Summary
Neste protocolo, apresentamos um projeto experimental utilizando um sistema de knockdown condicional e um ensaio de formação de esfera adaptada para estudar o efeito da clusterina na haste dos GCSCs derivados do paciente. O protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tanto a função in vitro quanto in vivo de genes associados à haste em diferentes tipos de CSCs.
Abstract
As células-tronco cancerígenas (CSCs) estão implicadas na iniciação, desenvolvimento e recidiva do tumor após o tratamento, e tornaram-se o centro de atenção de muitos estudos nas últimas décadas. Por isso, é importante desenvolver métodos para investigar o papel dos genes-chave envolvidos na haste celular cancerosa. O câncer gástrico (GC) é um dos tipos mais comuns e mortais de câncer. Acredita-se que as células-tronco do câncer gástrico (GCSCs) sejam a raiz da recaída do câncer gástrico, da metástase e da resistência a medicamentos. A compreensão da biologia dos GCSCs é necessária para avançar no desenvolvimento de terapias-alvo e, eventualmente, reduzir a mortalidade entre os pacientes. Neste protocolo, apresentamos um projeto experimental utilizando um sistema de knockdown condicional e um ensaio de formação de esfera adaptada para estudar o efeito da clusterina na haste dos GCSCs derivados do paciente. O protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tanto a função in vitro quanto in vivo de genes associados à haste em diferentes tipos de CSCs.
Introduction
O câncer gástrico (GC) é um dos tipos mais comuns e mortais de câncer1. Apesar dos avanços na cirurgia combinada, quimioterapia e radioterapia na terapia GC, o prognóstico permanece ruim e a taxa de sobrevivência de cinco anos ainda é muito baixa2. A recidiva e a metástase são as principais razões que causam as mortes pós-tratamento.
As células-tronco cancerígenas (CSCs) são um subconjunto de células cancerígenas que possuem a capacidade de se auto-renovar e gerar as diferentes linhagens celulares que reconstituem o tumor3. Acredita-se que os CSCs sejam responsáveis pela recaída do câncer e pela metástase devido às suas capacidades de autoconexão e semeadura de novos tumores, bem como sua resistência à quimioterapia e radioterapias tradicionais4. Portanto, direcionar CSCs e eliminar CSCs fornecem um potencial empolgante para melhorar o tratamento e reduzir a mortalidade de pacientes com câncer.
Os CSCs foram isolados de muitos tipos de tumores sólidos5. Em 2009, células-tronco de câncer gástrico (GCSCs) isoladas das linhas celulares de câncer gástrico humano foram originalmente descritas por Takaishi et al.6. Chen e colegas primeiro identificaram e purificaram GCSCs de tecidos tumorais de adenocarcinoma gástrico humano (GAC)7. Esses achados não apenas proporcionam uma oportunidade de estudar biologia dos GCSCs, mas também fornecem grande importância clínica.
Uma característica particular dos CSCs é sua capacidade de formar uma esfera8. Células únicas são banhadas em condições nãoadherentes em baixa densidade, e apenas as células possuídas com auto-renovação podem crescer em um aglomerado sólido e esférico chamado esfera. Assim, o ensaio de formação da esfera tem sido considerado como o ensaio padrão-ouro e amplamente utilizado para avaliar o potencial de auto-renovação das células-tronco in vitro.
A interferência de RNA (RNAi) é uma poderosa ferramenta de pesquisa para estudar a função genética pela derrubada de um gene específico9. No entanto, tecnologias de knockdown de genes estáveis de longo prazo têm certas limitações, como o desafio de explorar a função de um gene que é essencial para a sobrevivência celular. Sistemas RNAi condicional podem ser úteis para a baixa regulação dos genes desejados de forma temporal e/ou especial controlada pela administração de um agente indutor. Os sistemas induutíveis tetraciclina (Tet) são um dos sistemas condicionais mais utilizados10. Os sistemas indutíveis de Tet podem induzir o silenciamento genético alvo controlando a expressão de shRNA após a adição de um indutor exógeno (preferencialmente doxiciclina, Dox). Os sistemas indutíveis do Tet podem ser divididos em dois tipos: sistemas Tet-On ou Tet-Off. A expressão de shRNA pode ser ligada (Tet-On) ou desligada (Tet-Off) na presença do indutor. No sistema Tet-ON sem um indutor, o repressor Tet (TetR) expresso constitutivamente se liga à sequência de elementos tet-responsivo (TRE) contendo um promotor dependente pol III sensível ao Tet para expressão de shRNA, reprimindo assim a expressão do shRNA. Enquanto, após a adição de Dox, o TetR é sequestrado longe do promotor dependente de Pol III. Isso facilita a expressão do shRNA e leva ao knockdown genético.
O protocolo descrito aqui emprega um sistema de shRNA indutível de tetraciclina funcional e um ensaio de formação de esfera adaptada para estudar a função de clusterin em GCSCs derivados do paciente. Clusterin foi identificado como uma molécula-chave nova para manter a hasteza e a sobrevivência dos GCSCs em um estudo anterior11. Utilizamos o protocolo descrito para estudar os efeitos da clusterina na auto-renovação dos GCSCs. Essa metodologia também é aplicável a outros tipos de células-tronco cancerígenas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todas as experimentações utilizando células-tronco de câncer gástrico derivadas do paciente descritas aqui foram aprovadas pelo comitê de ética local7.
1. Cultura de células-tronco do câncer gástrico
- Preparação de GCSCs meio de cultura completa
- Prepare os GCSCs meio de cultura completa adicionando meio DME/F12 fresco com os seguintes ingredientes essenciais: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% Insulina/Transferrin/Selenita de sódio, 0,2% de glicose, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% aminoácido não essencial, 10 μM 2-mercaptoetanol, 0,75 mg/mL NaHCO3, 10 μM thioglycerol, 100 IU/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina. Filtrar e esterilizar usando um filtro de 0,22 μm.
NOTA: O meio de cultura completo gcscs é recomendado armazenado preferencialmente não mais do que duas semanas a 4 °C.
- Prepare os GCSCs meio de cultura completa adicionando meio DME/F12 fresco com os seguintes ingredientes essenciais: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% Insulina/Transferrin/Selenita de sódio, 0,2% de glicose, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% aminoácido não essencial, 10 μM 2-mercaptoetanol, 0,75 mg/mL NaHCO3, 10 μM thioglycerol, 100 IU/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina. Filtrar e esterilizar usando um filtro de 0,22 μm.
- Recuperação de GCSCs e cultura
NOTA: Os GCSCs foram obtidos da seguinte forma: As amostras de tumores foram submetidas à dissociação mecânica e enzimática. As suspensões de célula única foram obtidas por filtragem com rede de nylon de suspensão bem dispersa. As células cancerígenas resultantes foram cultivadas em GCSCs Complete Culture Medium, e algumas células cresceram para formar esferas. Essas esferas foram então submetidas à dissociação enzimática, e os GCSCs podem ser obtidos por triagem citofluormétrica da população celular manchada com marcadores CD44/CD54. O protocolo detalhado e os ensaios funcionais dos GCSCs foram relatados7.- GCSCs pré-quentes completam o meio de cultura a 37 °C por no máximo 30 min.
- Descongele os GCSCs do armazenamento de nitrogênio líquido e descongele rapidamente os criovias em um banho de água de 37 °C. Continue girando os frascos até que todo o conteúdo derreta totalmente.
NOTA: Descongele rapidamente as células congeladas (<1 min) em um banho de água de 37 °C. - Transfira todo o conteúdo dos criovials para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 10 mL de GCSCs meio de cultura completa. Centrifugar a 800 x g por 5 min no RT.
- Aspire o supernatante cuidadosamente e suspenda a pelota celular em 10 mL de GCSCs frescos meio completo. Aplaque a suspensão da célula em uma placa de Petri de 100 mm. Incubar a placa a 37 °C em uma incubadora de CO2 de 5% e adicionar 5 mL de meio completo fresco no terceiro dia.
- Subcultura de tumores GCSCs
NOTA: Os GCSCs do centro de tumores só possuem nutrientes suficientes antes que o tamanho das esferas cresça até 80-100 μm de diâmetro. Uma vez que as esferas escuras e de baixa refratividade aparecem (cerca de 6 dias de cultura), é necessário subculturar as tumoresferas.- Agite o prato suavemente e transfira o meio de cultura tumorsphere dos GCSCs (os tumores médios e não aderentes) em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Para maiores volumes médios, podem ser necessários tubos de centrífugas maiores.
- Centrifugar a 600 x g por 5 min e dispor cuidadosamente do supernaspe. Após a centrifugação, uma pelota off-white será visível.
- Adicione 2 mL de solução de dissociação celular para resuspensar a pelota para dissociação mecânica e enzimática a 37 °C. Encaixe suavemente para cima e para baixo 10 vezes a cada 2-3 minutos no procedimento de digestão para quebrar as esferas até que as tumorferas sejam dispersas em suspensão de célula única. Recomenda-se que este processo de dissociação total seja inferior a 15 min.
NOTA: Realize uma verificação visual sob o microscópio para confirmar que não permanecem grandes esferas ou agregados celulares. - Adicione 10 mL de GCSCs frescos meio de cultura completa (5x o volume da solução de descolamento celular) para terminar o procedimento de digestão e centrífuga a 800 x g em RT por 5 minutos.
- Descarte o supernasciente e resuspenque as células com 1 mL de GCSCs frescos pré-aquecidos completos meio de cultura. Semente um número apropriado de células em uma nova placa de Petri de 100 mm com 10 mL de GCSCs pré-aquecidos frescos completa cultura média e incubar a 37 °C, 5% CO2.
- Realimentar as culturas tumorais após 3 dias adicionando 5 mL de meio completo pré-aquecido fresco. Após 6 dias, as células de passagem quando os tumores crescem até 80-100 μm de diâmetro.
- Criopreservação de GCSCs
NOTA: Não criopreserve as células GCSCs adicionando meio às tumores diretamente. Os tumores gcscs devem ser digeridos em células únicas para que o agente protetor celular possa entrar em todas as células para garantir o armazenamento estável de células a longo prazo. Certifique-se de que as células estão em situação saudável e sem contaminação.- Colher tumores GCSCs. Centrífuga a 600 x g por 5 min.
- Descarte o supernasce e adicione 2 mL de solução de dissociação celular para dissociar tumores GCSCs a 37 °C. Termine o procedimento de digestão adicionando 10 mL de GCSCs meio de cultura completa.
- Centrifugar a 800 x g por 5 min e coletar GCSCs únicos.
- Suspenda suavemente os GCSCs com meio criopreservador sem soro. A concentração final recomendada é 5 x 105 - 5 x 106 células/mL.
- Dispense a suspensão celular em alíquotas de 1 mL em frascos criogênicos marcados.
- Coloque imediatamente os criovias contendo as células em uma câmara isopropanol e armazene-as a -80 °C. Transfira os frascos para nitrogênio líquido no dia seguinte para armazenamento a longo prazo.
2. Geração de linhas de GCSCs indutíveis
ATENÇÃO: Os lentivírus recombinantes foram designados como organismos de nível 2 pelo Instituto Nacional de Saúde e Centro de Controle de Doenças. O trabalho envolvendo lentivírus requer a manutenção de uma instalação de Biossegurança Nível 2, considerando que os supernacantes virais produzidos por esses sistemas lentivirais poderiam conter vírus recombinantes potencialmente perigosos.
- Geração de partículas de lentivírus
- Sintetizar 2 vetores lentivirais que carregam shRNA indutível visando clusterin humano e um vetor lentiviral de controle não direcionado (GV307) da GeneChem com base no design da Tabela 1 (vetor GV307 contém: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin).
- Semente 4 x 106 293T células de embalagem lentivirais em uma placa de Petri de 100 mm com 10 mL de DMEM suplementadas com soro bovino fetal de 10%.
- Incubar células 293T durante a noite a 37 °C, 5% de CO2. Certifique-se de que a densidade celular 293T é cerca de 50-80% confluente no dia da transfecção.
- Leve o soro reduzido de temperatura média a ambiente e prepare o tubo A e o tubo B, conforme descrito na Tabela 2.
- Transfira o tubo A para o tubo B, misture bem e incuba os complexos por 20 minutos à temperatura ambiente para preparar complexos lipídicos-DNA.
- Remova 5 mL de médio, antes de adicionar complexo lipídeto-DNA, deixando um total de 5 mL.
- Adicione 5 mL de complexo lipídicos-DNA no prato de cultura dropwise e gire suavemente o prato para distribuir o complexo.
NOTA: Dispense cuidadosamente o líquido contra a parede do prato para evitar perturbar as células 293T. - Incubar prato de cultura por 24 h a 37 °C, 5% CO2.
- Após 24 horas após a transfecção, remova cuidadosamente o meio de transfecção e substitua suavemente por 10 mL de DMEM pré-aquecido suplementado com 10% de FBS. Incubar por 24 h a 37 °C, 5% DE CO2.
NOTA: Todos os supernass e pontas devem ser tratados com alvejante 10% antes do descarte. - Aproximadamente após 48 horas após a transfecção, colhe 10 mL de supernantes contendo lentivírus.
NOTA: Todos os vasos e pontas da cultura celular devem ser tratados com alvejante 10% antes do descarte. - Filtre o supernatante lentiviral usando um filtro de poros de 0,45 μm para remover detritos celulares.
NOTA: Todos os filtros e seringas devem ser tratados com alvejante 10% antes do descarte. - Transfira sobrenante esclarecido para um recipiente estéril, adicione o Concentrador Lenti-X (1/3 volume de supernante esclarecido) para misturar por inversão suave.
- Incubar a mistura a 4 °C durante a noite.
- Centrífuga amostras a 1.500 x g para 45 min a 4 °C. Após centrifugação, e pelotas off-white serão visíveis. Remova cuidadosamente o supernasce, tomando cuidado para não perturbar a pelota.
NOTA: Todos os supernass e pontas devem ser tratados com alvejante 10% antes do descarte. - Resuspenque suavemente a pelota em 1 mL de DMEM suplementada com 10% de FBS como estoque de vírus, armazene a -80 °C.
- Geração de linhas celulares transfectadas estáveis
- Semente 6 x 106 GCSCs em uma placa de Petri de 100 mm com 10 mL DMEM complementado com 10% de FBS para 24 h a 37 °C, 5% CO2 (70-80% confluência antes da infecção).
- Aspire o meio no prato, adicione as partículas lentivirais concentradas diluídas com 4 mL de meio DMEM completo contendo reagente de polibreno (5 μg/mL) no prato. Incubar por 18 h a 37 °C, 5% DE CO2.
NOTA: A concentração ideal de polibrene depende do tipo celular e pode precisar ser testada em diferentes concentrações para decidir as concentrações efetivas. Caso contrário, pode ser empiricamente determinado, geralmente na faixa de 2-10 μg/mL. Todos os tubos e pontas devem ser tratados com alvejante 10% antes do descarte. - Mude o médio, substitua por 10 mL de DMEM por 10% de FBS médio e incubar por 24h a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: Todos os meios e as pontas devem ser tratados com alvejante 10% antes do descarte. - Aspire o supernascimento com detritos celulares, substitua por DMEM fresco suplementado com 10% de FBS médio contendo puramicina (2,5 μg/mL) e incubar por 24 h a 37 °C, 5% DE CO2. Em seguida, substitua o DMEM fresco complementado por 10% de FBS médio contendo puramicina (5 μg/mL) e incubar a 37 °C, 5% de CO2 para adicional de 24 h.
- Enxágüe os GCSCs adeptos duas vezes com 5 mL de DPBS sem cálcio e magnésio.
- Dissociar GCSCs com 1 mL de solução de dissociação celular pré-aquecida e incubar 2-3 min a 37 °C.
- Adicione 5 mL de GCSCs pré-aquecidos frescos meio de cultura completa à suspensão celular.
- Dispense 3 mL em um tubo centrífugo de 15 mL (tubo A) para criopreservar as células, e os outros 3 mL em um tubo centrífugo de 15 mL (tubo B) para induzir por doxiciclina.
- Tubo de centrífuga A e tubo B a 800 x g por 5 min.
- Resuspenda a pelota do tubo A com 1 mL de meio criopreservador sem soro, transfira o frasco para -80 °C durante a noite e remova-o em armazenamento líquido de nitrogênio.
- Aspire o supernasal e resuspende as células do tubo B em 1 mL de GCSCs frescos pré-aquecidos completos meio de cultura. Semente um número apropriado de células em uma nova placa de Petri de 10 mm de 10 mL gcscs frescos pré-aquecidos completos com doxiciclina (Dox) (2,5 μg/mL) e incubar por 48 h a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: A concentração ideal de Dox pode variar entre as linhas celulares. Cada linha celular deve ser testada em diferentes concentrações de Dox para decidir as concentrações eficazes para KD e para toxicidade nas células. - Confirme a repressão estável de clusterin em GCSCs por mancha ocidental.
3. Ensaio de formação de esferas
- Descongele as linhas de GCSCs indutíveis congelados (ver passo 1.2).
- Determine a densidade celular viável de uma amostra de 10 μL usando um Contador automatizado de células.
- Ajuste o volume com GCSCs pré-aquecidos meio de cultura completa para obter uma concentração de 2 x 104 células viáveis/mL.
- Dispense em 3 novos poços de placa de cultura de 96 poços de cultura de apego ultra-baixo (0,1 mL/bem) de cada grupo.
- Incubar as células em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2. A formação da esfera deve ocorrer dentro de 3 a 10 dias. Monitore e regise a visualização da formação de tumores a cada 2 dias.
NOTA: O meio não é recomendado para ser alterado em caso de qualquer perturbação da formação tumorosa. Essas tumores devem ser facilmente distinguidas de células únicas e agregadas. - Determine os resultados da formação tumorais avaliando os tamanhos dos tumores formados usando software de imagem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
As células-tronco do câncer gástrico do adenocarcinoma gástrico primário foram cultivadas em meio de cultura livre de soro. Após 6 dias, as células se expandiram do fenótipo de célula única(Figura 1A)para formar grandes esferas(Figura 1B).
Para avaliar a função de clusterin em GCSCs, sequências de shRNA contra clusterin e mexidas foram clonadas no vetor Tet-GV307-RFP-Puro seguindo o protocolo descrito acima. Foram gerados GCSCs transfectados com um vetor de expressão de shRNA-clusterin regulado por tetraciclina e depois tratados com doxiciclina por 48 h(Figura 2) (e shRNA mexido como controle). O nível de expressão da clusterina foi verificado pela mancha ocidental e, posteriormente, quantificado por densitometria(Figura 3).
O ensaio de formação da esfera foi utilizado para testar o potencial de auto-renovação dos GCSCs. Temos a hipótese de que o clusterin promove o potencial de auto-renovação dos GCSCs e, portanto, menos esferas devem ser observadas quando a clusterina é subregulada pela adição de doxiciclina. Demonstramos que a presença de doxiciclina e derrubada de clusterin em GCSCs inibiu a formação da tumorfera(Figura 4). Os tamanhos de célula/esfera dos GCSCs não aumentaram quando a clusterina foi reduzida em GCSCs(Figura 5). Nenhuma inibição da formação tumorosa foi observada com OS GCSCs transduzidos com os controles de shRNA mexidos, indicando que a doxiciclina não tinha efeito inibidor na formação da tumorfera(Figura 5). Esses resultados sugeriram que, após o silenciamento de clusterin, os GCSCs crescem lentamente e não conseguem formar tumores. Com base nos dados in vitro, a clusterina desempenha um papel fundamental na promoção da atividade de auto-renovação dos GCSCs, indicando que o clusterin pode ser um alvo promissor de drogas na supressão de CSCs em pacientes com CG.
Figura 1: Culturas celulares de células-tronco de câncer gástrico. Culturas unicelulares de células-tronco de câncer gástrico foram cultivadas por 6 dias. As imagens microscópicas de contraste de fase dessas células/esferas foram tiradas nos dias 0 (A) e dia 6(B). Ampliação original: 10x. Tamanho da barra: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: KD condicional de expressão de clusterin em células-tronco de câncer gástrico. As linhas de GCSCs foram estabelecidas infectando o controle de shRNA indutível lentiviral (shCtrl) ou o cluster de alvo shRNA indutível (shClu1, shClu2). Estas linhas celulares foram tratadas com (Dox+) ou sem Dox (2,5 μg/mL) (Dox-) por 48 h, conforme observado. A observação do contraste de fase dessas células foi mostrada no painel superior. Observação imunofluorescente (vermelha) dessas células foram mostradas no painel inferior. Ampliação original: 10x. Tamanho da barra: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Expressão de Clusterin em linhas de GCSCs indutíveis com ou sem tratamento Dox. Análise de manchas ocidentais da expressão de clusterin em linhas celulares transfeinada com shRNA-clusterin regulado pela tetraciclina (shClu1, shClu2) e vetor de expressão mexido (shCtrl) após 2 dias de tratamento de doxiciclina. O nível de expressão relativa da clusterina foi quantificado pela densitometria e normalizado contra β-actina, depois foi indicado abaixo das pistas das manchas ocidentais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens microscópicas de contraste de fase de células/esferas de GCSCs indutíveis. Uma única célula de linhas de GCSCs indutíveis foram incubadas e tratadas sem Dox (painel superior) ou com Dox (painel inferior) por 6 dias. As imagens microscópicas de contraste de fase dessas células/esferas foram tiradas no dia 6, conforme indicado. Ampliação original: 10x. Barra de escala, 20 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Knockdown indutível de Clusterin inibe a capacidade de auto-renovação gcsc. Os ensaios de formação da esfera foram realizados nas linhas de GCSCs indutíveis. As imagens microscópicas de contraste de fase dessas células/esferas foram tiradas no dia indicado, e os tamanhos de célula/esfera dos GCSCs foram medidos. n>30, ± erro padrão de média (SEM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome de Gene | Espécie | ID de Genes | Sequência de segmentação |
| CLU-1 | Humano | 1191 | TGAAACAGACCTGCATGAA |
| CLU-2 | Humano | 1191 | GGGAAGTAAGTACGTCAAT |
Tabela 1: Duas sequências de alvo shRNA contra clusterin.
| Componente | Volume |
| Tubo A | |
| Meio soro reduzido | 1,5 mL |
| Reagente de transfecção | 41 μL |
| Tubo B | |
| Meio soro reduzido | 1,5 mL |
| Reagente de enhancer P3000 | 35 μL |
| pHelper 1.0 (componente gag/pol) | 9 μg |
| pHelper 2.0 (componente VSVG) | 6 μg |
| shCLU 1/2 ou plasmid de controle | 12 μg |
Tabela 2: Escala da produção viral utilizando transfecção.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GC é a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Os GCSCs são críticos na recaída do câncer gástrico, metástase e resistência a medicamentos. O uso de GCSCs de pacientes com câncer gástrico nos permitirá explorar seu ponto fraco e desenvolver os medicamentos direcionados para o tratamento de pacientes com GC.
O ensaio de formação de esferas é um método útil para examinar o potencial de auto-renovação das células-tronco do câncer in vitro. Os resultados podem ser apresentados como o percentual de esferas formadas divididas pelo número original de células únicas semeadas. Adaptamos o método original para calcular os tamanhos médios de todas as células/esferas em vários pontos de tempo para melhorar os resultados deste ensaio e facilitar sua reprodutibilidade para outros tipos de células-tronco cancerosas. Certificamos que o resultado neste ensaio é altamente dependente do número de células semeadas iniciais. Este é um ponto crítico deste ensaio para manter o isolamento celular inicial e fazer uma medição precisa do número das colônias esféricas (excluindo agregações celulares). Além disso, é importante otimizar o tempo de contagem para distinguir claramente as esferas das agregações celulares e células únicas.
Sistemas induutíveis de Tet são úteis para estudar a função de genes que são cruciais para a sobrevivência celular in vitro, assim como clusterin neste protocolo. Também são úteis para exploração funcional de genes in vivo; isso pode ser feito adicionando doxiciclina na água potável dos animais. No entanto, o vazamento no estado não induzido é um problema frequentemente relatado dos sistemas indutíveis Tet12. No experimento apresentado, observa-se também um baixo nível de vazamento com shClu2, como mostra a Figura 3. Neste caso, podemos comparar cuidadosamente as alterações da proteína alvo em KD ou controle mexido detectado na presença e ausência de doxiciclina para avaliar esse efeito. Outro ponto importante é a quantidade de doxiciclina aplicada na cultura. Como a quantidade de Dox pode variar entre as linhas celulares, cada linha celular deve ser testada com diferentes doses de Dox para decidir as concentrações eficazes para KD e para toxicidade nas células.
O protocolo aqui apresentado fornece uma técnica eficiente para decifrar os genes relacionados à haste dos CSCs e estudar a biologia dos CSCs. O protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar as funções de outros genes críticos em células-tronco cancerosas, como a haste e a sobrevivência. Além disso, o knockdown condicional da expressão genética em CSCs é viável para estudar as funções biológicas dos genes-alvo não apenas in vitro, mas também in vivo. No entanto, apenas alguns CSCs podem não formar tumores sólidos e típicos, este protocolo deve ser adaptado usando outros métodos para examinar o potencial de auto-renovação das células-tronco do câncer in vitro, por exemplo, examinando a expressão de marcadores relacionados à haste.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Nature Science Foundation da província de Guangdong (2018A030310586, 2020A1515010989), a Medical Scientific Research Foundation da Província de Guangdong (A2019405), a Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81772957), a Ciência e Programa de Tecnologia da Província de Guangdong, na China (2017B030301016), e da Fundação indústria e tecnologia da informação de Shenzhen (20180309100135860).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Pützer, B. M., Solanki, M., Herchenröder, O. Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).
- Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope. Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).
- Takaishi, S., et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).
- Chen, T., et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients. Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Hannon, G. J., Rossi, J. J. Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).
- Seibler, J., et al. Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system. Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).
- Xiong, J., et al. Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function. International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).
- Ohkawa, J., Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).
