Summary
I denne protokol præsenterer vi et eksperimentelt design ved hjælp af et betinget knockdown-system og en tilpasset kugledannelsesanalyse for at undersøge klyngeins indvirkning på stænglen af patientudledte GCSE'er. Protokollen kan let tilpasses til at studere både in vitro og in vivo funktion af stængel-associerede gener i forskellige typer af CSC'er.
Abstract
Kræft stamceller (CSCs) er impliceret i tumor indledning, udvikling og tilbagefald efter behandling, og er blevet centrum for opmærksomhed i mange undersøgelser i de sidste årtier. Derfor er det vigtigt at udvikle metoder til at undersøge den rolle, som centrale gener, der er involveret i kræftcelle stamtætighed. Gastrisk kræft (GC) er en af de mest almindelige og dødelige typer af kræft. Gastrisk kræft stamceller (GCSCs) menes at være roden til mavekræft tilbagefald, metastase og resistens over for lægemidler. Forståelse GCS biologi er nødvendig for at fremme udviklingen af målrettede behandlinger og i sidste ende at reducere dødeligheden blandt patienter. I denne protokol præsenterer vi et eksperimentelt design ved hjælp af et betinget knockdown-system og en tilpasset kugledannelsesanalyse for at undersøge klyngeins indvirkning på stænglen af patientudledte GCSE'er. Protokollen kan let tilpasses til at studere både in vitro og in vivo funktion af stængel-associerede gener i forskellige typer af CSC'er.
Introduction
Gastrisk kræft (GC) er en af de mest almindelige og dødelige typer af kræft1. På trods af fremskridt inden for kombineret kirurgi, kemoterapi og strålebehandling i GC terapi, prognose er fortsat dårlig, og de fem-årige overlevelsesraten er stadig meget lav2. Gentagelse og metastase er de vigtigste årsager til dødsfald efter behandlingen.
Kræft stamceller (CSCs) er en delmængde af kræftceller, der besidder evnen til selv at forny og generere de forskellige celle slægter, der rekonstitueretumoren 3. CSCs menes at være ansvarlig for kræft tilbagefald og metastase på grund af deres evne til selvfornyelse og såning nye tumorer, samt deres modstand mod traditionelle kemo- ogradioterapier 4. Derfor giver målretning af CSC'er og eliminering af CSC'er et spændende potentiale til at forbedre behandlingen og reducere dødeligheden hos kræftpatienter.
CSC'er er blevet isoleret fra mange typer af faste tumorer5. I 2009, gastriskkræft stamceller (GCSCs) isoleret fra human gastrisk kræft cellelinjer blev oprindeligt beskrevet af Takaishi et al.6. Chen og kolleger først identificeret og renset GCSE fra humane gastrisk adenocarcinom (GAC) tumorvæv7. Disse resultater giver ikke kun mulighed for at studere GCS's biologi, men giver også stor klinisk betydning.
Et særligt kendetegn ved CSC'er er deres evne til at danne ensfære 8. Enkelte celler er belagt i ikke-vedhæftige forhold ved lav tæthed, og kun de celler, der besiddes med selvfornyelse, kan vokse til en fast, sfærisk klynge kaldet en kugle. Således kuglen dannelse assay er blevet betragtet som guld standard assay og bredt anvendt til at evaluere stamceller selvfornyelse potentiale in vitro.
RNA interferens (RNAi) er et effektivt forskningsværktøj til at studere genfunktion ved knockdown af et bestemt gen9. Men, langsigtede stabile gen knockdown teknologier har visse begrænsninger, såsom den udfordring at udforske funktionen af et gen, der er afgørende for celle overlevelse. Betinget RNAi-systemer kan være nyttige for nedregulering af ønskede gener på en tidsmæssig og/eller særlig kontrolleret måde ved administration af et inducerende middel. Tetracyclin (Tet)-inducerende systemer er et af de mest udbredte betingede RNAi-systemer10. De Tet-inducerende systemer kan fremkalde målgenhæmning ved at kontrollere ekspressionen af shRNA ved tilsætning af en eksogen inducer (fortrinsvis doxycyclin, Dox). De Tet-inducerende systemer kan opdeles i to typer: Tet-On eller Tet-Off systemer. Udtrykket af shRNA kan tændes (Tet-On) eller slukkes (Tet-Off) i tilstedeværelse af induceren. I Tet-ON-systemet uden en inducer binder det konstituerende udtrykte Tet repressor (TetR) sig til Tet-responsive element (TRE) sekvensen, der indeholder en Tet-responsive Pol III-afhængig promotor for shRNA-udtryk, hvilket undertrykker udtrykket af shRNA. Mens der ved tilsætning af Dox, er TetR afsondret væk fra Tet-responsive Pol III-afhængige promotor. Dette letter udtryk for shRNA og fører til gen knockdown.
Den protokol, der er beskrevet her, anvender et funktionelt tetracyclin-induceret shRNA-system og en tilpasset kugledannelsesanalyse til undersøgelse af funktionen af clusterin i patientudledte GCSCs. Clusterin er blevet identificeret som et nyt nøglemolekyle til opretholdelse af GCSCs' stænglers stilk og overlevelse i en tidligere undersøgelse11. Vi bruger den beskrevne protokol til at undersøge virkningerne af clusterin i GCSE'er selvfornyelse. Denne metode gælder også for andre typer kræftstamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg med patientafledte mavekræftstastastaceller, der er beskrevet heri, blev godkendt af det lokale etiske udvalg7.
1. Gastrisk kræft stamcellekultur
- Udarbejdelse af GCSE'er komplet kulturmedium
- Forbered GCS komplet kultur medium ved at tilføje frisk DME/F12 medium med følgende væsentlige ingredienser: 20 ng/ ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1% Insulin / Transferrin / Natrium selent, 0,2% glukose, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% ikke-essentiel aminosyre, 10 μM 2-mercaptoethanol, 0,75 mg/ml NaHCO3, 10 μM thioglycerol, 100 IE/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. Filtrer og steriliseres ved hjælp af et 0,22 μm filter.
BEMÆRK: GCS'er komplet kulturmedium anbefales opbevares helst ikke mere end to uger ved 4 °C.
- Forbered GCS komplet kultur medium ved at tilføje frisk DME/F12 medium med følgende væsentlige ingredienser: 20 ng/ ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1% Insulin / Transferrin / Natrium selent, 0,2% glukose, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% ikke-essentiel aminosyre, 10 μM 2-mercaptoethanol, 0,75 mg/ml NaHCO3, 10 μM thioglycerol, 100 IE/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. Filtrer og steriliseres ved hjælp af et 0,22 μm filter.
- Genopretning af GCSE og kultur
BEMÆRK: GCS'er blev fremstillet som følger: Tumorprøver blev udsat for mekanisk og enzymatisk dissociation. Enkeltcellesuspensioner blev opnået ved filtrering med nylonnet fra velsplintet suspension. De resulterende kræftceller blev dyrket i GCSS Komplet Kultur Medium, og nogle celler voksede til at danne kugler. Disse kugler blev derefter udsat for enzymatisk dissociation, og GCS kan opnås ved cytofluormetrisk sortering af cellepopulationen, der er besyrt med CD44/CD54-markører. De detaljerede protokol og funktionelle analyser af GCSE'erne er blevet rapporteret7.- Forvarst varmt GCSE komplet kulturmedium ved 37 °C i højst 30 min.
- Optø GCSE fra flydende nitrogenoplagring og hurtigt optø kryovials i et 37 °C vandbad. Hold hvirvlende hætteglas, indtil hele indholdet smelter helt.
BEMÆRK: Optø frosne celler hurtigt (<1 min) i et 37 °C vandbad. - Hele indholdet af kryovialerne overføres til et 15 ml centrifugerør, der indeholder 10 ml GCSE'er, komplet kulturmedium. Centrifuge ved 800 x g i 5 min. ved RT.
- Inspirer supernatanten omhyggeligt, og ophæng cellepellet i 10 ml friske GCSE'er komplet medium. Plade celle suspension i en 100 mm petriskål. Pladen inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-inkubator, og der tilsættes 5 ml frisk komplet medium på den tredje dag.
- Subkultur af GCS'er tumorsfærer
BEMÆRK: GCSCs af tumorsfærer center kun har tilstrækkelige næringsstoffer, før kuglerne størrelse vokser op til 80-100 μm i diameter. Når mørke og lav refraktivitet kugler vises (ca. 6 dages kultur), er det nødvendigt at subkultur tumorsfærer.- Ryst skålen forsigtigt og overføre GCSE tumorsfæren kultur medium (medium og ikke-klæbende tumorsfærer) i en steril 15 ml centrifuge rør. Ved større mellemstore mængder kan større centrifugerør være nødvendige.
- Centrifuge ved 600 x g i 5 min. og bortskaf forsigtigt supernatanten. Efter centrifugering vil en off-white pellet være synlig.
- Der tilsættes 2 ml celle dissociationsopløsning for at genbruge pellet til mekanisk og enzymatisk dissociering ved 37 °C. Forsigtigt pipet op og ned 10 gange hver 2-3 min i fordøjelsesproceduren for at bryde kuglerne fra hinanden, indtil tumorsfærerne er spredt i enkelt celle suspension. Denne samlede dissociation proces anbefales at være mindre end 15 min.
BEMÆRK: Udfør en visuel kontrol under mikroskopet for at bekræfte, at der ikke er store kugler eller celleaggregerede. - Tilsæt 10 ml frisk forvarmte GCSE'er komplet kulturmedium (5x volumen af celleløsningen) for at afslutte fordøjelsesproceduren og centrifugeres ved 800 x g ved RT i 5 min.
- Kassér supernatanten, og opsvar cellerne igen med 1 ml frisk forvarmt gcse komplet kulturmedium. Der hældes et passende antal celler i en ny 100 mm petriskål med 10 ml frisk forvarmet GCSE'er komplet kulturmedium og inkubering ved 37 °C, 5 % CO2.
- Refeed tumorspheres kulturer efter 3 dage ved at tilføje 5 ml frisk forvarslede komplet medium. Efter 6 dage, passage celler, når tumorsfærer vokse op til 80-100 μm i diameter.
- Kryopræservering af GCSE
BEMÆRK: Må ikke cryopreserve GCSCs celler ved at tilføje medium til tumorsfærer direkte. GCS's tumorsfærer bør fordøjes i enkelte celler, så cellebeskyttende middel kan trænge ind i hver celle for at sikre langsigtet stabil opbevaring af celler. Sørg for, at cellerne er i en sund situation og uden forurening.- Harvest GCS'er tumorsfærer. Centrifuge ved 600 x g i 5 min.
- Kassér supernatanten og tilsæt 2 ml celleafskævningsopløsning for at adskille GCSC's tumorsfærer ved 37 °C. Afslut fordøjelsesproceduren ved at tilføje 10 ml GCSE'er komplet kulturmedium.
- Centrifuge ved 800 x g i 5 min. og saml enkelte GCS'er.
- Ophæng forsigtigt GCSE med serumfri kryopræserveringsmedium. Den anbefalede endelige koncentration er 5 x 105 - 5 x 106 celler/ml.
- Afspjæling af celler i 1 ml aliquots i markerede kryogene hætteglas.
- Krypterne, der indeholder cellerne, sættes straks i et isopropanolkammer og opbevares ved -80 °C. Overfør hætteglassene til flydende nitrogen den følgende dag til langtidsopbevaring.
2. Generation af inducerende knockdown GCSE linjer
FORSIGTIG: Rekombinant lentivirus er blevet udpeget som niveau 2 organismer af National Institute of Health og Center for Disease Control. Arbejde, der involverer lentivirus, kræver vedligeholdelse af et anlæg på biosikkerhedsniveau 2 i betragtning af, at de virale supernatanter, der produceres af disse lentivirale systemer, kan indeholde potentielt farlige rekombinant virus.
- Generering af lentiviruspartikler
- Syntetisere 2 lentivirale vektorer, der bærer induceret shRNA rettet mod humant klyngein og en ikke-målrettet kontrol lentiviral vektor (GV307) fra GeneChem baseret på udformningen af tabel 1 (GV307 vektor indeholder: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin).
- Frø 4 x 106 293T lenti-viral emballageceller i en 100 mm petriskål med 10 ml DMEM suppleret med 10% føtalt kvægserum.
- Inkuber 293T-celler natten over ved 37 °C, 5% CO2. Sørg for, at 293T celletæthed er omkring 50-80% sammenløb dagen for transfektion.
- Indbring det reducerede serummedium til rumtemperatur, og tilbered rør A og rør B som beskrevet i tabel 2.
- Overfør Rør A i Rør B, bland godt, og inkuber komplekset i 20 min ved stuetemperatur for at forberede lipid-DNA-komplekser.
- Fjern 5 ml medium, før du tilføjer lipid-DNA kompleks, efterlader i alt 5 ml.
- Tilsæt 5 ml lipid-DNA-kompleks i kulturskålen dropwise og hvirvle forsigtigt skålen til at distribuere komplekset.
BEMÆRK: Dispenser forsigtigt væsken mod skålvæggen for at undgå at forstyrre 293T-celler. - Inkuber kulturskål i 24 timer ved 37 °C, 5% CO2.
- Efter 24 timer efter transfektion fjernes transfektionsmediet forsigtigt og udskiftes forsigtigt med 10 ml forvarmt DMEM suppleret med 10% FBS. Inkuber i 24 timer ved 37 °C, 5% CO2.
BEMÆRK: Alle supernatant og spidser skal behandles med 10% blegemiddel før bortskaffelse. - Ca. efter 48 timer efter transfektion, høst 10 ml lentivirus-holdige supernatanter.
BEMÆRK: Alle cellekulturbeholdere og spidser skal behandles med 10 % blegemiddel inden bortskaffelse. - Den lentivirale supernatant filtreres ved hjælp af et 0,45 μm porefilter for at fjerne cellulær snavs.
BEMÆRK: Alle filtre og sprøjter skal behandles med 10 % blegemiddel før bortskaffelse. - Overfør afklaret supernatant til en steril beholder, tilsæt Lenti-X Koncentrator (1/3 volumen af afklaret supernatant) til at blande ved blid inversion.
- Inkuber blandingen ved 4 °C natten over.
- Centrifugeprøver ved 1.500 x g i 45 min. ved 4 °C. Efter centrifugering, og off-white pellet vil være synlige. Fjern forsigtigt supernatant, pas på ikke at forstyrre pellet.
BEMÆRK: Alle supernatant og spidser skal behandles med 10% blegemiddel før bortskaffelse. - Forsigtigt resuspend pellet i 1 ml DMEM suppleret med 10% FBS som virus lager, opbevares ved -80 °C.
- Generering af stabile transficerede cellelinjer
- Frø 6 x 106 GCSE'er i en 100 mm petriskål med 10 ml DMEM suppleret med 10% FBS i 24 timer ved 37 °C, 5% CO2 (70-80% sammenløb før infektion).
- Aspirere mediet i skålen, tilsæt de koncentrerede lentivirale partikler fortyndet med 4 ml komplet DMEM-medium indeholdende polybren reagens (5 μg/ml) i skålen. Inkuber i 18 timer ved 37 °C, 5% CO2.
BEMÆRK: Den optimale koncentration af polybren afhænger af celletypen og skal muligvis testes i forskellige koncentrationer for at bestemme de effektive koncentrationer. Ellers kan det bestemmes empirisk, sædvanligvis i intervallet 2-10 μg/ml. Alle rør og spidser skal behandles med 10% blegemiddel før bortskaffelse. - Mediumn udskiftes med 10 ml DMEM med 10 % FBS-medium og inkuberes i 24 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
BEMÆRK: Alle medier og spidser skal behandles med 10% blegemiddel før bortskaffelse. - Aspirere supernatanten med celleaffald, erstattes med frisk DMEM suppleret med 10% FBS-medium indeholdende puromycin (2,5 μg/ml) og inkuberes i 24 timer ved 37 °C, 5% CO2. Derefter erstattes frisk DMEM suppleret med 10% FBS-medium indeholdende puromycin (5 μg/ml) og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 for yderligere 24 timer.
- Skyl de klæbende GCSC'er to gange med 5 ml DPBS uden calcium og magnesium.
- Dissociat GCS med 1 ml forvarmt celle dissociation opløsning og inkubere 2-3 min ved 37 °C.
- Der tilsættes 5 ml frisk forvarte GCSE'er komplet kulturmedium til cellesuspensionen.
- Der dispenseres 3 ml i et 15 ml centrifugalrør (rør A) til kryopræservering af cellerne, og de øvrige 3 ml i et 15 ml centrifugalrør (rør B) til indblysning ved doxycyklin.
- Centrifugerør A og rør B ved 800 x g i 5 min.
- Opsaltning af pellet af rør A med 1 ml serum-fri kryopræservering medium, overføre hætteglasset til -80 °C natten over, og fjerne det i flydende nitrogen opbevaring.
- Inspirer supernatanten og opslæm cellerne i rør B i 1 ml frisk forvarmte GCSE'er komplet kulturmedium. Der frøs et passende antal celler i en ny 100 mm petriskål på 10 ml frisk forvarmet GCSE'er komplet kulturmed doxycyclin (Dox) (2,5 μg/ml) og inkuberes i 48 timer ved 37 °C, 5% CO2.
BEMÆRK: Den optimale koncentration af Dox kan variere mellem cellelinjer. Hver cellelinje skal testes i forskellige Dox-koncentrationer for at bestemme de effektive koncentrationer for KD og for toksicitet på cellerne. - Bekræft stabil undertrykkelse af klynger i GCSE ved vestlig blotting.
3. Kugledannelsesanalyse
- Tø de frosne inducible knockdown GCSE linjer (se trin 1.2).
- Der bestemmes en 10 μL-prøves levedygtige celletæthed ved hjælp af en automatiseret celletæller.
- Juster volumen med forvarte GCSE'er komplet kulturmedium for at opnå en koncentration på 2 x 104 levedygtige celler/ml.
- Dispenseres i 3 nye 96-godt ultra-lav-vedhæftet kultur plade brønde (0,1 ml / godt) hver gruppe.
- Cellerne inkuberes i en inkubator ved 37 °C med 5 % CO2. Kugledannelse bør finde sted inden for 3-10 dage. Overvåge og registrere visualisering af tumorsfærer dannelse hver 2 dage.
BEMÆRK: Mediet anbefales ikke at blive ændret i tilfælde af forstyrrelse af tumorsfærerne dannelse. Disse tumorsfærer bør let skelnes fra enkelt og aggregerede celler. - Bestem tumorsfæredannelse resultater ved at evaluere størrelsen af de dannede tumorsfærer ved hjælp af billeddannelse software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gastrisk kræft stamceller fra primær menneskelige gastrisk adenocarcinom blev dyrket i serum-fri kultur medium. Efter 6 dage, celler udvidet fra en enkelt celle-lignende fænotype (Figur 1A) til at danne store kugler (Figur 1B).
For at vurdere funktionen af clusterin i GCSC'er blev shRNA-sekvenser mod clusterin og krypteret klonet til Tet-GV307-RFP-Puro vektor efter den protokol, der er beskrevet ovenfor. GCS'er, der er stabilt transficeret med en tetracyklin-reguleret shRNA-clusterin-ekstktor, blev genereret og derefter behandlet med doxycyclin i 48 timer(figur 2) (og shRNA forvrænget som kontrol). Ekspressionsniveauet for clusterin blev verificeret af western blot og efterfølgende kvantificeret af densitometri (figur 3).
Kugledannelsesanalysen blev brugt til at teste gcse'ernes selvfornyelsespotentiale. Vi hypotese, at clusterin fremmer selvfornyelse potentiale GCSE, og derfor færre kugler bør observeres, når clusterin er downregulated ved tilsætning af doxycyclin. Vi viste, at tilstedeværelsen af doxycyclin og knockdown af clusterin i GCSC hæmmet tumorsfære dannelse (Figur 4). GCS'ernes celle-/kuglestørrelser steg ikke, da klyngen blev reduceret i GCSE (figur 5). Ingen hæmning af tumorsfæredannelse blev observeret med GCS'er transduced med forvrænget shRNA kontrol, hvilket indikerer, at doxycyclin ikke havde nogen hæmmende virkning på tumorsfæredannelsen (Figur 5). Disse resultater foreslog, at efter clusterinhæmning, GCSE vokse langsomt og kan ikke danne tumorsfærer. Baseret på in vitro-data spiller clusterin en afgørende rolle med hensyn til at fremme GCSE'ernes selvfornyelsesaktivitet, hvilket indikerer, at clusterin kan være et lovende lægemiddelmål for at undertrykke CSC'er hos GC-patienter.
Figur 1: Cellekulturer af gastrisk kræftstamceller. Single celle kulturer af mavekræft stamceller blev dyrket i 6 dage. Mikroskopiske billeder af disse celler/kugler blev taget på dag 0 (A) og dag 6 (B). Original forstørrelse: 10x. Bar størrelse: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Betinget KD af clusterin udtryk i mavekræft stamceller. GCS's linjer blev etableret ved at inficere lentiviral induceret shRNA-kontrol (shCtrl) eller inducerende shRNA rettet mod clusterin (shClu1, shClu2). Disse cellelinjer blev behandlet med (Dox+) eller uden Dox (2,5 μg/ml) (Dox-) i 48 timer som nævnt. Fase kontrast observation af disse celler blev vist i øverste panel. Immunfluorescerende observation (rød) af disse celler blev vist i nederste panel. Original forstørrelse: 10x. Bar størrelse: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Ekspression af Clusterin i inducerende knockdown GCS linjer med eller uden Dox behandling. Western blotting analyse af clusterin ekspression i cellelinjer stabilt transficeret med tetracyclin-reguleret shRNA-clusterin (shClu1, shClu2) og forvrænget (shCtrl) ekspressionsvektor efter 2 dages doxycyclin behandling. Det relative udtryksniveau for clusterin blev kvantificeret af densitometri og normaliseret mod β-actin, derefter blev angivet under banerne i de vestlige blots. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Mikroskopiske fasekontrastbilleder af inducerede fnCC'ers celler/kugler. Enkelt celle af inducerende knockdown GCS linjer blev inkuberet og behandlet uden Dox (øverste panel) eller med Dox (nederste panel) i 6 dage. Fasekontrastmikroskopiske billeder af disse celler/kugler blev taget på dag 6 som angivet. Original forstørrelse: 10x. Skalabar, 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Inducerende knockdown af Clusterin hæmmer GCSC selvfornyelseskapacitet. Kugledannelsesanalyser blev udført i de inducerende knockdown GCS-linjer. Der blev taget mikroskopiske billeder af disse celler/kugler på den angivne dag, og GCS'ernes celle-/kuglestørrelser blev målt. n>30, ± standardfejl i middelværdi (SEM). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Genes navn | Arter | Gen-id | Målretningssekvens |
| CLU-1 | Menneskelige | 1191 | TGAAACAGACCTGCATGAA |
| CLU-2 | Menneskelige | 1191 | GGGAAGTAAGTACGTCAAT |
Tabel 1: To shRNA-målretningssekvenser mod clusterin.
| Komponent | Volumen |
| Rør A | |
| Reduceret serum medium | 1,5 ml |
| Reagens til transfektion | 41 μL |
| Rør B | |
| Reduceret serum medium | 1,5 ml |
| P3000 Enhancer Reagens | 35 μL |
| pHelper 1.0 (gag/pol komponent) | 9 μg |
| pHelper 2.0 (VSVG-komponent) | 6 μg |
| shCLU 1/2 eller kontrol plasmid | 12 μg |
Tabel 2: Omfanget af viral produktion ved hjælp af transftion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GC er den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. GCSCs er kritiske i mavekræft tilbagefald, metastase og resistens over for lægemidler. Brug af GCS fra gastrisk kræftpatienter vil give os mulighed for at udforske deres svage punkt og udvikle målretning medicin til behandling af GC patienter.
Kuglen dannelse assay er en nyttig metode til at undersøge kræft stamceller selvfornyelse potentiale in vitro. Resultaterne kan præsenteres som procentdelen af kugler dannet divideret med det oprindelige antal enkeltceller seedet. Vi har tilpasset den oprindelige metode til at beregne gennemsnitsstørrelserne for alle celler/kugler på flere tidspunkter for at forbedre resultaterne af denne analyse og for at lette dens reproducerbarhed for andre typer kræftstamceller. Vi certificerede, at resultatet i denne analyse er meget afhængig af antallet af de oprindelige seedede celler. Dette er et kritisk punkt i denne analyse for at opretholde den indledende celleisolering og foretage en nøjagtig måling af antallet af sfæriske kolonier (undtagen cellulære sammenlægninger). Derudover er det vigtigt at optimere tælletiden for klart at skelne kuglerne fra cellulære aggregering og enkelte celler.
Tet-inducerende systemer er nyttige til at studere funktionen af gener, der er afgørende for celle overlevelse in vitro, ligesom clusterin i denne protokol. De er også nyttige til funktionel udforskning af gener in vivo; dette kan gøres ved at tilføje doxycyclin i drikkevandet af dyr. Men, leakiness i den uinducerede tilstand er et ofte rapporteret problem med Tet-inducerende systemer12. I det præsenterede eksperiment observeres der også et lavt utæthedsniveau med shClu2, som vist i figur 3. I dette tilfælde kan vi omhyggeligt sammenligne ændringer af målprotein i KD eller forvrænget kontrol opdaget i nærvær og fravær af doxycyclin at vurdere denne effekt. Et andet vigtigt punkt er mængden af doxycyclin anvendes i kulturen. Da mængden af Dox kan variere mellem cellelinjer, skal hver cellelinje testes med forskellige Dox-doser for at bestemme de effektive koncentrationer for KD og for toksicitet på cellerne.
Den protokol, der præsenteres her, giver en effektiv teknik til at dechifrere de stilk-relaterede gener af CSC'er og studere CSCs 'biologi. Protokollen kan let tilpasses til at undersøge funktionerne af andre kritiske gener i kræft stamceller, såsom stamitet og overlevelse. Derudover er det muligt at undersøge de biologiske funktioner i målgener, ikke kun in vitro, men også in vivo, betinget knockdown af genekspression i CSC'er. Men, bare nogle CSC'er kan ikke danne fast, typiske tumorsfærer, denne protokol bør tilpasses ved hjælp af andre metoder til at undersøge kræft stamceller selvfornyelse potentiale in vitro, for eksempel, undersøge udtrykket af stemness-relaterede markører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Nature Science Foundation of Guangdong-provinsen (2018A030310586, 2020A1515010989), Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province (A2019405), National Natural Science Foundation of China (81772957), Videnskab og Teknologiprogram i Guangdong-provinsen i Kina (2017B030301016) og Industry and Information Technology Foundation of Shenzhen (20180309100135860).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Pützer, B. M., Solanki, M., Herchenröder, O. Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).
- Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope. Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).
- Takaishi, S., et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).
- Chen, T., et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients. Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Hannon, G. J., Rossi, J. J. Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).
- Seibler, J., et al. Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system. Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).
- Xiong, J., et al. Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function. International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).
- Ohkawa, J., Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).
