Summary
I denne protokollen presenterer vi en eksperimentell design ved hjelp av et betinget knockdown-system og en tilpasset sfæreformasjonsanalyse for å studere effekten av clusterin på stemness av pasientavledede GCSCer. Protokollen kan enkelt tilpasses for å studere både in vitro og in vivo funksjon av stemness-assosierte gener i ulike typer CSCer.
Abstract
Kreft stamceller (CSCs) er innblandet i tumor initiering, utvikling og tilbakefall etter behandling, og har blitt sentrum for oppmerksomhet av mange studier i de siste tiårene. Derfor er det viktig å utvikle metoder for å undersøke rollen til viktige gener som er involvert i kreftcellestamhet. Magekreft (GC) er en av de vanligste og dødelige krefttypene. Stamceller av magekreft (GCSCer) antas å være roten til tilbakefall av magekreft, metastase og legemiddelresistens. Å forstå GCSCs biologi er nødvendig for å fremme utviklingen av målrettede terapier og til slutt for å redusere dødeligheten blant pasientene. I denne protokollen presenterer vi en eksperimentell design ved hjelp av et betinget knockdown-system og en tilpasset sfæreformasjonsanalyse for å studere effekten av clusterin på stemness av pasientavledede GCSCer. Protokollen kan enkelt tilpasses for å studere både in vitro og in vivo funksjon av stemness-assosierte gener i ulike typer CSCer.
Introduction
Magekreft (GC) er en av de vanligste og dødelige krefttypene1. Til tross for fremskritt i kombinert kirurgi, kjemoterapi og strålebehandling i GC-terapi, forblir prognosen dårlig og femårsoverlevelsesraten er fortsatt svært lav2. Tilbakefall og metastase er hovedårsakene til at dødsfallene etter behandlingen.
Kreft stamceller (CSCs) er en undergruppe av kreftceller som har evnen til å selvfornye og generere de forskjellige cellelinje som rekonstituerersvulsten 3. CsCs antas å være ansvarlig for kreft tilbakefall og metastase på grunn av deres evner av selvfornyelse og seeding nye svulster, samt deres motstand mot tradisjonelle kjemo- og radiotherapies4. Derfor gir målretting av CSCer og eliminering av CSCer et spennende potensial for å forbedre behandlingen og redusere dødeligheten til kreftpasienter.
CsCs har blitt isolert fra mange typer faste svulster5. I 2009 ble magekreft stamceller (GCSCer) isolert fra humane magekreftcellelinjer opprinnelig beskrevet av Takaishi et al.6. Chen og kolleger først identifisert og renset GCS fra humant mage adenokarsinom (GAC) tumorvev7. Disse funnene gir ikke bare en mulighet til å studere GCSCs biologi, men gir også stor klinisk betydning.
En spesiell egenskap ved CSCer er deres evne til å danne en sfære8. Enkeltceller er belagt i ikke-adoniske forhold ved lav tetthet, og bare cellene besatt med selvfornyelse kan vokse til en solid, sfærisk klynge kalt en sfære. Dermed har sfæreformasjonsanalysen blitt ansett som gullstandardanalysen og mye brukt til å evaluere stamcelle selvfornyelsespotensial in vitro.
RNA interferens (RNAi) er et kraftig forskningsverktøy for å studere genfunksjon ved knockdown av et bestemt gen9. Imidlertid har langsiktige stabile gen knockdown teknologier visse begrensninger, for eksempel utfordringen med å utforske funksjonen til et gen som er avgjørende for celleoverlevelse. Betingede RNAi-systemer kan være nyttige for nedregulering av ønskede gener på en timelig og/eller spesiell kontrollert måte ved administrering av et induserende middel. Tetracyklin (Tet)-indukible systemer er en av de mest brukte betingede RNAi systemer10. De Tet-induklebare systemene kan indusere målgens deaktivering ved å kontrollere uttrykket av shRNA ved tilsetning av en eksogen induktor (fortrinnsvis doxycyklin, Dox). Tet-induknebare systemer kan deles inn i to typer: Tet-On eller Tet-Off systemer. Uttrykket for shRNA kan slås på (Tet-On) eller slås av (Tet-Off) i nærvær av induktoren. I Tet-ON-systemet uten en induktor bindes den konstituerende Tet-repressoren (TetR) seg til Tet-responsive element (TRE)-sekvensen som inneholder en Tet-responsive Pol III-avhengig promotor for shRNA-uttrykk, og undertrykker dermed uttrykket til shRNA. Mens ved tilsetning av Dox, TetR er sequestered bort fra Tet-responsive Pol III-avhengige promotor. Dette letter uttrykket av shRNA og fører til gen knockdown.
Protokollen beskrevet her benytter en funksjonell tetracyklin-induserbar shRNA system og en tilpasset sfære formasjon analyse for å studere funksjonen av clusterin i pasient-avledede GCSCs. Clusterin har blitt identifisert som en ny nøkkel molekyl for å opprettholde stemness og overlevelse av GCSCs i en tidligerestudie 11. Vi bruker den beskrevne protokollen til å studere effekten av clusterin i GCSCs selvfornyelse. Denne metodikken gjelder også for andre typer kreftstamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All eksperimentering ved hjelp av pasientavledede magekreft stamceller beskrevet her ble godkjent av den lokale etiske komiteen7.
1. Magekreft stamcellekultur
- Utarbeidelse av GCS-er komplett kulturmedium
- Forbered GCScs komplett kultur medium ved å legge til fersk DME / F12 medium med følgende essensielle ingredienser: 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1% Insulin / Transferrin / Sodium selenitt, 0,2% glukose, 0,5 % B27, 1 % glutamamin, 1 % ikke-essensiell aminosyre, 10 μM 2-mercaptoetanol, 0,75 mg/ml NaHCO3,10 μM tioglycerol, 100 IE/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. Filtrer og steriliser med et 0,22 μm filter.
MERK: GCSCs komplette kulturmedium anbefales lagret fortrinnsvis ikke mer enn to uker ved 4 °C.
- Forbered GCScs komplett kultur medium ved å legge til fersk DME / F12 medium med følgende essensielle ingredienser: 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1% Insulin / Transferrin / Sodium selenitt, 0,2% glukose, 0,5 % B27, 1 % glutamamin, 1 % ikke-essensiell aminosyre, 10 μM 2-mercaptoetanol, 0,75 mg/ml NaHCO3,10 μM tioglycerol, 100 IE/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. Filtrer og steriliser med et 0,22 μm filter.
- Gjenoppretting av GCSCer og kultur
MERK: GCScs ble oppnådd som følger: Tumorprøver ble utsatt for mekanisk og enzymatisk dissosiasjon. Encellede suspensjoner ble oppnådd ved filtrering med nylonnett fra godt spredt suspensjon. De resulterende kreftcellene ble dyrket i GCSCs Complete Culture Medium, og noen celler vokste til å danne kuler. Disse sfærene ble deretter utsatt for enzymatisk dissosiasjon, og GCSCs kan oppnås ved cytofluorometrisk sortering av cellepopulasjonen farget med CD44/CD54 markører. De detaljerte protokoll- og funksjonsanalysene for GCSCene er rapportert7.- Pre-warm GCSCs komplett kultur medium ved 37 °C i ikke mer enn 30 min.
- Tin GCSCs fra flytende nitrogenlagring og tin raskt kryovialer i et 37 °C vannbad. Fortsett å virvle hetteglassene til hele innholdet smelter helt.
MERK: Tin frosne celler raskt (<1 min) i et 37 °C vannbad. - Overfør hele innholdet i kryovialene til et 15 ml sentrifugerør som inneholder 10 ml GCSCs komplette kulturmedium. Sentrifuge ved 800 x g i 5 min ved RT.
- Aspirer supernatanten forsiktig og suspender cellepelleten i 10 ml fersk GCSCs komplett medium. Plate celle suspensjon i en 100 mm Petri skål. Inkuber platen ved 37 °C i en 5 % CO2 inkubator og tilsett 5 ml friskt komplett medium på den tredje dagen.
- Subkultur av GCSCs tumorsfærer
MERK: GCSCs av tumorsfærer sentrum har bare tilstrekkelig næringsstoffer før kulene størrelse vokser opp til 80-100 μm i diameter. Når mørke og lave refraktivitetssfærer vises (ca 6 dager med kultur), er det nødvendig å subkulturere tumorsfærene.- Rist parabolen forsiktig og overfør GCSCs tumorsfærekulturmedium (mediet og de ikke-tilhengerne tumorsfærene) til et sterilt sentrifugerør på 15 ml. For større mellomvolumer kan det være behov for større sentrifugerør.
- Sentrifuge ved 600 x g i 5 min og kast forsiktig overnatanten. Etter sentrifugering vil en off-white pellet være synlig.
- Tilsett 2 ml celledissosiasjonsløsning for å gjenopplive pelleten for mekanisk og enzymatisk dissosiasjon ved 37 °C. Rør forsiktig opp og ned 10 ganger hver 2-3 min i fordøyelsesprosedyren for å bryte kulene fra hverandre til tumorsfærene er dispergert til enkeltcellesuspensjon. Denne totale dissosiasjonsprosessen anbefales å være mindre enn 15 min.
MERK: Utfør en visuell kontroll under mikroskopet for å bekrefte at ingen store kuler eller celleaggregater gjenstår. - Tilsett 10 ml ferske forhåndsvarmede GCS-er komplett kulturmedium (5x volumet av celleavløsningen) for å avslutte fordøyelsesprosedyren og sentrifuge ved 800 x g ved RT i 5 min.
- Kast de supernatante og gjenoppuss cellene med 1 ml friske forhåndsoppvarmede GCS-er komplett kulturmedium. Seed et passende antall celler i en ny 100 mm petriskål med 10 ml fersk forhåndsvarmet GCS komplett kultur medium og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2.
- Refeed tumorsfærer kulturer etter 3 dager ved å legge til 5 ml frisk pre-oppvarmet komplett medium. Etter 6 dager, passasje celler når tumorsfærer vokser opp til 80-100 μm i diameter.
- Kryopreservasjon av GCSCer
MERK: Ikke kryopreserve GCSCs celler ved å legge medium til tumorsfærer direkte. GCSCs tumorsfærer bør fordøyes i enkeltceller slik at cellebeskyttelsesmiddel kan komme inn i hver celle for å sikre langsiktig stabil lagring av celler. Pass på at cellene er i sunn situasjon og uten forurensning.- Høst GCSCs tumorsfærer. Sentrifuge ved 600 x g i 5 min.
- Kast supernatanten og tilsett 2 ml celledissosiasjonsløsning for å fjerne GCSCs tumorsfærer ved 37 °C. Avslutt fordøyelsesprosedyren ved å legge til 10 ml GCS-er komplett kulturmedium.
- Sentrifuge på 800 x g i 5 min og samle enkelt GCSCs.
- Forsiktig suspendere GCSCs med serumfri kryopreservativ medium. Den anbefalte endelige konsentrasjonen er 5 x 105 - 5 x10 6 celler/ml.
- Dispenser cellefjæringen i 1 ml aliquots i merkede kryogene hetteglass.
- Plasser umiddelbart kryovialene som inneholder cellene i et isopropanolkammer og oppbevar dem ved -80 °C. Overfør hetteglassene til flytende nitrogen neste dag for langtidslagring.
2. Generering av induknelige knockdown GCS-linjer
FORSIKTIG: Rekombinante lentivirus er utpekt som nivå 2 organismer av National Institute of Health and Center for Disease Control. Arbeid som involverer lentivirus krever vedlikehold av et biosikkerhetsnivå 2-anlegg, med tanke på at virussupernativa produsert av disse lentiviralsystemene kan inneholde potensielt farlig rekombinantvirus.
- Generering av lentiviruspartikler
- Synthesize 2 lentiviral vektorer som bærer induserbare shRNA rettet mot menneskelig clusterin og en ikke-målrettingskontroll lentiviral vektor (GV307) fra GeneChem basert på utformingen av tabell 1 (GV307 vektor inneholder: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin).
- Frø 4 x 106 293T lenti-viral emballasjeceller i en 100 mm petriskål med 10 ml DMEM supplert med 10% føtal storfe serum.
- Inkuber 293T celler over natten ved 37 °C, 5 % CO2. Kontroller at 293T celle tetthet er ca 50-80% samløpet dagen for transfection.
- Ta det reduserte serummediet til romtemperatur og klargjør rør A og rør B som beskrevet i tabell 2.
- Overfør Tube A til Tube B, bland godt og inkuber kompleksene i 20 min ved romtemperatur for å forberede lipid-DNA-komplekser.
- Fjern 5 ml medium, før du legger lipid-DNA kompleks, slik at totalt 5 ml.
- Tilsett 5 ml lipid-DNA-kompleks i kulturretten dråpevis og virvle forsiktig parabolen for å distribuere komplekset.
MERK: Dispenser væske forsiktig mot fatveggen for å unngå forstyrrende 293T-celler. - Inkuber kulturrett i 24 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
- Etter 24 timer etter transfection, forsiktig fjerne transfection medium og forsiktig erstatte med 10 ml forhåndsvarmet DMEM supplert med 10% FBS. Inkuber i 24 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
MERK: Alle de supernatante og tipsene skal behandles med 10 % blekemiddel før avhending. - Omtrent etter 48 timer etter transfeksjon høster du 10 ml lentivirusholdige supernatanter.
MERK: Alle cellekulturkar og tips skal behandles med 10 % blekemiddel før avhending. - Filtrer lentiviral supernatant ved hjelp av et 0,45 μm porefilter for å fjerne cellulært avfall.
MERK: Alle filtre og sprøyter skal behandles med 10 % blekemiddel før deponering. - Overfør avklart supernatant til en steril beholder, tilsett Lenti-X Concentrator (1/3 volum av avklart supernatant) for å blande ved skånsom inversjon.
- Inkuber blandingen ved 4 °C over natten.
- Sentrifugeprøver ved 1500 x g i 45 min ved 4 °C. Etter sentrifugering, og off-white pellet vil være synlig. Fjern forsiktig overnaturant, og ta vare på å ikke forstyrre pelleten.
MERK: Alle de supernatante og tipsene skal behandles med 10 % blekemiddel før avhending. - Forsiktig resuspend pellet i 1 ml DMEM supplert med 10% FBS som virus lager, oppbevares ved -80 °C.
- Generering av stabile transfectede cellelinjer
- Frø 6 x 106 GCS i en 100 mm petriskål med 10 ml DMEM supplert med 10% FBS i 24 timer ved 37 °C, 5 % CO2 (70-80 % samløpet før infeksjon).
- Aspirer mediet i fatet, tilsett de konsentrerte lentiviralpartikler fortynnet med 4 ml komplett DMEM medium som inneholder polybrene reagens (5 μg / ml) i parabolen. Inkuber i 18 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
MERK: Den optimale konsentrasjonen av polybrene avhenger av celletype og må kanskje testes i forskjellige konsentrasjoner for å bestemme de effektive konsentrasjonene. Ellers kan det være empirisk bestemt, vanligvis i området 2-10 μg / ml. Alle rør og tips bør behandles med 10% blekemiddel før avhending. - Bytt medium, erstatt med 10 ml DMEM med 10% FBS medium og inkuber i 24 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
MERK: Alt mediet og tipsene skal behandles med 10 % blekemiddel før avhending. - Aspirer supernatanten med celleavfall, erstatt med fersk DMEM supplert med 10% FBS medium som inneholder puromycin (2,5 μg / ml) og inkuber i 24 timer ved 37 ° C, 5% CO2. Deretter erstattes fersk DMEM supplert med 10% FBS medium som inneholder puromycin (5 μg/ml) og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 i ytterligere 24 timer.
- Skyll de tilkvinde GCSCene to ganger med 5 ml DPBS uten kalsium og magnesium.
- Dissosier GCSCer med 1 ml forhåndsoppvarmet celledissosiasjonsløsning og inkuber 2-3 min ved 37 °C.
- Tilsett 5 ml ferske forhåndsoppvarmede GCSCs komplett kulturmedium til cellefjæringen.
- Dispenser 3 ml i et 15 ml sentrifugalrør (rør A) for kryopreservering av cellene, og de andre 3 ml i et 15 ml sentrifugalrør (rør B) for indusering av doxycyklin.
- Sentrifugerør A og rør B ved 800 x g i 5 min.
- Resuspend pellet av rør A med 1 ml serumfri kryopreservativt medium, overfør hetteglasset til -80 °C over natten, og fjern det til flytende nitrogenlagring.
- Aspirer de overnaturante og gjenoppusse cellene i rør B i 1 ml friske forhåndsvarmede GCS-er komplett kulturmedium. Seed et passende antall celler i en ny 100 mm petriskål på 10 ml fersk pre-oppvarmet GCS komplett kultur medium med doxycycline (Dox) (2,5 μg / ml) og inkubere for 48 h ved 37 ° C, 5% CO2.
MERK: Den optimale konsentrasjonen av Dox kan variere mellom cellelinjer. Hver cellelinje bør testes i forskjellige Dox-konsentrasjoner for å bestemme de effektive konsentrasjonene for KD og for toksisitet på cellene. - Bekreft stabil undertrykkelse av clusterin i GCSCs ved vestlig blotting.
3. Analyse av sfæreformasjon
- Tin de frosne indukne, induserbare knockdown-GCS-linjene (se trinn 1.2).
- Bestem levedyktig celletetthet av en 10 μL prøve ved hjelp av en automatisert celleteller.
- Juster volumet med forhåndsoppvarmede GCSCs komplett kulturmedium for å oppnå en konsentrasjon på 2 x 104 levedyktige celler / ml.
- Dispenser i 3 nye 96-brønners ultra-lav-vedlegg kultur plate brønner (0,1 ml / brønn) hver gruppe.
- Inkuber cellene i en inkubator ved 37 °C med 5 % CO2. Sfæredannelse bør skje innen 3-10 dager. Overvåk og registrer visualiseringen av tumorsfæredannelse hver 2.
MERK: Mediet anbefales ikke å endres i tilfelle forstyrrelser i tumorsfæredannelsen. Disse tumorsfærene bør lett skilles fra enkelt- og aggregerte celler. - Bestem tumorsfæreformasjonsresultater ved å evaluere størrelsene på de dannede tumorsfærene ved hjelp av bildeprogramvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stamceller av magekreft fra primært humant mageadenokarsinom ble dyrket i serumfritt kulturmedium. Etter 6 dager ekspanderte celler fra den encellelignende fenotypen (figur 1A) for å danne store kuler (figur 1B).
For å vurdere funksjonen til clusterin i GCSCs, shRNA sekvenser mot clusterin og kryptert ble klonet inn Tet-GV307-RFP-Puro vektor etter protokollen beskrevet ovenfor. GCSCs stabilt transfected med en tetracyklin-regulert shRNA-clusterin uttrykk vektor ble generert og deretter behandlet med doxycycline for 48 h (Figur 2) (og shRNA kryptert som en kontroll). Uttrykksnivået av clusterin ble verifisert av vestlige blot og deretter kvantifisert av densitometry (figur 3).
Sfæreformasjonsanalysen ble brukt til å teste selvfornyelsespotensialet til GCSCer. Vi hypotetisk at clusterin fremmer selvfornyelsespotensialet til GCSCs, og derfor bør færre kuler observeres når clusterin er nedregulert ved tilsetning av doxycyklin. Vi viste at tilstedeværelsen av doxycyklin og knockdown av clusterin i GCSCs hemmet tumorsfæredannelse (figur 4). Celle-/sfærestørrelsene på GCSCer økte ikke når clusterin ble redusert i GCS(figur 5). Ingen hemming av tumordannelse ble observert med GCSCs transdusert med de krypterte shRNA-kontrollene, noe som indikerer at doxycyklin ikke hadde noen hemmende effekt på tumorsfæredannelsen (figur 5). Disse resultatene antydet at etter clusterin deaktivering, GCScs vokse sakte og kan ikke danne tumorsfærer. Basert på in vitro-dataene spiller clusterin en avgjørende rolle i å fremme selvfornyelsesaktiviteten til GCSCer, noe som indikerer at clusterin kan være et lovende legemiddelmål for å undertrykke CSCer hos GC-pasienter.
Figur 1: Cellekulturer av magekreft stamceller. Encellekulturer av magekreft stamceller ble dyrket i 6 dager. Mikroskopiske mikroskopiske fasekontrastbilder av disse cellene/sfærene ble tatt på dag 0 (A) og dag 6 (B). Opprinnelig forstørrelse: 10x. Bar størrelse: 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Betinget KD av clusterin uttrykk i magekreft stamceller. GCSCs linjer ble etablert ved å infisere lentiviral induserbar shRNA-kontroll (shCtrl) eller induserbar shRNA-målretting clusterin (shClu1, shClu2). Disse cellelinjene ble behandlet med (Dox+) eller uten Dox (2,5 μg/ml) (Dox-) i 48 timer som nevnt. Fasekontrastobservasjon av disse cellene ble vist i topppanelet. Immunofluorescerende observasjon (rød) av disse cellene ble vist i bunnpanelet. Opprinnelig forstørrelse: 10x. Bar størrelse: 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Uttrykk for Clusterin i induknelige knockdown GCSCer linjer med eller uten Dox behandling. Vestlig blotting analyse av clusterin uttrykk i cellelinjer stabilt transfisert med tetracyklinregulert shRNA-clusterin (shClu1, shClu2) og kryptert (shCtrl) uttrykk vektor etter 2 dager med doxycyklin behandling. Det relative uttrykksnivået av clusterin ble kvantifisert av densitometri og normalisert mot β-actin, deretter ble indikert under banene til de vestlige blots. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Mikroskopiske mikroskopiske fasekontrastbilder av induktive knockdown-GCS-celler/kuler. En enkelt celle med indukne nedslettede GCSCer-linjer ble inkubert og behandlet uten Dox (topppanel) eller med Dox (bunnpanel) i 6 dager. Mikroskopiske mikroskopiske fasekontrastbilder av disse cellene/sfærene ble tatt på dag 6 som angitt. Opprinnelig forstørrelse: 10x. Skala bar, 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Induserbar knockdown av Clusterin hemmer GCSC selvfornyelseskapasitet. Sphere formasjonsanalyser ble utført i de indukøse knockdown GCS-linjene. Mikroskopiske mikroskopiske fasekontrastbilder av disse cellene/sfærene ble tatt på den angitte dagen, og celle-/sfærestørrelsene på GCSC-er ble målt. n>30, ± standard feil av gjennomsnitt (SEM). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Genets navn | Arter | Gene ID | Målretting sekvens |
| CLU-1 Leilighet | Menneskelige | 1191 | TGAAACAGACCTGCATGAA |
| CLU-2 Leilighet | Menneskelige | 1191 | GGGAAGTAAGTACGTCAAT |
Tabell 1: To shRNA-målrettingssekvenser mot clusterin.
| Komponent | Volum |
| Rør A | |
| Redusert serummedium | 1,5 ml |
| Transinfeksjon Reagens | 41 μL |
| Rør B | |
| Redusert serummedium | 1,5 ml |
| P3000 Enhancer Reagens | 35 μL |
| pHelper 1.0 (gag / pol komponent) | 9 μg |
| pHelper 2.0 (VSVG-komponent) | 6 μg |
| shCLU 1/2 eller kontrollere plasmid | 12 μg |
Tabell 2: Omskala av virusproduksjon ved hjelp av transfeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GC er den tredje ledende årsaken til kreftrelatert død over hele verden. GCSCs er kritiske i magekreft tilbakefall, metastase og legemiddelresistens. Ved hjelp av GCSCs fra magekreft pasienter vil tillate oss å utforske deres svake punkt og utvikle målretting narkotika for behandling av GC pasienter.
Sfæreformasjonsanalysen er en nyttig metode for å undersøke kreft stamcelle selvfornyelsespotensial in vitro. Resultatene kan presenteres som prosentandelen av kuler dannet delt på det opprinnelige antall enkeltceller seeded. Vi tilpasset den opprinnelige metoden for å beregne gjennomsnittsstørrelsene til alle celler/kuler på flere tidspunkter for å forbedre resultatene av denne analysen og for å lette reproduserbarheten for andre typer kreftstamceller. Vi sertifiserte at resultatet i denne analysen er svært avhengig av antall de første seedede cellene. Dette er et kritisk punkt i denne analysen for å opprettholde innledende celleisolasjon og foreta en nøyaktig måling av antall sfæriske kolonier (unntatt cellulære aggregasjoner). I tillegg er det viktig å optimalisere telletiden for å tydelig skille kulene fra cellulære aggregasjoner og enkeltceller.
Tet-induknelige systemer er nyttige for å studere funksjonen til gener som er avgjørende for celleoverlevelse in vitro, akkurat som clusterin i denne protokollen. De er også nyttige for funksjonell utforskning av gener in vivo; dette kan gjøres ved å legge doxycyklin i drikkevannet til dyr. Imidlertid er lekkasje i uindusert tilstand et ofte rapportert problem med Tet-induksible systemer12. I det presenterte eksperimentet observeres også et lavt nivå av lekkasje med shClu2, som vist i figur 3. I dette tilfellet kan vi nøye sammenligne endringene av målprotein i KD eller kryptert kontroll oppdaget i nærvær og fravær av doxycyklin for å vurdere denne effekten. Et annet viktig poeng er mengden doxycyklin som brukes i kulturen. Som mengden dox kan variere mellom cellelinjer, hver cellelinje bør testes med ulike Dox doser for å bestemme de effektive konsentrasjonene for KD og for toksisitet på cellene.
Protokollen som presenteres her gir en effektiv teknikk for å dechiffrere stemness-relaterte gener av CSCer og studere CSCs biologi. Protokollen kan enkelt tilpasses for å studere funksjonene til andre kritiske gener i kreftstamceller, som stemness og overlevelse. I tillegg er betinget knockdown av genuttrykk i CSCer mulig å studere de biologiske funksjonene til målgener, ikke bare in vitro, men også in vivo. Men bare noen CSCer kan ikke danne solide, typiske tumorsfærer, bør denne protokollen tilpasses ved hjelp av andre metoder for å undersøke kreft stamcelle selvfornyelsespotensial in vitro, for eksempel undersøke uttrykket av stemness-relaterte markører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Nature Science Foundation i Guangdong-provinsen (2018A030310586, 2020A1515010989), Medical Scientific Research Foundation i Guangdong-provinsen (A2019405), National Natural Science Foundation of China (81772957), Science og teknologi program av Guangdong-provinsen i Kina (2017B030301016), og Industri og informasjonsteknologi Foundation of Shenzhen (20180309100135860).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Pützer, B. M., Solanki, M., Herchenröder, O. Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).
- Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope. Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).
- Takaishi, S., et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).
- Chen, T., et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients. Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Hannon, G. J., Rossi, J. J. Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).
- Seibler, J., et al. Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system. Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).
- Xiong, J., et al. Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function. International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).
- Ohkawa, J., Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).
