avbildning med hjälp av grovjusteringen. Ställ in Z-stegstorlek enligt programvaruspecifikationer. Bestäm vilken tjocklek som kan avbildas av målets arbetsavstånd och provets klarhet.
- På grund av embryots tjocklek justerar du förstärkningen i hela Z-stacken. Ställ in laserintensiteten och förstärkningen i mitten av Z-stacken för varje kanal (405, 488 och 555) och tilldela värden under fliken Z-intensitetskorrigering.
- Bläddra igenom embryot tills fluorescenssignaler börjar dyka upp dimmer. Öka förstärkningen för varje kanal tills signalintensiteten liknar föregående segment. Tilldela det nya värdet under fliken Z-intensitetskorrigering. Importera inställningar tillbaka till ND Acquisition.
- Kör genomsökning med alternativet Kör Z-korrigering.
7. Analys med hjälp av Imaris programvara
Obs: I dessa steg kommer konfokala bilder att analyseras med hjälp av mikroskopi bildanalys programvara, Imaris version 9.2.0. Under denna analys kommer vi först att välja regioner av intresse som ska analyseras genom att skapa ytor. Därefter använder vi maskfunktionen för att visuellt separera dessa regioner. Slutligen kommer vi att använda funktionen Spot för att kvantifiera antalet ecs inom varje region av intresse.
- Beroende på bildhanteringsprogram som används i steg 6 konverterar du bilder till .ims med Imaris File Converter.
- Öppna .ims-filerna. Ställ in bild på Ortogonal under Kamera/Etiketter | Panelen Kameratyp.
- Leta reda på PAA:erna och orientera bilden för ytbeläggning.
När filerna öppnas visas de som en 3D-kompilering av alla segment som avbildas. I det här steget kommer PAAs att lokaliseras genom att göra 3D-bilden till en 2D-bild. 2D-bilden gör det då möjligt för PAAs att vara korrekt orienterade för analys.- Stäng av Volympå panelen Egenskaper . Klicka på Lägg till nytt orthoutsnittunder egenskapspanelen. Properties Ange segmentorientering på XY-planet. Använd segmentpositionen för att bläddra igenom bilden tills paa-resultaten hittas.
- Om PAA:erna inte är parallella med bildens över- och underkant roterar du fritt bilden med muspekaren så att PAA:erna körs från vänster till höger över skärmen. Under listrutan Bildbehandling väljer du Fri Rotera och klickar på OK.
- Ytbeläggning den 3: e Pharyngeal Arch (Figur 2A, B - B")
Obs: I dessa steg kommer faryngala bågarna och PAA:erna att spåras med surface-verktyget för att generera en "ytbehandlad" region av intresse. Detta gör det möjligt för varje region av intresse att visuellt isoleras från den omgivande vävnaden. Häri beskriver vi stegen till ytan och analysera endotelkomponenterna i3:e faryngala. Faryngala bågar 4 och 6 analyseras på samma sätt.- Om du vill visa endotelen i hela3:e faryngala klickar du på knappen Lägg till ny yta under egenskapspanelen. Dubbelklicka på Surface 1 och byt namn på den nya ytan till "3rd Pharyngeal Arch".
- Välj Hoppa över automatisk skapande, redigera manuellt. Ställ in ytorientering på YZ-planet (koronal orientering). Använd sliceposition för att placera3: e faryngala båge yta planet till där 3:e PAA och Dorsal Aorta ansluta.
- Rotera bilden så att den3: e faryngala bågen yta planet är i sikte. Stäng av Ortho Slicer 1.
- Under dragningen | Kontur | Mode, välj funktionen Avståndsritningsläge. Justera parameterinställningarna om det behövs. Underhåll konsekventa ytbeläggningsparametrar mellan proverna. I det här exemplet är Vertex-avståndet 10 μm.
- För att börja surfa, Esc tryck på Esc-tangenten och klicka sedan på draw-knappen. Spåra omkretsen av3: e faryngala med muspekaren. Använd segmentpositionen för att flytta 10-25 segment. Spåra faryngalas omkrets. Upprepa tills svalgbågen är helt spårad.
- Om du vill generera ytan på det spårade området markerar du knappen Skapa yta på egenskapspanelen.
- Ytbeläggning den 3: e PAA (Figur 2C - C")
- För att ytbehandla endotel av 3rd PAA, först stänga av den ytade regionen från steg 7.4, genom att avmarkera den 3:e Pharyngeal Arch yta låda. Klicka sedan på knappen Lägg till ny yta igen. Dubbelklicka på Surface 1 och byt namn på den nya ytan till "3rd PAA".
- Välj Hoppa över automatisk skapande, redigera manuellt. Ställ in ytorientering på YZ-planet (koronal orientering). Använd slicepositionen för att placera det3:e PAA-ytplanet där3:e PAA och Dorsal Aorta ansluter och upprepa sedan steg 7.4.
- Maskering av ytbehandlade strukturer
I följande steg maskeras varje yta region av intresse. Maskering gör att regionen av intresse kan vara visuellt åtskild från resten av den avbildade vävnaden och möjliggör kvantifiering av dessa distinkta strukturer av intresse. Nedan beskriver vi stegen i Imaris för att visualisera och analysera PAA endotel, liksom plexus - den mindre vaskulaturen som omger PAAs inom faryngala bågarna. I dessa steg maskeras den3:e PAA-ytan för att visualisera och utföra analyser endast på paa-erna med hjälp av funktionen Spot som beskrivs i avsnitt 7.7.- Välj Volym för att visualisera alla maskerade kanaler. Tryck på Esc-tangenten för att rotera bilden och placera bilden i en XY-position.
- Välj Maskval för den tredje PAA:n under fliken Redigera. rd Markera DAPI-kanalen och klicka på OK. Upprepa för de återstående kanalerna.
- På tangentbordet trycker du på Ctrl + D för att visa panelen Bildskärmsjusteringar. Markera varje ny kanal och byt namn på dem för att klargöra vad varje kanal visar. Detta kommer till exempel att leda till tre nya kanaler: "3rd PAA DAPI", "3rd PAA ERG" och "3rd PAA VEGFR2".
OBS: I steg 7.6.4-7.6.7 kommer vi att skapa kanaler för faryngala plexus bara. - För att visualisera den endoteliska plexus separat från PAA, väljer vi först Mask val för 3:e PAA yta. Välj DAPI-kanal. Avmarkera Välj voxels utanför ytan till och kontrollera Välj voxels inuti ytan till knappar, ställ in Välj voxels inuti ytan till noll. Klicka på OK.
- Upprepa för de återstående kanalerna. Den här åtgärden utesluter den region som innehåller PAA från de nya maskerade kanalerna. Byt namn på kanaler för att klargöra vad varje kanal visar. Detta kommer till exempel att leda till tre nya kanaler: "Non-PAA DAPI", "Non-PAA ERG" och "Non-PAA VEGFR2".
- Om du vill visualisera endotelplexus i3:e faryngala-bågen väljer du Maskval under fliken Redigera för den3:e Faryngala bågytan. Välj icke-PAA DAPI-kanal. Klicka på OK.
- Upprepa för de återstående icke-PAA-kanalerna. Byt namn på kanaler för att klargöra vad varje kanal visar. Detta kommer till exempel att leda till tre nya kanaler: "Plexus DAPI", "Plexus ERG" och "Plexus VEGFR2".
- Kvantifiering av EG-nummer
OBS: Uttrycket av ERG markerar endotelkärnor vilket gör det bekvämt att kvantifiera EG-nummer. I dessa steg kommer antalet ecs att kvantifieras med hjälp av funktionen Spot för att generera en plats för varje EG som markeras med ERG-uttryck i PAA och plexus. I avsnitt 7.7 kommer fläckar att genereras för varje ERG-positiv cell i den maskerade PAA, följt av avval av fläckar i ERG-positiva, VEGFR2-negativa celler.- På tangentbordet trycker du på Ctrl + D för att visa panelen Bildskärmsjusteringar. Stäng av alla kanaler utom PAA ERG.
- Klicka på knappen Lägg till nya fläckar under fliken Egenskaper. Klicka på Spots 1 och byt namn på den till "PAA Totalt antal ECs". Klicka på den blå pilknappen. För Källkanalväljer du PAA ERG-kanalen. Justera den uppskattade XY-diametern till 4 μm. Fortsätt till nästa panel genom att klicka på den blå pilknappen.
- Justera antalet fläckar som ses med hjälp av glidskalan för att säkerställa att varje EC-kärna (markerad med ERG-uttryck) representeras av en plats. Klicka på den gröna dubbelpilen.
- Stäng av PAA ERG-kanalen i displayjusteringen. Slå på PAA VEGFR2-kanalen för att visualisera PAA-entel.
- För att exakt kvantifiera antalet ECs ser vi till att varje plats uttrycker både EG-markörer, ERG och VEGFR2. Det gör du genom att välja Objektyta under fliken Redigera | Panelen Lägg till/ta bort. Tryck Esc på Esc-tangenten och ta bort alla fläckar som inte är VEGFR2 positiva, genom att hålla ned skift och välja plats.
OBS: I följande steg kommer fläckar att genereras för varje ERG-positiv cell i den maskerade plexus, följt av avval av fläckar i ERG-positiva, VEGFR2-negativa celler. - Klicka på knappen Lägg till nya fläckar under fliken Egenskaper. Välj Spots 1 och byt namn till "Plexus totalt antal ECs". Klicka på den blå pilknappen. För Källkanal väljer du Plexus ERG-kanal. Justera den uppskattade XY-diametern till 4 μm. Upprepa steg 7.7.1 - 7.7.5 för Plexus totala antal ECs.
- Klicka på fliken Statistik för varje platsfunktion för att bestämma det totala antalet ECs i 3:e PAA och faryngala arch plexus.
- Upprepa steg 7.7.1 - 7.7.6 för de återstående PAA och faryngala arch plexus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hela berget immunfluorescens protokoll som presenteras här ger tydliga och rena resultat, vilket möjliggör 3D-rekonstruktion av faryngala endotel, som ses i figur 1A. Det är viktigt att inkubera embryon under en tillräckligt lång tid i varje antikroppslösning för att säkerställa fullständig penetration genom provet, samt att noggrant tvätta embryon efter inkubation av antikroppar. I figur 1Bvisas stora, ljusa prickar som ett resultat av partiklar i antingen antikropps- eller blockeringsbuffertlösningarna. Vi har funnit att centrifuging varje lösning före användning och längre perioder av PBST tvättar efter varje antikropp inkubation löser detta problem.
Figur 2 illustrerar den process som används för att ytan en svalgbåge och en PAA för analys som beskrivs i avsnitt 7 i protokollet. Med hjälp av den maskerade funktionen tillåter Imaris programvara att ytbehandlade områden visuellt separeras och analyseras oberoende av varandra.
Figur 3 visar individuell maskering av olika kärlfack i svalgsbågarna: PAA (figur 3A, B, C)och plexus (figur 3A,, B', C'). Maskering möjliggör analys och kvantifiering av EG-nummer i varje struktur separat. I figur 3C-C användsspotfunktionen för att kvantifiera det totala antalet ecs i både PAA och plexus, genom att tilldela en enda plats för varje kärna som uttrycker ERG. Det är viktigt att notera att algoritmen som används för funktionen Spot är utformad för att generera en punkt för alla pixlar av en angiven storlek. ERG, som används här som en markör för EC-kärnor, uttrycks också i neurala crest celler8; neurala crest celler inte uttrycker VEGFR2. Figur 3D illustrerar ett exempel på en ERG-positiv (grön), VEGFR2-negativ (rosa) plats som har genererats av Imaris Spot-funktionen. Därför är det viktigt att kontrollera att varje punkt representerar ett enda EG och är märkt med både ERG och VEGFR2.
| Steg | Tid | Temperatur | |
| 1 | PBST Tvätt/Permeabilization | 24 h eller O/N | 4 °C |
| 2 | Blockera buffert | 25 h eller O/N | 4 °C |
| 3 | Primär antikropp | 4-5 dagar | 4 °C |
| 4 | PBST-tvätt | 4-5 gånger om dagen i 2 dagar | RT (eller 4 °C om O/N) |
| 5 | Sekundär antikropp | 4-5 dagar | 4 °C |
| 6 | PBST-tvätt | 4-5 gånger om dagen i 2 dagar | RT (eller 4 °C om O/N) |
| 7 | Bädda in | Ej mycket | Rt |
| 8 | Metanol Uttorkning och BABB | 1 timme per steg | Rt |
Tabell 1: Översikt över hela mount immunofluorescens protokoll. O/N - över natten; RT - rumstemperatur.
Figur 1: Jämförelse av rena och smutsiga bilder efter helmonterad immunfluorescens. Sagittal åsikter E10.5 embryo visar användningen av anti-VEGFR2 antikroppar (vit) för att visualisera PAA endotel. Embryon som tvättats noggrant med PBST-inkubationer efter antikropp (A) har ett högre signal-brusförhållande och ger en renare bild jämfört med embryon som inte tvättas noggrant (B). Pilar i B visar områden med buller/smuts som har synts i bilden när ett embryo inte tvättas noggrant eller antikroppslösningen inte har centrifugerats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Ytbeläggning av svalgbåge (PA) och PAA. En 2D sagittal vy (A) används för att identifiera platsen för PAAs i confocal bilden. En koronal ortoskivare (A, gul linje) är placerad genom PAAs. Faryngala(B)och PAA(C) visas sedan i koronal orientering med hjälp av avståndsritningsverktyget i Imaris. Avståndsritverktyget, inställt på 10 μm, används för att spåra omkretsen på den3:e faryngala(B)eller PAA (C). Konturer ritas var 10-25 skivor genom hela bågen(B', C'). Konturer kombineras för att generera en 3D-yta av svalget arch (B ") eller PAA (C "). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kvantifiering av EG-nummer i en PAA och en plexus. 3D-rekonstruktioner används för att visualisera fartygsstrukturen och uttryck för EG-markörer i en PAA eller i en EG-plexus separat. Paneler A-A' visar uttrycket av VEGFR2 i PAA(A, gul)och i plexus (A', rosa). Panel A" illustrerar en sammanslagning av PAA och plexus VEGFR2 uttryck. Panelerna B-B' visar uttrycket av ERG i PAA(B, röd)och i plexus (B', grön). Panel B" illustrerar sammanslagningen av PAA och plexus. C-C. Spotfunktionen i Imaris används för att kvantifiera antalet ecs i antingen PAA eller plexus. Varje ERG-positiv cell i PAA(C, röd)eller plexus(C', grön)tilldelas en enda plats för att markera ett enda EG. Pilen i C'-D visar ett exempel ERG-positiv, VEGFR2-negativ plats i plexus som har genererats av Imaris Spot-funktionen. Denna plats är undantagen från kvantifiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmågan att visualisera endotel i mus embryon i 3D har gett nya insikter i deras utveckling3. Här presenterar vi ett protokoll som möjliggör högupplöst 3D-avbildning av embryon, visualisering av vaskulär anslutning och kvantitativa analyser av PAA-bildning. Detta protokoll kan användas för att se hur genetiska förändringar eller miljö förolämpningar inverkan PAA utveckling. Det förfarande som rapporteras här använder antikroppar mot VEGFR2 och ERG för att visualisera PAA-bildning och kvantifiera EG-nummer; emellertid, ytterligare antikroppar kan användas för att visualisera och analysera andra aspekter av arch artär utveckling, såsom neurala crest rekrytering eller glatt muskel cell differentiering. Om detta förfarande ska användas i tidigare stadier av embryogenes är det viktigt att notera att vissa antigener (t.ex. ERG) som detekteras i detta protokoll ännu inte får uttryckas. Andra kärnfläckar som DAPI eller DRAQ5 eller härstamningsmärkning med nukleära spårämnen kan användas för att kvantifiera EG-nummer.
Det finns flera kritiska steg i protokollet: att se till att 1) embryon inte blir uttorkade mellan lösningsändringar; 2) embryon tvättas noggrant efter antikroppsinkubationer; och 3) att embryon är helt uttorkad med MeOH före vävnadsröjning med BABB.
Metanoltvättar före vävnadsclearing har två syften: att eliminera fluorescens på grund av uttrycket av fluorescerande proteiner (t.ex. uttrycket av EGFP eller tdTomato som används för härstamningsspårning) i embryot och att torka ut vävnaden. Eliminering av fluorescens från fluorescerande proteiner möjliggör användning av valfri kombination av fluorofores för avbildning. Antikroppar mot EGFP och TdTomato (körsbär) kan användas för att visualisera uttryck av dessa fluorescerande proteiner. Alternativt kan MeOH ersättas med tetrahydrofuran för att bevara fluorescensen av fluorescerande proteiner9.
Vi har funnit att embryon som inte har torkats ordentligt före BABB clearing är svåra att avbilda på grund av ljusspridning. BABB är en hydrofoba lösning som kräver fullständig uttorkning i ett organiskt lösningsmedel för att rensa den ogenomskinliga vävnaden. Fullständig rensning säkerställer möjligheten att få bilder på djupaste möjliga nivåer inom embryot10,,11. I detta protokoll använde vi en 20x vatten nedsänkning mål, på grund av dess långa arbetsavstånd och tillgänglighet vid tidpunkten för våra experiment. Oljenedsänkningsmålen är bättre lämpade för detta protokoll, eftersom BABB och olja har närmare brytningsindex än vatten och BABB. Men trots skillnaden i brytningsindex, vatten nedsänkning mål som används i detta protokoll som utmärkt bildkvalitet.
Det finns några begränsningar i detta protokoll. BABB clearing används här är giftigt och frätande11,12,13. BABB löser upp lim och plast. Om proverna inte hanteras korrekt under avbildningen kan mikroskop objektivlinsen skadas av BABB som kan komma ut från provet via sprickor i täcket eller en bruten tätning mellan Fast Well-stötfångaren och täcket. Clearingmetoder som inte använder organiska lösningsmedel, såsom KLARHET, kan användas som alternativ10,,11,14. CLARITY:s brytningslösning för brytningsindex har ett brytningsindex som liknar vatten, vilket gör den till en lämplig clearingmetod om den använder ett nedsänkningsmål för vatten. En ytterligare begränsning av detta protokoll är att det endast kan utföras på icke-levande vävnader, vilket förhindrar dess tillämpning för levande bildbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Brianna Alexander, Caolan O'Donnell och Michael Warkala för noggrann läsning och redigering av detta manuskript. Detta arbete stöddes av finansieringen från National Heart, Lung and Blood Institute vid NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 till SA; AJR stöds av NHLBI HL103920-08S1 och National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases Training grant T32052283-11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
- Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
- Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
- Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
- Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
