Ensaio de formação de esferas condicionais combinadas e ensaio de formação de esfera adaptada para estudar um gene associado à haste de células-tronco de câncer gástrico derivados do paciente

Resumo

Neste protocolo, apresentamos um projeto experimental utilizando um sistema de knockdown condicional e um ensaio de formação de esfera adaptada para estudar o efeito da clusterina na haste dos GCSCs derivados do paciente. O protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tanto a função in vitro quanto in vivo de genes associados à haste em diferentes tipos de CSCs.

Resumo

As células-tronco cancerígenas (CSCs) estão implicadas na iniciação, desenvolvimento e recidiva do tumor após o tratamento, e tornaram-se o centro de atenção de muitos estudos nas últimas décadas. Por isso, é importante desenvolver métodos para investigar o papel dos genes-chave envolvidos na haste celular cancerosa. O câncer gástrico (GC) é um dos tipos mais comuns e mortais de câncer. Acredita-se que as células-tronco do câncer gástrico (GCSCs) sejam a raiz da recaída do câncer gástrico, da metástase e da resistência a medicamentos. A compreensão da biologia dos GCSCs é necessária para avançar no desenvolvimento de terapias-alvo e, eventualmente, reduzir a mortalidade entre os pacientes. Neste protocolo, apresentamos um projeto experimental utilizando um sistema de knockdown condicional e um ensaio de formação de esfera adaptada para estudar o efeito da clusterina na haste dos GCSCs derivados do paciente. O protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tanto a função in vitro quanto in vivo de genes associados à haste em diferentes tipos de CSCs.

Introdução

O câncer gástrico (GC) é um dos tipos mais comuns e mortais de câncer¹. Apesar dos avanços na cirurgia combinada, quimioterapia e radioterapia na terapia GC, o prognóstico permanece ruim e a taxa de sobrevivência de cinco anos ainda é muito baixa². A recidiva e a metástase são as principais razões que causam as mortes pós-tratamento.

As células-tronco cancerígenas (CSCs) são um subconjunto de células cancerígenas que possuem a capacidade de se auto-renovar e gerar as diferentes linhagens celulares que reconstituem o tumor³. Acredita-se que os CSCs sejam responsáveis pel....

Protocolo

Todas as experimentações utilizando células-tronco de câncer gástrico derivadas do paciente descritas aqui foram aprovadas pelo comitê de ética local⁷.

1. Cultura de células-tronco do câncer gástrico

1. Preparação de GCSCs meio de cultura completa
   1. Prepare os GCSCs meio de cultura completa adicionando meio DME/F12 fresco com os seguintes ingredientes essenciais: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% Insulina/Transferrin/Selenita de sódio, 0,2% de glicose, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% aminoácido não essencial, 10 μM 2-mercaptoetanol, 0,75 mg/mL NaHCO₃, 10 μM thioglycerol, 100 IU/mL penicilina e 100 μg/....

Resultados

As células-tronco do câncer gástrico do adenocarcinoma gástrico primário foram cultivadas em meio de cultura livre de soro. Após 6 dias, as células se expandiram do fenótipo de célula única(Figura 1A)para formar grandes esferas(Figura 1B).

Para avaliar a função de clusterin em GCSCs, sequências de shRNA contra clusterin e mexidas foram .......

Discussão

GC é a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Os GCSCs são críticos na recaída do câncer gástrico, metástase e resistência a medicamentos. O uso de GCSCs de pacientes com câncer gástrico nos permitirá explorar seu ponto fraco e desenvolver os medicamentos direcionados para o tratamento de pacientes com GC.

O ensaio de formação de esferas é um método útil para examinar o potencial de auto-renovação das células-tronco do câncer in vitro. Os resultados podem ser .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,22 μ m filtro	Millipore	SLGP033RB
1-Tioglicerol	Sigma-Aldrich	M6145
2-Mercaptoetanol	Gibco	2068586
Animal-Free Recombinante Humano EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Suplemento (50X), sem soro	Gibco	17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Placa de Poços Múltiplos	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess	Invitrogen	C10228
Contador de Células Automatizado Countess II	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-Glicose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
DMEM, Glicose Alta, GlutaMAX, Piruvato	Gibco
Glicato de doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Gibco	14190250
Soro Fetal Bovino, qualificado, Austrália	Gibco	10099141
GlutaMAX Suplemento	Gibco	35050061
Insulina, Transferrina, Solução de Selênio (ITS -G), 100X	Gibco
vetor lentiviral	GeneChem	GV307
Lenti-X Concentrator	Takara	631232
Lipofectamine 3000 Reagente de Transfecção	Invitrogen	L3000015
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais, 100X	Gibco	11140050
Millex-HV Unidade de Filtro de Seringa, 0.45 µ m, PVDF, 33 mm, esterilizado por gama	Millipore	SLHV033RB
Nalgene Tubos criogênicos gerais de armazenamento de longo prazo	Thermo Scientific	5000-1020
Placas de Cultura de Células/Petri Nunc	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I Soro Reduzido Gibco		31985070
Penicilina-Estreptomicina, Líquido	Gibco	15140122
pHelper 1.0 (componente gag/pol)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (componente VSVG)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Humano Recombinante FGF-básico	Peprotech	100-18B
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER Meio de criopreservação	ZENOAQ	11890
Solução de dissociação celular StemPro Accutase	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7,5	Invitrogen	15567027
Microscópio invertido ZEISS	Axio	Vert.A1

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