Summary
Vi beskriver isolation, spredning og plating af dental pulp (DP) primære celler med trigeminus (TG) neuroner dyrket oven overliggende transwell filtre. Cellulære reaktioner af DP-celler kan analyseres med immunfluorescens eller RNA/proteinanalyse. Immunfluorescens af neuronale markører med konfokal mikroskopi tillader analyse af nitrit udvækst reaktioner.
Abstract
Tand inderblod giver tænderne til at fornemme tryk, temperatur og betændelse, som alle er afgørende for brugen og vedligeholdelsen af tandorgel. Uden sensorisk innervation, daglige orale aktiviteter ville forårsage uoprettelig skade. På trods af sin betydning, rollerne innervation i tand udvikling og vedligeholdelse er stort set overset. Flere undersøgelser har vist, at DP celler udskiller ekstracellulære matrix proteiner og paracrine signaler til at tiltrække og guide TG axoner i og i hele tanden. Men, få undersøgelser har givet detaljeret indsigt i krydstale mellem DP mesenchyme og neuronal afferents. For at afhjælpe denne kløft i viden, forskere er begyndt at udnytte co-kulturer og en række teknikker til at undersøge disse interaktioner. Her viser vi de mange trin, der er involveret i co-turing primære DP-celler med TG neuroner spredt på en overliggende transwell filter med stor diameter porer til at tillade axonal vækst gennem porerne. Primære DP-celler med genet af interesse flankeret af loxP steder blev udnyttet til at lette gensletning ved hjælp af en Adenovirus-Cre-GFP rekombinase system. Brug af TG-neuroner fra Thy1-YFP-musen tillod præcis afferent billeddannelse med udtryk et godt stykke over baggrundsniveauerne ved konfokalmikroskopi. DP-responserne kan undersøges via protein- eller RNA-indsamling og -analyse eller alternativt gennem immunfluorescerende farvning af DP-celler belagt med aftagelige glasdækslips. Medier kan analyseres ved hjælp af teknikker såsom proteomiske analyser, selv om dette vil kræve albumin udtynding på grund af tilstedeværelsen af føtal kvæg serum i medierne. Denne protokol giver en simpel metode, der kan manipuleres til at studere morfologiske, genetiske og cytoskeletal reaktioner af TG neuroner og DP celler som reaktion på det kontrollerede miljø af en co-kultur analyse.
Introduction
Tand inderblod giver tænderne til at fornemme tryk, temperatur og betændelse, som alle er afgørende for brugen og vedligeholdelsen af tandorgel. Manglende følelse tandsmerter forbundet med karies og traumer fører til sygdomsprogression. Således korrekt innervation er et krav for normal tandvækst, funktion og pleje.
Mens de fleste organer er fuldt funktionelle og innervated ved fødslen, tand udvikling strækker sig ind i voksenlivet, med tand innervation og mineralisering forekommer i koncert i postnatal fase1,2. Interessant, dental pulp (DP) mesenchyme i første omgang udskiller frastødende signaler under embryogenese for at forhindre axon indrejse i udviklingslandene tandorgel, som senere skifter til udskillelsen af attractant faktorer som tanden nærmer udbrud3,4. Under postnatale stadier trænger afferent axoner fra trigeminusnerven ind i og hele tanden omkring det tidspunkt, hvor dentinaflejring begynder (gennemgået i Pagella, P. et al.5). Flere in vivo undersøgelser har vist, at neuronal-mesenchymal interaktioner guide tand innervation i mus (gennemgået i Luukko, K. et al.6), men få detaljer om de molekylære mekanismer er tilgængelige.
Celle co-kulturer giver kontrollerede miljøer, hvor efterforskere kan manipulere interaktioner mellem neuronal og mesenchymal populationer. Co-kultur eksperimenter gør det muligt at dykke dybere ned i signalering veje vejlede tand innervation og udvikling. Flere af de konventionelle metoder, der anvendes til at studere celler i samkultur, udgør dog tekniske udfordringer. For eksempel kan krystal violet farvning af nitrit udvækst ikke-specifikt pletteSchwann celler indgår i TG bundt dispersions, og der kan være toppe i farveintensitet med relativt små svar7. Mikrofluidic kamre tilbyder en attraktiv mulighed, men er betydeligt dyrere end transwell filtre8,9 og kun tillade undersøgelse af neuronal svar på DP sekreter. For at løse disse problemer har vi udviklet en protokol, der giver mulighed for: a) præcis farvning og billeddannelse af TG nitrit udvækst som reaktion på DP sekreter, b) genetisk modifikation af DP-celler og / eller TG neuroner til at undersøge specifikke signalering veje, og c) undersøgelse af DP celle reaktioner på faktorer udskilles af TG neuroner. Denne protokol giver mulighed for præcist at undersøge flere funktioner i tand innervation i det kontrollerede miljø af en in vitro co-kultur assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg med mus blev godkendt af UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Pladeforberedelse
BEMÆRK: Coverslips kan bruges til at afbilde DP-celler i slutningen af analysen. Sørg for, at pladelåget er tændt under alle inkubationer og skylningstrin uden for den sterile vævskulturhætte for at forhindre kontaminering under prøvebehandling.
-
Forberedelse af dæksel
- Autoklave cirkulære dæksedler.
- Filtrer ultrarent vand under kølerhjelmen.
- Dækslipsene overføres til en 24-brøndsplade, og dæk hver med 400 μL 0,1 mg/ml poly-D-lysin.
- Lad coverslips til at suge, nedsænket i 5 min, på en rocker på 12 rpm eller orbital shaker på 40-50 rpm. Sørg for, at låget er tændt for at forhindre kontaminering.
- Skyl dæksedlerne med filtreret ultrarent vand i ca. 5 minutter på en rocker ved 12 omdr./min. eller shaker ved 50 omdrejninger i minuttet. Gentag.
- Lad dækslipsene tørre i mindst 2 timer under emhætten med pladelåget af for at lette fordampningen. Disse dæksedler skal anvendes inden for 48 timer.
- Frø DP-celler på toppen af dækseler og proces ved afslutningen af analysen for immunfluorescens (punkt 3.3).
-
Overfladebehandlingsfiltre
- Fortyndet laminin til 10 μg/ml. Filter det fortyndede laminin under kølerhjelmen.
- Pipette 450-500 μL 10 μg/ml laminin i hver brønd af en 24-brønds plade.
- Transwell-filteret anbringes i en brønd, således at det kommer i kontakt med lamininopløsningen og efterlades i en 37 °C-inkubator i enten 2 timer eller natten over. Filter porer bør tillade nogle af opløsningen til at diffuse og pels både toppen og bunden af filteret. Disse filtre skal anvendes inden for 48 timer eller nedkøles ved 4 °C i op til 1 uge.
2. Celle plettering med valgfri genetisk manipulation
- Mus: Genetisk ændring af DP-celler kan udføres (men er ikke påkrævet) for at studere mesenkymale-neuronal interaktioner. Se afsnit 2.3 og 2.4 for foreslåede genetiske variationer.
- DP dispersion og plating (figur 1)
BEMÆRK: Til DP-dissektion skal du bruge ultrafine, lige kantpincet. De ultrafine kanter vil gøre det muligt for brugeren at kile kraftskanten mellem den mineraliserede struktur og DP-væv.- Høst P5-P8 mus. På dette stadium, bør tænderne være mineralisering, og roden er åben.
- Afsæter neonaterne via hypotermi ved at placere dem i en skål i 4 °C køleskabet, indtil de ikke længere bevæger sig eller reagerer på berøring. Aflivning af nyfødte ved halshugning og i overensstemmelse med IACUC-procedurer på den udpegede facilitet.
- Forbered en 3-5 ml aliquot på 0,25% trypsin-EDTA i en 50 ml konisk rør til at indsamle DP fra hver mus. Dette vil lette fordøjelsen af dental pulp fra postnatal mus. Brug mere end 3 ml, hvis du fordøjer væv fra mere end 10 postnatale mus.
- Placer hovedet på en engangsunderpad, så munden er mod loftet og bunden af halsen er flad på arbejdsfladen. Brug et barberblad i en savebevægelse til at adskille underkæben fra maxillaen.
- Du kan eventuelt fjerne tungen enten med en saks eller med pincet for at give lettere adgang til kindtænder.
- Anbring det åbne hoved i en skål oven på en steril gazepude, og prøven placeres under et dissekeret mikroskop (Figur 1D).
- Fjern alveolær knoglevæv omkring første kindtænder. Submandibulære tænder er ikke helt brudt ud på dette punkt. Indsæt pincet i alveolær åbning og drille vævet væk fra tanden mod buccal (kind) eller sproglige (tunge) side af munden. Maxillary tænder vil kræve fuld fjernelse af kløften omkring tanden for eksponering og fjernelse.
- Overfør forsigtigt de underkæber og maxillary første kindtænder (M1s) til en separat cellekulturskål med 1x fosfat-buffered saltvand (PBS).
- Gentag 2.2.4-2.2.8, indtil alle M1'ere er indsamlet. Opbevar skålen, der indeholder M1'erne, på is under høsten.
- Fjern Emalje ydre orgel (EOE) omkring ydersiden af hver M1. Dette kan alternativt gøres efter trin 2.2.11.
- Med et sæt pincet, rotere M1, så cusps er nede og den åbne rod er udsat. Der vil være en oval åbning på bunden af tanden, og uigennemsigtigDP væv indkapslet af et tyndt lag dentin og emalje.
- Brug spidsen af pincet, forsigtigt løsne DP ved at køre den ene arm af pincet omkring den indre omkreds af det mineraliserede væv. Fjern DP væv ud af mineraliseret struktur og overføre det til en tredje skål, der indeholder 1x PBS. Udtag EOE, hvis den ikke allerede var adskilt (figur 1E).
- Overfør alt DP-væv til 0,25% trypsin-EDTA i et 50 ml konisk rør. Vortex blandingen og sted i en 37 °C varmt vand bad i 10 min. Dette kan gøres med de samme pincet eller med lange, hætteglas pincet. Vævet vil være vanskeligt at sprede og vil kræve vortexing hver 3-4 min. Må IKKE overstige 10 min trypsinisering, da trypsin kan beskadige cellemembraner.
- Under en steril hætte, tilføje varmet co-kultur medier(Tabel 1)til et endeligt forhold på mindst 1:1 medier til trypsin at inaktivere enzymet. Større nøgletal er acceptable, hvis mere vævspredning ønskes.
- Pipette medierne op og ned flere gange med en 10 ml pipette til yderligere at sprede DP i medierne. Vær omhyggelig med at undgå store bobler. Komplet spredning er næsten umuligt på grund af den klæbrige karakter af vævet. Det er dog heller ikke nødvendigt, da cellerne vil migrere udad fra vævet, når de er belagt.
- Overfør 1 ml af den spredte DP til hver brønd af en 24-brønds vævskulturplade (figur 1F).
- Pladen anbringes i en kuvøse ved 37 °C, og cellerne kan fastgøre og migrere ud fra det uspredte væv i 48 timer, før de skifter medie. Primære celler skal afledes ved relativt høje koncentrationer for at nå 85-90% sammenløb inden for 1 uge. Hvis dette ikke opnås efter 1 uge, skal pladen kasseres.
- Valgfri genetisk manipulation af DP-celler
- For at ændre cellesignaleringsveje skal du høste DP-celler fra genetiske knockoutmus eller fra mus, hvor et gen af interesse flankeres af loxP-steder. I sidstnævnte tilfælde kan genet slettes ved hjælp af Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) rekombinase at fjerne det flankerne gen, som beskrevet nedenfor. Brug Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) som en kontrolvirus for at sikre, at virusinfektionen ikke forårsager et cellulært respons.
BEMÆRK: Ad-eGFP styres af CMV-promotorforstærkeren, som er meget stærk. Ad-Cre-GFP reguleres af en IRES, en intern reguleringsregion mellem Cre og GFP, som ikke er særlig stærk. Dette resulterer i lysere fluorescens i Ad-eGFP-celler end Ad-Cre-GFP-celler. Bekræft tilsvarende infektionsniveauer baseret på det samlede antal celler, der fluorescerer, ikke på niveauet af cellulær fluorescens. - Der fremstilles 500 μL medier indeholdende virus og 10 μg/ml polybrene pr. brønd. Polybrene hjælper med virusinfektion i celler nær sammenløbet10. Denne protokol er baseret på en mangfoldighed af infektion (MOI) på 100 for Ad-eGFP og 200 Ad-Cre-GFP for effektiv geninfektion med ringe eller ingen effekt på cellelevedygtigheden. Det anslåede celletal er 4 x 104 celler/brønd af en 24-brøndsplade:
- Bland medier med korte vortexing eller pipettering og tilsæt 500 μL til hver brønd.
- Efter 24 timer tilsættes yderligere 500 μL co-kulturmedier, der ikke indeholder yderligere polybrene eller virus.
- Efter i alt 48 timer, aspirere virus-holdige medier og erstatte med friske co-kultur medier. På dette tidspunkt, TG neuroner kan tilføjes oven transwell filtre.
- For at ændre cellesignaleringsveje skal du høste DP-celler fra genetiske knockoutmus eller fra mus, hvor et gen af interesse flankeres af loxP-steder. I sidstnævnte tilfælde kan genet slettes ved hjælp af Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) rekombinase at fjerne det flankerne gen, som beskrevet nedenfor. Brug Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) som en kontrolvirus for at sikre, at virusinfektionen ikke forårsager et cellulært respons.
- Trigeminusneurondissektion, dispersion og plating
BEMÆRK: I denne protokol blev billeddannelse af nitritudvækst i co-kultur med DP-celler optimeret ved hjælp af unge (6 uger gamle) B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J mus. Centrale og perifere nervesystemer i Thy1-YFP mus har en gul fluorescerende protein (YFP) tag, hvis udtryk begynder omkring P6-P10 i neuroner og stiger eksponentielt i hele nervesystemet under postnatal og voksenlivet11,12. YFP og GFP har bevaret sekvenser, der tillader disse nerver, der skal farves med anti-GFP antistoffer, hvilket resulterer i en pan-neuronal plet. I sidste ende giver disse mus mulighed for bedre visualisering og kvantificering af de neuroner, der anvendes og dyrkes i cellekultur.- Euthanize unge mus med kuldioxid efterfulgt af cervikal dislokation.
- Halshugge musene og fjerne huden fra kraniet. Sørg for at inkludere tilsvarende antal mænd og hunner.
- Sæt spidsen af et par mikro-dissekere saks i bunden af kraniet. Skær langs skytten sutur af kraniet(figur 1A).
- Lav fire små vandrette snit: to langs koronale suturer ved ørerne, og to langs lambdoid suturer i bunden af kraniet. Dette bør skabe to flapper af knogle.
- Brug pincet til at skrælle de to flapper af knoglen. Dette burde afsløre hjernen.
- Fjern hjernen. Overfør hovedet til en vævskulturskål med 1x PBS og sat under mikroskopet.
- Find TG ganglier, som er let synlig i gnavere13, til huse i dura sagen mellem hjernen og knoglen i maxillary proces(Figur 1B).
- Skær de tre grene, der rejser til øjnene, maxillae og mandible og overføre ganglier til kold 1x PBS ved hjælp af lige kant fine pincet. Hold skålen, der indeholder TG ganglier på is under høsten.
- Når alle TG bundter er høstet, overføre ganglier til en 50 ml konisk rør, der indeholder 5 mg/ml sterilt filtreret kollagen type II ved hjælp af hætteglas pincet.
- Vortex kollagen med TG bundt og læg røret i en 37 °C vandbad i 25-30 min. I løbet af denne tid, tage det koniske rør ud af vandbad, vortex, og vende tilbage til badet hver 5-10 min.
- Centrifugekollagen-TG neuron opløsning i 2 min ved 643 x g.
- Under en vævskultur hætte, forsigtigt aspirere kollagen nase med en mikropipette.
- Der tilsættes 5 ml 1% sterilt filtreret trypsintype II og vortex. Det koniske rør anbringes i et vandbad på 37 °C i 5 min.
- Centrifuger trypsin-TG-blandingen i 5 min ved 643 x g. Fjern den øverste del af trypsin med en mikropipette, så TG-neuronerne ikke fjernes. Der vil stadig være væske i røret.
- Tilføj nok medier til at deaktivere den resterende trypsin (ved et 1:1 eller lavere forhold mellem trypsin og medier).
- Tæl antallet af celler og fortyndes til 200.000 celler/ml (250 μL celleholdige 50.000 celler).
- Placer belagte transwellfiltre fra punkt 1.2 i brønde med DP.
- Celleholdigopløsningen fortyndes, så der er 200.000 celler/ml. Pipette 250 μL på transwellfilteret og kulturcellerne ved 37 °C natten over (figur 1F).
- Den næste dag, erstatte medierne med 1 ml co-kultur medier med 1 μM uridin og 15 μM 5'-fluor-2'deoxyuridin at stoppe over-spredning af mesenchymal celler, der kan forhindre nitrit udvækst. Valgfrit: Tilføj vækstfaktorer eller inhibitorer i dette medie, hvis du forsøger yderligere manipulation.
- Kultur cellerne for yderligere ønskede tidspunkter. Denne protokol blev optimeret til 5 samlede dage af kultur med medierne ændret kun på dag 2 for at tilføje mitotiske hæmmere. Længere tidsperioder kræver yderligere medieændringer.
3. Indsamling og forarbejdning af prøver
- Trigeminusfarvning
- Pipette 1 ml aliquots sterile 1x PBS i en 24-brønds plade under en vævskulturhætte for hvert transwell-filter, der skal behandles.
- Væsken fjernes oven på filteret med en 200-1.000 μL pipette, og sørg for at lade cellelagene være intakte. Knyttede celler bør forblive fastgjort og løssluttede celler vil komme løs under denne blide pipetting. Et vakuumfilter kan beskadige cellelaget og anbefales ikke til aspiration.
- Overfør filteret til 1x PBS-pladen, og sørg for at fjerne det øverste lag af medier som nævnt i det foregående trin.
- Placer pladen med alle transwell filtre og låg på en rocker på 12 rpm eller 40-50 rpm på en orbital shaker i 10 min.
- Aspirate PBS, herunder det øverste lag som beskrevet ovenfor, tilsæt 500 μL af 1xPBS og sted på rocker eller orbital shaker for yderligere 5-10 min skylning.
- Aspirate 1x PBS igen og erstatte med 4% paraformaldehyd (PFA). Brug mindst 500 μL, så hele filteroverfladen er nedsænket. Placer pladen på en rocker på 12 rpm eller orbital shaker på 40-50 rpm ved stuetemperatur i 1 time.
- Fjern PFA og skyl pladerne to gange i 5-10 min hver på en rocker med 500 μL 1x PBS.
- Blok med 10% kvæg serum albumin (BSA) + 5% ged / æsel serum, afhængigt af den sekundære antistof vært dyr, i 0,05% Tween-1xPBS (PBST). Brug 450-500 μL opløsning, så filteret nedsænkes i væsken.
BEMÆRK: På dette stadium kan disse plader opbevares ved 4 °C i flere måneder for at behandle på et senere tidspunkt. Brug parafilm til at forsegle pladen for at sikre, at fordampningen ikke forekommer, og kontroller regelmæssigt for fordampning, så filteroverfladerne forbliver nedsænket. - Fjern blokken og tilsæt 450-500 μL primært antistof i 1% BSA-PBST uden yderligere skylning. Inkuber ved 4 °C natten over, forsigtigt vuggende.
- Fjern primær antistofopløsning og skyl med 500 μL 1xPBST på en rocker, 3 gange, ved stuetemperatur
- Fjern PBST, tilsæt sekundært antistof og inkuber på en rocker natten over ved 4 °C pakket ind i aluminiumsfolie for at beskytte fluorophores fra lysnedbrydning. Skyl igen, 3 gange, med 1x PBST på en rocker ved stuetemperatur. Udskift med 1x PBS.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan pladen opbevares i flere måneder ved 4 °C, hvis den er pakket ind i aluminiumsfolie for at forhindre nedbrydning af fluorophore. Brug parafilm til at forsegle pladen for at sikre, at fordampningen ikke forekommer, og kontroller regelmæssigt for fordampning, så filteroverfladerne forbliver nedsænket. Det er bedst at billedet inden for en måned. - For optimal billeddannelse, udnytte Thy1-YFP mus neuroner med en anti-GFP antistof til specifikt plette neuronal afferents et godt stykke over baggrundsniveauer. Brug Anti-Neurofilament 200 til præcist pletteaxonale strukturer, hvis Thy1-YFP mus ikke er tilgængelige.
- Billede som ønsket. Filtre behøver ikke at være belagt og kan i stedet placeres oven på en dækseddel eller slide til billeddannelse med et omvendt mikroskop.
BEMÆRK: Filterets områder indeholder ikke afferent-strukturer. Tag flere billeder med en z-stack dybde, der fanger alle afferent strukturer. Brug syningssoftware til at visualisere nitritudvækst over store områder eller (helst) hele filterområder.
- RNA, protein og mediesamling
- Mens transwell filtre er forarbejdning, indsamle medierne i RNAse / DNAse-fri rør og fryse til senere analyser (ELISA, proteomics, osv.).
- Umiddelbart efter medieindsamling, aliquot lysis buffer eller Radio Immuno Nedbør Assay (RIPA) buffer med proteinase og fosfatase hæmmere i brøndene. Denne protokol blev optimeret til 100 μL/brønd i en 24-brøndsplade.
- Tillad buffere at lyse celler i 5 min, derefter skrabe hvert filter med en ny pipette spids, og indsamle celleprøver i RNAse / DNAse-fri rør. Fryse lysis for fremtidige analyser (semi-kvantitative og / eller kvantitative PCR, Vestlige blot, osv.).
- Valgfri immunfluorescens af celler i tandmasse:
- Løft forsigtigt dæksedler fra afsnit 1.1 med pincet og overfør dem til forskellige brønde med 4% PFA i 1 time med vuggende.
- Aspirate PFA og skyl dæksedlerne to gange med 1x PBS. Følg dette med permeabilisering, blokering og immunfluorescens for markører af interesse med standard immunfluorescens teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse resultater viser, at TG neutrit udvækst blev øget i tilstedeværelsen af primære DP celler i den underliggende brønd i forhold til kontrol af TG nitrit monokultur (Figur 2A,C). Der er nogle analyse-til-assay variation i nitrit udvækst. Således bør en TG neuron monokultur indgå i alle analyser som en kontrol til at opdage de basale niveauer af nitrit udvækst. Primære celler fra Tgfbr2f/f-musen blev anvendt i denne protokol, efter at infektionen i Ad-Cre-GFP og Ad-eGFP blev bekræftet i tilsvarende antal celler (figur 2D). Ad-eGFP fungerede som en kontrol viral vektor. Ad-Cre-GFP slettede det flankerne gen, Tgfbr2, som det fremgår af semi-kvantitativ PCR (figur 2E). I kulturer med Transforming vækstfaktor beta receptor 2 (Tgfbr2) sletning, nitrit udvækst blev nedsat (Figur 2A-C).
Vi udnyttede Thy1-YFP mus TG neuroner og farves dem med en anti-GFP antistof, der producerede meget specifikke og lyse billeder af axonale strukturer et godt stykke over denne baggrund, som vist i figur 2. Dette gjorde det muligt at opnå neuronal markører uden ikke-specifik farvning af ikke-neuronale celler ved at udnytte tidligere rapporterede metoder såsom krystal violet7. De store porer i filtrene kan automatisk fluoresce og/eller akkumulere sekundære antistoffer og mindske præcisionen af axonal billeddannelse (figur 3). Mens Thy1-YFP neuroner med immunfluorescens drastisk forbedrer billeddannelse, yderligere baggrund kan fjernes med auto-tærskeling software og derefter kvantificeres. Vi anbefaler også at udføre immunfluorescens for Neurofilament 200 baseret på vores foreløbige resultater (ikke vist) samt andre8,9 hvis Thy1-YFP mus ikke er tilgængelige.
Figur 1: En skematisk af musedissektion for at opnå celler til samkultur. (A) Et diagram over, hvor man kan skære for at åbne musen kraniet og finde TG nerver, vist i sort i den sidste skildring. Saks en der angiver, hvor saksspidserne skal indsættes, så de kan skæres langs de stiplede linjer. (B) En kombineret darkfield og GFP billede viser Thy1-YFP + TG nerver kredsede i hvid. (C) Dissekeret TG ganglier kan derefter spredes og dyrkes, som vist i F. (D) Underkæben af en P7 mus, med pincet holder underkæben på venstre og alveolær knogle kamme indeholdende unerupted tænder på hver side af tungen. E) DP-væv (cirkel) udvundet af den mineraliserede struktur (øverst) og emaljeydre epitel (nederst), der blev fjernet for at sprede og plade i en vævskulturbehandlet plade, som vist i F. Billeder vises ikke som skalering. DP celler blev spredt og vokset til sammenløb, før du tilføjer TG neuroner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative resultater fra samkultur. (A-C) Thy1-YFP TG neuroner blev dyrket i transwell filtre med 3 μm porer oven på primære Tgfbr2f/ f DP celler. Immunfluorescerende farvning blev udført for YFP-proteinet ved hjælp af et anti-GFP-antistof for at give meget specifik farvning af neuronale strukturer over hele filteret. De maksimale fremskrivninger af 100 μm z-stack konfokale mikroskopi billeder på 10x blev indsamlet og syet med syning software. TG neuroner viste betydeligt mere udvækst, når co-kulturd med DP celler (A) end når dyrket alene (C). Neurite udvækst blev ikke induceret, når neuroner blev co-kulturret med DP celler inficeret med Ad-Cre-GFP at vælte Tgfbr2 (B). Skalastang = 1.000 μm. Tilsvarende antal celler, der er inficeret med Ad-eGFP og Ad-Cre-GFP, vises i (D). Skalastang = 125 μm. Semi-kvantitative PCR bekræftet Tgfbr2 KD (E). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Tekniske vanskeligheder i afferent billeddannelse. (A) Brightfield billeddannelse af transwell filtre efter krystal violet farvning af cellepopulationer. Store porer er fremherskende. Den store pil påpeger en celle, der udviser mesenkymale morfologi, mens den lille pil peger på en celle af neuronal morfologi. Krystal violet farves begge celler uden bias. (B) Immunfluorescerende farvning af β3 tubulin med et sekundært antistof fra Alexa-488 viste ikke-specifik farvning af flere celler, hvilket gjorde det vanskeligt at billeddannelse af afferentstrukturer. Billeder er repræsentative og blev gentaget over flere analyser for at optimere billedbilledet vist i figur 2. Skalastang = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Komponent | Volumen | Koncentration | |
| MEM α | 440 ml | ||
| Varme inaktiveret føtal kvægserum | 50 ml. | 10% | |
| 100x L-glutamin | 5 ml. | 1x | |
| Penicillin-streptomycin 100 x | 5 ml. | 1x | |
| Skift medier på dag 2 med mitotiske hæmmere ved disse endelige koncentrationer | |||
| Uridine (Uridine) | 1 μM | ||
| 5'-Fluor-2'deoxyuridin | 15 μM | ||
Tabel 1: Co-kultur medier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De daglige aktiviteter i mundhulen kræver, at tænderne fornemmer eksterne stimuli og intern inflammation for at tillade korrekt brug og vedligeholdelse. Der foreligger dog kun begrænsede oplysninger om de signaler, der driver de udviklingsmæssige processer i tandinfisk. Denne protokol giver en metode til at isolere og co-kultur primære DP celler og TG neuroner med henblik på at studere krydskommunikation mellem de to populationer. Flere variabler blev optimeret og efterlade åbne yderligere muligheder for forskning, som beskrevet nedenfor.
Kontrol er vigtige på hvert trin i denne analyse. Et transwell filter med TG neuroner uden underliggende DP-celler bør indgå i hver analyse for at give en baseline for TG vækst. Når du sletter et flankeret gen af interesse med en Ad-Cre-GFP rekombinase, bør der anvendes en kontrolvirus, der kun udtrykker fluorescerende markør, for at bekræfte, at tilsvarende antal celler er blevet inficeret. Mens vi demonstrerede høje niveauer af infektion med minimal celledød på 100 og 200 MOI for Ad-eGFP og Ad-Cre-GFP, henholdsvis hvert laboratorium bør optimere dette trin. Da fluorescerende proteiner kan knyttes til forskellige promotorer og derfor forårsager et tilsvarende antal inficerede, skal fluorescerende celler tælles. Den samlede intensitet af fluorescens er irrelevant, fordi det ikke præcist afspejler infektionstatus. Det er vigtigt at påvise sletning af genet, som vist med semi-kvantitative PCR i denne protokol (figur 2). Selv om denne protokol ikke omhandler dette emne, viste tidligere forskning, at kontrolanalyser med andre cellelinjer kunne medtages for at påvise, at nitritudvæksten specifikt er forårsaget af co-kultur med DP-celler8.
Da denne protokol udnytter primære celler, er der flere faser, hvor kontaminering kan indføres. For at undgå dette skal alle reagenser filtreres sterilt. Derudover anbefales det, at forsøg for hver variabel køres i toeksemplar eller treeksemplarer for at gøre det muligt at fjerne et filter og sterilisering af en forurenet brønd uden fuldstændig svigt af analysen.
Dæksedler skal være belagt med poly-D-lysin og/eller et ekstracellulært matrixprotein for at sikre DP-cellevedhæftning. Mens cellerne i første omgang vedhæfte, virusinfektion forårsager celle løft død på ubestrøget coverslips og forhindrer den genetiske manipulation af co-kultur analyse.
Det er veletableret, at ikke-neuronal celler, såsom Schwann celler fra TG ganglier, kan påvirke overlevelsen af neuronale celler i kultur14,15,16. I denne protokol blev neuronal overlevelse optimeret ved at tilsætte 1 μM uridin og 15 μM 5-fluoro-2'deoxyuridin. Uden tilsætning af disse antimitotiske midler til at hæmme Schwann celleproliferation, nitrit udvækst vil ikke forekomme. Det er uvist, om tilstedeværelsen af disse senescent Schwann celler i co-kultur ændre neuronal respons. Isolere murine neuroner kræver flere yderligere trin, og protokoller er tilgængelige for efterforskere, der ønsker at fjerne denne variabel17. I begge tilfælde, neuron dispersion noget efterligner en axotomy og kunne anses for at repræsentere skade / reparation18 mere end udvikling. Yderligere undersøgelser vil være nødvendige for at bestemme forskellene mellem in vivo axonal vækst fra fascicles versus axonal vækst fra individuelle neuroner in vitro, og disse er ikke behandlet i denne protokol.
Denne protokol tager 1-3 uger fra start til. Selv om det er muligt at udnytte DP celler, der kræver mere end 1 uge for at nå 85-90% sammenløb, Anbefales det, at celler være seedet på en høj nok tæthed til at nå sammenløbet inden for et par dage, da disse celler deler meget langsomt forbi dette punkt. Dette kræver generelt omkring 5-7 P5-8 mus per række af en 24-brønds plade. Denne protokol blev optimeret til i alt 5 dages co-kultur, på hvilket tidspunkt medierne med phenol rød begyndte at skifte farve. Mediet bør ændres, hvis der ønskes længere assays.
Der er udført adskillige co-kulturanalyser for at påvise nitritvækst som reaktion på faktorer , der udskilles af DP-udskillede faktorer med standard ECM-belagte vævskulturplader3,19,20,21 eller mikrofluidic chambers8,22,23. Denne protokol giver flere fordele i forhold til disse metoder. For eksempel kræver TG ganglier og DP væv co-kultur et særligt rumligt forhold for neurites at fornemme og reagere på kortrækkende paracrine signaler. Med organkultur er det kun neuriterne i ganglierne tættest på DP-vævet, der er i stand til at reagere3, mens de spredte TG-neuroner, der anvendes i denne protokol, dyrkes i samme afstand fra DP-cellerne nedenunder. For det andet kan organkulturer indføre vævnekrose på grund af mangel på ilt og næringsstoffer til rådighed i store prøver24. Co-kultur af spredte celler fjerner denne mulighed. Nogle co-kulturer, herunder neuroner kræver neuronal medier3,22 som kan spille en dominerende rolle i at fremme nitrit udvækst. Denne protokol tilføjer ikke neuron-specifikke vækstfaktorer, hvilket giver mulighed for en evaluering af den direkte sammenhæng mellem paracrine signaler fra de underliggende DP celler og nitrit udvækst reaktioner. Det er værd at bemærke, at co-kultur medierne også mangler komponenter til at fremme mineralisering, såsom beta-glycerophosphat. Dette gør det muligt for efterforskere at afgøre, hvordan neurites kan udskille signaler for at tilskynde mineralisering. Men, Det begrænser også undersøgelsen ved kun at medtage mindre differentierede DP celler uden mineralisering odontoblaster, der typisk ville være til stede in vivo.
Kolorimetriske reaktioner fra tidligere forskning7,8 ikke afgrænse Schwann celle bidrag eller demonstrere neuronal morfologi siden krystal violet ikke-specifikt pletter alle celler. Immunfluorescerende farvning af filtre kan resultere i høje baggrundsniveauer, der gør afferent billeddannelse vanskelig (Figur 2). Den nuværende protokol giver mulighed for præcis farvning af neuronale afferents ved at udnytte Thy1-YFP TG neuroner og en anti-GFP antistof og giver et signal lyse nok til at generere store billeder af vækst i hele et helt tal (Figur 3). Det er muligt at udnytte andre neuronale markører, såsom Anti-Neurofilament 200, hvis Thy1-YFP mus ikke er tilgængelige.
Endelig giver brug af primære DP-celler fra mus med gener af interesse flankeret af loxP-websteder mulighed for enkel og effektiv sletning af disse gener med et Ad-Cre-GFP-system. I fremtidige undersøgelser, Ad-Cre rekombinase system kunne anvendes på TG neuroner, hvis de har et gen af interesse flankeret af loxP sites. Dette vil lette undersøgelser af, hvordan paracrine signaler fra den neuronale population påvirker DP-celler, især hvis DP-cellerne er seedet oven på dæksedlerne (afsnit 1.1). Fremtidige undersøgelser kan udnytte andre manipulationer, såsom tilsætning af farmakologiske hæmmere og/eller vækstfaktorer. Det er også muligt at ændre denne protokol til også at omfatte migrationsundersøgelser ved hjælp af 8 μm porøsitettranswellfiltre.
Afslutningsvis, denne transwell co-kultur analyse udnytte neuroner og DP celler giver mulighed for undersøgelse af flere cellulære parametre. Dette gør det muligt at udvide kroppen af viden om mesenkymale-neuronal interaktioner, der fremmer og støtter tand innervation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af a) National Institutes of Health / NIAMS (tilskud numre R01 AR062507 og R01 AR053860 til RS), b) University of Alabama på Birmingham Dental Academic Research Training (DART) tilskud (nummer T90DE022736 (PI MacDougall)) til SBP fra National Institute of Dental og Craniofacial Research / National Institutes of Health, c) et UAB Global Center for Kraniofacial, Oral og Dental Disorders (GC-KODET) Pilot- og feasibilitytilskud til SBP og d) National Institute of Dental and Craniofacial Forsknings-/nationale sundhedsinstitutk99 DE024406-tilskud til SBP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
References
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
- Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
- Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
- de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
- Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).
- Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
- Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
- Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
- Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
- Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).
- Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
- Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, Clifton, N.J. 229-251 (2017).
- Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
- Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799 (2016).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).
- Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).
