Summary
I den här artikeln beskriver vi i detalj ett protokoll för generering av neurosfärkulturer från postnatala mus neurala stamceller som härrör från de viktigaste mus neurogena nischer. Neurosfärer används för att identifiera neurala stamceller från hjärnvävnad som gör det möjligt att uppskatta prekursorcellnummer. Dessutom kan dessa 3D-strukturer pläteras i differentiativa förhållanden, vilket ger upphov till nervceller, oligodendrocyter och astrocyter, vilket gör det möjligt att studera cellöde.
Abstract
Neurosfären analysen är en mycket användbar in vitro-teknik för att studera de inneboende egenskaperna hos neurala stamceller / stamceller (NSPCs) inklusive spridning, självförnyelse och multipotens. I den postnatala och vuxna hjärnan, NSPCs är främst närvarande i två neurogena nischer: den subventricular zonen (SVZ) foder de laterala ventriklarna och den subgranular zonen i hippocampus dentate gyrus (DG). Isoleringen av de neurogena nischerna från postnatala hjärnan gör det möjligt att få en högre mängd NSPC i kultur med en därav följande fördel av högre avkastning. Den nära kontakten mellan cellerna inom varje neurosfär skapar en mikromiljö som kan likna neurogena nischer. Här beskriver vi i detalj hur man skapar SVZ- och DG-härledda neurosfärkulturer från 1−3-dagars-gamla (P1−3) möss, samt passaging, för neurosfärexpansion. Detta är ett fördelaktigt tillvägagångssätt eftersom neurosfären analysen möjliggör en snabb generation av NSPC kloner (6−12 dagar) och bidrar till en betydande minskning av antalet djuranvändning. Genom att pläta neurospheres i differentiativa förhållanden, kan vi få en pseudomonolayer av celler som består av NSPCs och differentierade celler av olika neurala härstamningar (nervceller, astrocyter och oligodendrocyter) gör det möjligt att studera åtgärder av inneboende eller intrinsikala faktorer på NSPC spridning, differentiering, cellöverlevnad och neuritogenesis.
Introduction
Neurosfären analysen (NSA) beskrevs först i 19921,2 och är fortfarande ett unikt och kraftfullt verktyg i neurala stamceller (NSC) forskning. Isoleringen av NSC från de viktigaste neurogena regionerna har utmanande problem eftersom kraven för att upprätthålla dessa celler i fysiologiska förhållanden fortfarande dåligt förstås. I NSA odlas celler i ett kemiskt definierat serumfritt medium med förekomst av tillväxtfaktorer, inklusive epidermala tillväxtfaktorn (EGF) och den grundläggande fibroblasttillväxtfaktorn (bFGF)1,2,3. Neurala prekursorceller (stamceller och stamfader) väljs genom att använda dessa mitogener eftersom dessa celler är EGF och FGF-lyhörda in i en period av aktiv spridning medan andra celler, nämligen differentierade celler, dör4. Neurala prekursorceller växer som neurosfärer, som sedan kan passage för att ytterligare expandera poolen av dessa celler5. Viktigt, eftersom dessa neurala stamceller stamceller (NSPCs) är multipotenta de kan skilja in i de tre stora celltyperna i centrala nervsystemet (CNS): nervceller, oligodendrocyter och astrocyter5.
NSA ger en förnybar källa till odifferentierade CNS prekursorer, som kan användas för att studera flera processer inklusive NSC spridning och självförnyelse, och neuronal och glial differentiering, i både fysiologiska och sjukdom sammanhang. Dessutom, in vitro-studier kan användas för att utvärdera graden av inneboende specifikation som finns i neurala prekursorer under utveckling, samt att studera den fulla potentialen av cellerna, genom att ta bort yttre ledtrådar i samband med deras normala miljö6. Neurosfärmodellen är värdefull för att utvärdera förmodade regulatorer eftersom genom att upprätthålla cellerna i ett medium saknar serum, är de miljömässiga ledtrådar endast tillhandahålls av de omgivande cellerna6. Dessutom, i NSA, NSPCs är lätt expanderas i kultur, tätheten av celler per område är hög och den heterogena sammansättningen av neurosfärerna har vissa likheter med in vivo nischer6. Dessa väletablerade fördelar är anledningen till att denna metod har använts i stor utsträckning av många forskare.
Följande protokoll beskriver i detalj alla processer från isolering av postnatala NSPC befolkningen från de två viktigaste neurogena regionerna, den subventricular zonen (SVZ) och hippocampus dentate gyrus (GD), till expansion av dessa celler som neurospheres, samt till differentiering i nervceller, astrocyter och oligodendrocyter. Slutligen beskrivs också olika analyser för att få tillgång till stamhet och multipotensegenskaper hos SVZ- och DG-härledda NSPC.Lastly, different assays are also described to access stemness and multipotency properties of SVZ- and DG-derived NSPCs.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med Europeiska gemenskapen (86/609/EEG; 2010/63/EU; 2012/707/EU) och portugisisk (DL 113/2013) lagstiftning för skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål. Protokollet godkändes av "iMM:s institutionella djurskyddsorgan - ORBEA-iMM och den nationella behöriga myndigheten - DGAV (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária)."
1. Grundläggande installation och förberedelse av odlingsmedium
- På dissekeringsdagen bereder du lämplig mängd tillväxtmedium som motsvarar serumfritt medium (SFM) som består av Dulbeccos modifierade örnmedium [(DMEM)/F12 med L-glutamin] (Tabell över material) kompletterat med 100 U/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin (penna/strep), 1% B27, med också 10 ng/mL EGF och 5 ng/mL bFGF. Värm odlingsmediet till 37 °C i ett vattenbad.
OBS: Volymen av tillväxtmedium beror på antalet valpar, för 5 ungar förbereda ~ 100 ml (50 ml för SVZ och 50 ml för DG); Men efter att ha räknat antalet celler (steg 5.1) måste den exakta volymen justeras. - För mikrodissection av SVZ och DG, förbered kalcium- och magnesiumfri Hanks balanserade saltlösning (HBSS) dissekeringsmedium kompletterat med 100 U/mL penna/strep.
OBS: Förbered 50−100 ml dissekeringsmedium. - Ställ in ett dissektionsmikroskop och förbered de verktyg som behövs för att ta bort hjärnan (sax och små spatel) och för SVZ och GD mikrodissections (Dumont små saxar, #7 pincett, #5 pincett, #5S pincett) genom blötläggning i 70% etanol.
2. Skörd av postnatala (P1−3) mushjärnor och SVZ/DG-mikrodissections
- Förbered 60 mm petriskålar (tillväxtområde 21 cm2) med HBSS kompletterat med penna/strep och 2 provrör (en för SVZ och en för GD) med 500 μl kompletterad HBSS vardera.
- Avliva möss (P1−3) enligt det protokoll som godkänts av anläggningen/riktlinjerna för institutionsdjurvård. Utför halshuggning med ett enda snitt med vass sax vid basen av hjärnstammen.
- Hålla den ventrala delen av kroppen vid basen av huvudet och med hjälp av små spetsiga sax, gör ett mittbenssnitt i huden över hela längden av huvudet, vilket avslöjar ytan av skallen.
- Gör ett längsgående snitt vid skallbasen och fortsätt skära längs sagittalsuturen med liten sax med en vinkel grunt som möjligt för att undvika att skada hjärnstrukturerna.
- Skala skallen åt sidorna med böjda pincett och exponera hjärnan.
VARNING: Se till att dissekeringsinstrumenten är fria från etanol innan du vidrör hjärnan. - Isolera hjärnan från skallen med hjälp av en liten spatel, genom att glida under basen av hjärnan för att skära kranialnerverna och blodkärlen som är anslutna till hjärnans bas, och överföra hjärnan till en petriskål som innehåller kallkedjerad HBSS-lösning.
- Placera petriskålen som innehåller hjärnan under ett dissekerande mikroskop vid låg förstoring och placera hjärnan på dess dorsala yta.
- Med hjälp av fina pincett, ta bort hjärnhinnorna från den ventrala sidan av hjärnan och luktlampor, medan du håller hjärnan på plats av lillhjärnan. Rotera hjärnan på den ventrala aspekten och skala av resten av hjärnhinnorna.
OBS: Ta bort dorsala meninges är ett avgörande steg för att säkerställa korrekt hjärns skivning. - Kasta lillhjärnan gör ett snitt med pincett. Placera ett filterpapper med en porstorlek på 11 μm på en vävnadshelikopter (Table of Materials) och ställ in hjärnan på filterpapperet med böjda pincett. Hacka hjärnan i 450 μm koronalsektioner och använd en våt lamina för att samla in den sektionerade hjärnan i en ny petriskål fylld med kall kompletterad HBSS.
- För att dissekera SVZ, använd pincett för att separera koronala skivor på ett främre till bakre sätt tills du når skivor med de laterala ventriklarna, under ett dissekerande mikroskop.
- Skär det tunna lagret av vävnad som omger den laterala väggen i ventriklarna (vilket motsvarar SVZ) med fina pincett, exklusive striatal parenkym och corpus callosum. Isolera SVZ genom att placera spetsen av pincett i de laterala hörnen av den laterala ventrikeln: en omedelbart under corpus callosum och den andra i vävnaden omedelbart intill ventrala området i den laterala ventrikeln. Skär sedan en liten linje av vävnad som omger den laterala ventrikeln.
- Samla upp den dissekerade vävnaden i ett provrör med en komplett HBSS-lösning som tidigare identifierats som SVZ.
OBS: Uteslut SVZ i skivor där både de laterala ventriklarna och hippocampus bildandet börjar dyka upp. - Gå igenom alla skivor efter SVZ microdissection i en främre-till-bakre sätt och nå hippocampus bildandet. Använda pincett kasta den första biten med hippocampus där GD är fortfarande oigenkännlig.
- För att ta bort DG, först isolera hippocampus från skivorna. Fokusera om mikroskopet för att visualisera kantlinjerna runt GD.
- Dissekera GD-delen genom att utföra ett snitt mellan GD och CA1-regionen följt av ett vertikalt snitt mellan DG- och CA3-regionen med hjälp av pincett. Ta bort fimbria och eventuell intilliggande vävnad.
OBS: I P1−3-djur är GD nästan odämjbart från Ammons horn men visar en liten spets. - Samla upp den dissekerade vävnaden i ett provrör som innehåller kompletterade HBSS-lösningar som tidigare identifierats som GD.
OBS: Övergripande skada på hippocampus eller omgivande område kommer att göra det svårare att isolera DG. Använda en atlas av postnatala mus hjärnan är viktigt när användaren inte är bekant med isolering av SVZ och GD vävnad från koronal sektioner.
3. Vävnadsdissociation
- Om du vill separera SVZ- och DG-vävnaden i deras respektive rör, tillsätt trypsin-EDTA 0,05 % för att ha en slutlig koncentration på 5−10% av Trypsin-EDTA 0,05% i HBSS. Inkubera i ca 15 min vid 37 °C, tills vävnaden klumpas ihop.
- Tvätta vävnaden från trypsin genom att ta bort mediet och lägga till 1 ml ny HBSS kompletterad lösning för 4 gånger i följd.
- Ta bort HBSS och återsuspend den smälta vävnaden i 1 ml SFM kompletteras med 10 ng/mL EGF och 5 ng/mL bFGF. Ta bort pelleten mekaniskt genom att försiktigt pipetting upp och ner ca 7−10x med en P1000 pipett, tills du får en homogen celllösning.
VARNING: Överdriven mekanisk dissociation kan leda till ökad celldöd och kommer att påverka efterföljande celltillväxt negativt.
4. Cell-par analys för att studera cell öde
- Före experimentet, förbereda belagda 24-brunnsplattor för vidhäftande monolagerkulturer enligt avsnitten 8-10.
- Om du vill räkna antalet SVZ- eller DG-celler (erhållna i avsnitt 3) som ska pläteras, använd en lösning som innehåller 0,2 % Trypanblå och räkna cellerna med hjälp av en hematocytometer.
- Späd den dissocierade cellsuspensionen i SFM kompletterad med 5 ng/ml EGF och 2,5 ng/mL bFGF (låg EGF/bFGF) vid en densitet på 11 300 celler/cm2 och plattan dem på belagda glasöverdrag.
- Efter 24 h, fixa cellerna för immuncytokemi mot NSC markörer såsom kön bestämma region Y-box 2 (Sox2) och nestin samt med en markör för neuronal härstamning (nämligen doublecortin [DCX], för omogna nervceller) (se avsnitt 14).
OBS: Sox2 är en markör för NSC som genomgår mitos. Sox2+/+ cellpar till följd av en enda stamcellsdelning återspeglar stamcellsexpansion7.
5. Expansion av postnatala neurala stamceller som neurosfärer
- För att bestämma densiteten hos den dissocierade SVZ- eller DG-cellsfjädringen (erhålls i avsnitt 3), räkna cellerna med hjälp av en hematocytometer.
- Späd SVZ och DG single cell suspension vid en densitet av 2 x 104 celler/ml i SFM kompletteras med 10 ng/mL EGF och 5 ng/mL bFGF. Frö SVZ och DG-celler i obestrukna 60 mm petriskålar med en slutvolym på 5 ml/petriskål.
- Inkubera SVZ- och DG-celler i 6−8 dagar respektive 10−12 dagar för att bilda primära neurosfärer vid 37 °C med 5 % CO2.
OBS: Inkubation dagar mer än de som nämns kan främja aggregering av neurospheres och högre nivåer av celldöd i mitten av neurosfären. - När majoriteten av neurosfärerna har en diameter på 150−200 μm, utför neurosfärpassagen.
OBS: Passaging neurospheres när de inte har en lämplig diameter äventyrar alla nästa steg.
6. Passaging av neurosfärer
OBS: Följande protokoll kan användas för att expandera både SVZ och GD neurosfärer.
- För att passera neurospheres, samla SFM med tillväxtfaktorer som innehåller neurospheres från 60 mm Petri skålen (es) och centrifug i 5 min vid 300 x g.
- Kasta supernatanten och återsuspend neurosfärpellet med hjälp av en kemisk dissociation kit (mus) enligt tillverkarens anvisningar (Tabell över material).
OBS: Observera inkubationstiderna precis som de är avgörande för prestanda. - Centrifugera i 5 min vid 300 x g,ta bort supernatanten och tillsätt 1 ml SFM kompletterat med 10 ng/mL EGF och 5 ng/mL bFGF.
- Triturate upp och ner ca 10x med en P1000 pipett för att separera neurosfärer.
- Räkna antalet celler med en lösning som innehåller 0,2% Trypan blå och en hematocytometer.
- Reseed celler med en densitet av 2 x 104 celler/ml i obestrukna 60 mm petriskålar.
- Inkubera SVZ- och DG-celler i 6−8 dagar respektive 10−12 dagar för att erhålla sekundära neurosfärer vid 37 °C med 5 % CO2.
OBS: Självförnyelsekapaciteten hos SVZ- och DG-härledda NSPC kan nås genom följande protokollavsnitt 5 och 6. För detta, utsäde SVZ och DG celler med en densitet av 1,0 x 104 celler /ml (i obestrukna 24-brunnsplattor) i tillväxt SFM medium som innehåller 5 ng/mL EGF och 2,5 ng/mL bFGF (låg EGF/bFGF). Räkna antalet resulterande primära och sekundära neurospheres.
7. Lagring av neurosfärer
- Samla upp mediumet som innehåller neurosfärer (erhållna från steg 5.3 och 6.7) från 60 mm petriskålar.
- Centrifugera i 5 min vid 300 x g och kasta supernatanten.
- Tvätta cellerna 2x med 1 ml HBSS (5 min vid 300 x g).
- Centrifugera i 5 min vid 300 x g,kasta supernatanten och förvara pelleten av neurosfärer vid -20 °C för molekylärbiologisk analys.
8. PDL beläggningsplatta förfarande
- För att förbereda lösning 1 (0,1 M boratbuffert), väg 3,92 g borsyra och späd i 400 ml hög renhetsvatten. Justera pH-värdet till 8,2 och förs till 500 ml med högt renhetsvatten.
- För att förbereda lösning 2 (0,167 M boratbuffert), väg 10,3 g borsyra och späd i 900 ml hög renhetsvatten. Justera pH-värdet till 8,2 och gör upp till 1 000 ml med högt renhetsvatten.
- För att rekonstruera poli-D-lysin (PDL) (1 mg/ml i 0,1 M boratbuffert), späd 100 mg PDL i 100 ml lösning 1.
- Gör alikvoter på 10 ml för att omedelbart använda eller frysa och förvara vid -20 °C.
- Under laminärt flöde, tillsätt 1 coverslip per brunn och sterilisera under UV-ljus i 15 min.
- Använd den rekonstituerade PDL eller tina frysta rekonstituerade PDL.
- Förbered den slutliga lösningen på 100 μg/ml PDL i 0,167 M boratbuffert genom att tillsätta 10 ml rekonstituerad PDL till 90 ml lösning 2.
- Lägg till den slutliga lösningen i brunnar i minst 2 timmar till över natten vid 37 °C.
OBS: För 24-brunnsplattor, tillsätt en volym på 500 μL i varje brunn. - Ta bort lösningen och tvätta 3x med högt renhetsvatten.
- Låt täcken torka i den laminära flödeshuven.
- Lämna flerbrunnsodlingsplattorna vid 4 °C.
9. PDL/Laminin beläggningsplatta förfarande
- På dag 1, täck plattorna med PDL enligt beskrivningen i avsnitt 8.
- Ta bort PDL-lösningen dag 2 och tvätta 3x med högt renhetsvatten. Låt torka.
- Förbered 5 μg/ml laminin i kallt SFM utan tillväxtfaktorer.
- Tillsätt upplöst laminin i täcken och inkubera vid 37 °C över natten.
OBS: För 24-brunnsplattor, tillsätt en volym på 500 μL i varje brunn. - Ta bort laminin med hjälp av en pipett.
OBS: Tvätta inte täcken från laminin. - Använd omedelbart eller förvara på -20 °C.
10. Poly-L-ornitin (PLO) /lamininbeläggningsprocedur
- Under det laminära flödet, tillsätt en coverslip per brunn och sterilisera under UV-ljus i 15 min.
- Tillsätt 0,01% PLO-lösning till varje brunn i 20 min vid rumstemperatur (RT).
OBS: För 24-brunnsplattor, tillsätt en volym på 500 μL i varje brunn. - Ta bort lösningen och tvätta 3x med steriliserad 1x PBS. Låt torka.
- Förbered 5 μg/mL laminin i steril 1x PBS.
- Inkubera i 2 timmar vid 37 °C.
- Ta bort laminin.
OBS: Tvätta inte täcken från laminin. - Använd omedelbart.
OBS: Se till att täcken är helt täckt av PLO-lösningen genom att försiktigt knacka på täcket med en pipettspets. När de skakas ska multibrunnarna inte ljuda.
11. Utvärdering av neuritogenes genom att generera en differentierad monolayer av cell
- Samla in media som innehåller neurosfärer från 60 mm petriskålar (från avsnitt 5) och centrifug i 5 min vid 300 x g vid RT.
- Kasta supernatanten och separera pelleten av neurosfärer i 1 ml dissociation PBS (dvs. PBS utan Mg2+/Ca2+ och med EDTA [2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4 och 0,5 mM EDTA 4Na, vid pH = 7,40]) genom inkubering i 15 min följt av mekanisk dissociation. Alternativt kan du separera neurosfärer med hjälp av ett kemiskt dissociationssats (mus) (Tabell över material).
- Centrifugera i 5 min vid 300 x g vid RT och kassera supernatanten.
- Resuspend cellen pellet i 1 ml SFM saknar tillväxtfaktorer.
- Bestäm celldensitet med hjälp av en hematocytometer.
- Späd den separerade cellupphängningen i SFM som saknar tillväxtfaktorer vid en densitet av 3 766 celler/cm2 och plåtceller på belagda glasöverdrag i 24-brunnsplattor.
- Efter 1−3 dagar fixar du celler för immuncytokemi mot ett protein i cytoskelettet (se avsnitt 14).
12. Differentiering av neurosfärkulturer
OBS: Neurosfärer som erhålls från cellexpansion, antingen från primära eller passagede neurosfärer (erhålls i avsnitt 5 eller 6) kan differentieras till celler från olika neurala härstamningar.
- När neurosfärerna har en diameter på 150−200 μm, samla 25 μL neurosfärfjädringsmedium och tallrik på belagda glasöverdrag, i 24-brunnsplattor.
OBS: För att samla in fler neurosfärer, rotera försiktigt petriskålen för att koncentrera neurosfärerna i mitten. Sedan, pipett från mitten. - Sätt plattorna i en inkubator vid 37 °C i 15 min så att neurosfärerna följer substratet. Därefter, tillsätt 500 μL SFM saknar tillväxtfaktorer (differentieringsförhållanden).
- Efter 24 h, ersätta mediet med färska SFM saknar tillväxtfaktorer.
- Differentiera för olika tidpunkter (t.ex. 2 respektive 7 dagar in vitro, DIV2 respektive DIV7) med 5 % CO2 respektive 95 % atmosfärisk luft vid 37 °C.
OBS: Cellöverlevnad, spridning och differentiering kan analyseras med hjälp av olika cellanalyser.
13. Cellbiologiska analyser
- Analys av cellöverlevnad
- Exponera pläterade neurosfärer till 3 μg/mL propidium jodid (PI) i 30 min före cellfixering i inkubatorn vid 37 °C.
OBS: PI är ett autofluorescent medel som bara kan komma in celler med komprometterade membran integritet8. Andra metoder för att analysera cellöverlevnad kan användas såsom caspase 3 färgning eller terminalen deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) analys.
- Exponera pläterade neurosfärer till 3 μg/mL propidium jodid (PI) i 30 min före cellfixering i inkubatorn vid 37 °C.
- Cell spridning analys
- Exponera pläterade neurosfärer till 10 μM 5-bromo-2'-deoxyuridin (BrdU) i 4 timmar före fixering i inkubatorn vid 37 °C.
OBS: BrdU är en syntetisk tymidinanalog som kan införlivas under DNA-syntes i prolifererande celler9.
- Exponera pläterade neurosfärer till 10 μM 5-bromo-2'-deoxyuridin (BrdU) i 4 timmar före fixering i inkubatorn vid 37 °C.
- Analys av celldifferentiering
- Exponera 7 dagar gamla pläterade neurosfärer till 10 μM BrdU under de första 24 h, i inkubatorn vid 37 °C.
- Förnya SFM saknar tillväxtfaktorer (differentiering villkor) och tillåta celler att utvecklas i avsaknad av BrdU för de följande 6 dagarna fram till fixering.
OBS: Dessa pulsjakt experiment, genom sammärkning med markörer för mogna neurala celler, tillåta utvärdering av stamcellsceller som skiljer sig till mogna celler under protokollet.
14. Immunfärgning av neurosfärkulturer
- Cellfixering
- Förbered 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS och förvara vid 4 °C eller -20 °C.
- Ta bort SFM saknar tillväxtfaktorer från brunnar och tillsätt, till varje brunn, 500 μL 4% PFA vid 4 °C i 20 min vid RT.
- Tvätta 3x med 1x PBS, i 5 min varje gång, täcken som innehåller differentierade neurosfärer.
- Förvara täcken tills de används i 500 μl 1x PBS vid 4 °C.
OBS: Om experimentet inte har BrdU, hoppa till steg 14.3.
- Denaturation metod (endast för BrdU-experiment)
- Förbered 1 M HCl vid 37 °C.
- Skölj täcken 3x i 1x PBS.
- Permeabilisera celler i 30 min i PBS som innehåller 1% nonioniskt ytaktivt företag (t.ex. Triton X-100).
- Denature dsDNA med 1 M HCl förvärmd till 37 °C i 30−40 min vid 37 °C (~300 μL/brunn).
- Tvätta brunnarna 4x med 1x PBS.
- Permeabilisering och blockering
- Skölj täcken i 1x PBS i 5 min.
- Inkubera för 1,5 timmar med 0,5% nonioniskt ytaktivt och 3% bovin serum albumin (BSA) i 1x PBS (~300 μL/well).
OBS: För NeuN, använd 6% BSA i 1x PBS.
- Inkubation och montering
- Dag 1, utan tvättning, inkubera celler med primära antikroppar(Table of Materials) i 0,1% nonionic ytaktivt och 0,3% BSA i 1x PBS i inkubationskammaren (för 24-brunnsplattor använd 20 μL/brunn). Lämna täckslipar som ruvar över natten vid 4 °C ljusskyddad om antikropparkonjugeras till en fluorofore.
- Dag 2, returnera täcken till sina respektive brunnar och skölj 3x i 1x PBS i 5 min.
- Motfrågning med lämpliga fluorescenskonjugerade sekundära antikroppar (utspädning 1:200) och med 12 μg/ml Hoechst 33342 i 1x PBS för 2 h vid RT och ljusskyddad i inkubationskammaren (20 μL/täckslip).
- Tvätta täcken 3x i 1x PBS i 5 min.
- Montera täcken på mikroskoprutschbanor med 5 μL/coverslip av fluorescensmonteringsmedium.
- Låt täcken lufttorka vid RT, skyddad från ljus, i 1 dag.
- Mikroskopi
- Visa och hämta bilder med hjälp av ett fluorescensmikroskop.
- Använd tre replikerar för varje villkor. Utför cellantal i fem oberoende mikroskopiska fält i varje täckslip med ett 40x-mål (~100 celler per fält).
15. Beredning av fonden och bFGF-stamlösningar
- EGF lager lösning
- För att rekonstruera lyofilierad EGF, späd ut produkten i hög renhetsvatten för att nå en slutlig koncentration på 20 μg/ml.
- Aliquot och förvara i mikrorör vid -5 till -20 °C.
- bFGF lager lösning
OBS: bFGF måste rekonstitueras med en lösning på 10 mM Tris, pH 7.6.- Centrifugera injektionsflaskan en kort stund innan du öppnar för att få innehållet till botten.
- Förbered 50 ml 10 mM Tris, pH 7.6. För detta, väg 60,57 mg Tris ((HOCH2)3CNH2) och späd den i 40 ml hög renhetsvatten. Justera pH-värdet till 7,6 och förs till 50 ml med högt renhetsvatten.
- Förbered 10 ml 0,1% BSA i 10 mM Tris, pH 7.6. För det, väg 10 mg BSA och späd den i 10 ml 10 mM Tris.
- Filterlösningar beredda i steg 15.2.2 och 15.2.3 med ett 0,22 μm filter under en laminär flödeshuva.
- Rekonstruera 10 μg bFGF i 1 000 μL 0,1% BSA i 10 mM Tris med pH 7.6 för att nå en slutlig koncentration på 10 μg/ml. Alikvot till mikrorör vid -20 °C i högst 6 månader.
Representative Results
SVZ och GD Neurosfärer, som erhålls med hjälp av NSA, består av odifferentierade celler, positiva för Sox2, en transkriptionsfaktor som är involverad i självförnyelsekapaciteten och positiv för nestin, ett mellanliggande glödtrådsprotein uttryckt i NSPC(figur 1A). Dessutom har SVZ-härledda neurosfärer större dimensioner än sina motsvarigheter i GD (figur 1A). Viktigt, i differentiative förhållanden, SVZ- och GD-härledda NSPCs migrera ut ur neurosfärer bildar en pseudomonolayer av celler (figur 1B).
För att komma åt självförnyelsekapaciteten utförs cellparanalysen baserat på uttrycket av Sox2 och nestin som tenderar att försvinna i att dela celler som startar differentieringen med en kombination av en markör för neuronal härstamning nämligen DCX. I båda neurogena regioner det är möjligt att observera förekomsten av Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetriska indelningar (självförnyelse) (figur 2A1, B1), Sox2-/+/nestin-/+/DCX+/- asymmetriska indelningar (figur 2A1, B2) och Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ symmetriska indelningar (differentiering) (figur 2A2,B1).
Passaging de neurospheres ökar avkastningen av NSPCs; celldöd vid DIV2 ändras dock med passaging. I själva verket ökas andelen PI-positiva celler med cellpassering i SVZ (P0: 15,6 % ± 1,2 % jämfört med P1: 19,2 % ± 2,7 % jämfört med P2: 32,35 % ± 0,14 % jämfört med P3: 39,6 % ± 4,0 %) och i GD (P0: 16,31 % ± 0,95 % jämfört med P1: 32,1 % ± 1,7 % jämfört med P2: 27,42 % jämfört med P3: 32,2 % ± 3,1 %) (Figur 3).
Neuritogenesis kan utvärderas i nervceller som erhållits från differentiering av SVZ och DG NSPCs i början av differentiering: DIV1(Figur 4A, D),DIV2(Figur 4B, E) och DIV3 ( Figur4C, F). I själva verket, som observerats i figur 4, ökar längden och förgreningen av neuriterna med differentiering.
Cellproliferation kan utvärderas i SVZ- och DG-härledda neurosfärer. Om man jämför primärdifferentierade neurosfärer vid DIV1 från SVZ (figur 5A1) och GD (figur 5A2) är andelen BrdU-positiva celler högre i SVZ än i GD (SVZ: 6,15 % ± 0,64 % jämfört med GD: 3,27 % ± 0,13 %; p < 0,05; n = 4; Bild 5A3). Dessutom kan celldifferentiering också nås genom att kombinera BrdU-färgning med en mogen tillverkare som neuronala kärnor (NeuN) som identifierar mogna nervceller (Figur 5B1,B2). Figur 5B3 visar att andelen prolifererande stamfader som skiljer sig till mogna nervceller är likartad i SVZ och GD (SVZ: 12,04 % ± 1,58 % jämfört med GD: 13,56 % ± 0,48 %; p > 0,05; n = 4).
Stammen och multipotensen hos SVZ- och DG-härledda NSPC kan nås med hjälp av NSA genom att utvärdera uttrycket av olika markörer vid olika differentieringsdagar (DIV2 och DIV7). I själva verket är NSCs (nestin- och glia fibrillary sura protein [GFAP]-dubbel-positiva celler) närvarande i båda neurogena regioner(Figur 6A, G). Dessa celler kan differentiera till omogna nervceller (DCX-positiva celler) (figur 6B,H), mogna nervceller (NeuN-positiva celler) (Figur 6F,L), oligodendrocyte prekursorceller (neuron-glia antigen 2 [NG2] och trombocyt-de härledd tillväxtfaktorreceptor α [PDGFRα]- positiva celler) ( figur6C,I), mogna oligodendrocyter (myelin grundläggande protein [MBP]-positiva celler) (figur 6E,K) och astrocyter (GFAP-positiva celler) (figur 6D,J).
Olika substrat kan användas för att belägga täcken för att bilda pseudomonolayer av celler under olika förhållanden. Som framgår av tilläggs figur 1migrerar GD-celler mer när täcken har extra beläggning med laminin kombinerat med PLO eller PDL än med enbart PDL(tilläggs figur 1B−H). Faktum är att när PDL och laminin används tillsammans som substrat(Tilläggs figur 1C,G), bildar GD-celler en mer flytande pseudomonolayer än SVZ-celler för vilka PDL används ensamt (tilläggsfigur 1A,E).
Viktigt, dessa resultat visar potentialen hos NSA att utvärdera stamhet och multipotens egenskaper NSCs härrör från de två viktigaste neurogena nischer.
Figur 1: Subventricular zon och dentate gyrus härledda NSPC odlade som neurosfärer eller som pseudomonolayers. a) Representativa ljusfält(A1,A3)och fluorescens(A2,A4)bilder av SVZ- och DG-härledda neurosfärer, där kärnor har färgats med Hoechst 33342 (blå) och NSCs för Sox2 (grön) och nestin (röd). b)Representativa ljusfältsbilder av pseudomonolayers som genereras från SVZ- och DG-härledda neurosfärer under olika förhållanden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Cellparanalysen. Representativa fluorescensbilder av cellpar som härrör från en stamcellsdelning. SVZ och DG-kärnor färgades med Hoechst 33342 (blå), stamcellerliknande celler för Sox2 (röd) och nestin (vit) samt omogna nervceller med DCX (grön). Pilspetsar i panelerna A1 och B1 anger Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/- symmetriska självförnyande indelningar, pilar i panelerna A1 och B2 indikerar Sox2+/-/nestin+/-/DCX-/+ asymmetriska indelningar, streckade linjepilar i panelerna A2 och B1 visar Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+ symmetriska differentieringsdivisioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Cellöverlevnadsanalys med cellpassering. Kvantitativ analys av PI-positiva celler vid DIV2 i SVZ- och DG-härledd differentierad neurosfärkultur, efter 0, 1, 2 och 3 passager (P0−P3). Data uttrycks som medelvärde ± SEM, n = 1−8. PI = propidium jodid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Neuritogenesanalys vid DIV 1, 2 och 3. Representativa konfokalfluorescensbilder av neuriter, identifierade med βIII-tubulinsignalen, i SVZ- och DG-nervceller vid(A,D)DIV1, (B,E) DIV2 och (C,F) DIV3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Cellspridningsanalys. Representativa konfokala bilder av BrdU-positiva celler vid DIV1 i (A1) SVZ och (A2) GD. (A3) Kvantitativ analys av BrdU-positiva celler vid DIV1 i GD- och SVZ-härledda differentierade neurosfärkultur. Uppgifterna uttrycks som medelvärde ± SEM, n = 4. * p < 0,05 av t-test. Representativa fluorescensbilder av BrdU- och NeuN-positiva celler vid DIV7 i(B1)SVZ och (B2) GD. Pilspetsar anger BrdU-/NeuN-positiva celler. (B3) Kvantitativ analys av BrdU-/NeuN-positiva celler vid DIV7 i båda nischerna. Uppgifterna uttrycks som medelvärde ± SEM, n = 4. BrdU: 5-bromo-2'-deoxyuridin, syntetisk tymidin analog. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Neurala celltyper som finns i SVZ- och DG-härledda differentierade neurosfärkultur. Representativa fluorescensbilder av SVZ- och DG-härledda celltyper efter 2 och 7 dagars neurosfärdifferentiering (DIV2 och DIV7), där cellkärnor färgades med Hoechst 33342 (blå) och:(A,G)NSCs för GFAP (grön) och nestin (röd), (B,H) omogen neuron för DCX (grön), (C,I) oligodendrocyte prekursorceller för PDGFRα (grön) och NG2 (röd), (D,J) astrocyter för GFAP (grön), (E, K) mogna oligodendrocyter för MBP (grön), och (F,L) mogna nervceller för NeuN (röd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggs figur 1: Testa olika substrat för neurosfärens följsamhet och migration för att bilda en pseudomonolayer. Representativa fluorescensbilder av(A,E)SVZ-härledda pseudomonolayer med poly-D-lysin som substrat.(B,F)GD-härledd pseudomonolayer med poly-D-lysin som substrat, (C,G) GD-härledda pseudomonolayer med poly-D-lysin med laminin som substrat, och (D,H) GD-härledda pseudomonolayer med poly-D-lysin med poly-L-ornitin som substrat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
In vitro-system för NSPC möjliggör en bättre förståelse av de cellulära och molekylära mekanismerna, som kan valideras ytterligare in vivo. NSA är en mycket kraftfull metod för att efterlikna fysiologiska tillstånd på grund av deras tredimensionella struktur. Dessutom är detta kultursystem också tekniskt lättare att odla10, jämfört med andra in vitro-system som monolayer kultursystemet. Faktum är att med NSA, är det lätt att kontrollera de exponerade intrinsikalt signaler under cellutveckling, antingen under expansionen eller differentieringsfasen, genom att lägga till exakta och varierande mängder av faktorer av intresse för media samt genom att odling av neurosfärer med andra celltyper6. Jämfört med monolayerkulturer är det dessutom möjligt att få en högre celltäthet från en liten mängd vävnad eller med ett litet antal celler, vilket gör det möjligt att utföra parallella studier, vilket minskar antalet djur1.
NSA är den vanligaste metoden för att isolera och expandera NSCs11,12,13, kan användas för att uppskatta antalet prekursorceller som finns i ett visst vävnadsprov5 och prekursorcellfrekvensen mellan olika förhållanden. Men både neurospheres och monolayer kulturer tar inte hänsyn till quiescence NSCs14. Dessutom har NSA vissa begränsningar11,12,13 och den resulterande neurosfären frekvens beror på många faktorer, inklusive de medelstora komponenterna, dissekering förfarandet, dissociation processen11,12,13, och neurosfär aggregering5. I en hög densitet kultur, neurospheres tenderar att aggregera. Därför måste försiktighet iakttas vid uppskattning av antalet prekursorceller i ett prov. För att övervinna ovanstående begränsningar kan isolerade NSPC också utökas och passage i en monolayer5,15. Viktigt, att använda NSA för att jämföra prekursor cellfrekvens mellan olika villkor är mycket användbart och korrekt eftersom alla dessa begränsningar är implicita och liknande bland alla villkor som utförs i samma experiment.
Det finns kritiska steg i neurosfärkulturen som behöver uppmärksammas. I hjärnan skörd steg, fullständigt avlägsnande av hjärnhinnor och god isolering av neurogena nischer är viktiga för att maximera renhet och avkastning av NSPCs. Under vävnad dissociation, på grund av proteolytisk aktivitet av trypsin, överdriven användning av trypsin eller längre inkubationstider kan leda till celllys. Dessutom är dagen för passagen avgörande för att få en frisk population av neurosfärer. Passaging neurospheres med en diameter högre än 200 μm påverkar kraftigt livskraft, proliferative och differentiative kapacitet NSPCs. Viktigt, längre cykler av passager, mer än 10 kan öka genetisk instabilitet6. Dessutom är beläggning med PDL och PLD/laminin för SVZ respektive DG-celler avgörande för att säkerställa god cellmigration ut ur neurosfärerna utan att kompromissa med differentieringen. När det gäller immunocytokemi analys, längre inkubationstider med PFA kan äventyra färgning genom att maskera antigener och öka bakgrunden.
NSA är ett kraftfullt verktyg för att tillhandahålla en konsekvent och obegränsad källa till NSPCs för in vitro-studier av neural utveckling och differentiering samt för terapeutiska ändamål16,17. Faktum är att denna analys kan tillämpas på genetiska och beteendemässiga modeller för att ytterligare förstå de molekylära och cellulära mekanismer som är involverade i NSPC spridning och differentiering18,19. Denna analys är också användbart för att testa olika läkemedel och föreningar20,21,22 samt att utföra genetiska manipulationer19,23 att modulera NSC egenskaper. Förutom immunocytokemi kan omvänd transkriptionspolylasked reaktion och western blot-analys utföras för att komma åt RNA och proteinuttryck, medan elektrofysiologiska studier och kalciumavbildning kan användas för att utvärdera funktionen hos de nyfödda nervcellerna21.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av IF/01227/2015 och UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) através de Fundos do Orçamento de Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) och R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) fick ett stipendium från FCT. Författarna vill tacka medlemmarna i bioimaging anläggningen vid Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes för mikroskopi hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| 12mm Glass coverslips | VWR | 631-1577 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 5-bromo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | B9285-1G | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira & Cª (Irmão) Sucrs, Lda | UN1170 | |
| Adhesion slides, Menzel Gläser, SuperFrost Plus | VWR | 631-9483 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L) | Life Technologies | A11039 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A21206 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L) | Life Technologies | A21208 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A10037 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A10042 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A21235 | |
| Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine | Dako | M0744 | |
| Anti-CD140a (PDGFRα) (rat) | BD Biosciences | 558774 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit) | Merck Milipore | AB5320 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Doublecortin (rabbit) | Abcam | ab18723 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Doublecortin (chicken) | Synaptic Systems | 326006 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit) | Sigma-Aldrich | G9269-.2ML | Dilute at a ratio 1:1000. |
| Anti-Myelin Basic Protein (rabbit) | Cell Signalling Technology | 78896S | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Nestin (mouse) | Merck Milipore | MAB353 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Neuronal Nuclei (mouse) | Merck Milipore | MAB377 | Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400. |
| Anti-SOX2 (rabbit) | Abcam | ab97959 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Tubulin β3 (rabbit) | BioLegend | 802001 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Axiovert 200 wide field microscope | ZEISS | ||
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher | 17504044 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-500g | |
| Bovine Serum Albumin | NZYTech | MB04602 | |
| Cell counting chamber, Neubauer | Hirschmann | 8100104 | |
| Cell culture CO2 incubator | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate | Corning | CLS3524-100EA | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31331028 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
| Dumont #5S Forceps | FST | 11252-00 | |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11272-30 | |
| Epidermal growth factor | ThermoFisher | 53003018 | |
| Fibroblast growth factor | ThermoFisher | 13256029 | |
| Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
| Fine Scissors - Sharp | FST | 14060-09 | |
| Gillete Platinum 5 blades | Gillette | ||
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 1399 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 (1L) | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | ESCO | 2012-65727 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| McILWAIN Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 450 μm |
| Micro Spatula - 12 cm | FST | 10091-12 | |
| Micro tube 0.5 mL | SARSTEDT | 72.699 | |
| Micro tube 1.5 mL | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL | SARSTEDT | 72.691 | |
| NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse) | Stem Cell | 5707 | |
| Olympus microscope SZ51 | Olympus | SZ51 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR | 28794.295 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Petri dishes 60 mm | Corning | 430166 | |
| Phosphate standard solutions, PO43 - in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Poly-D-Lysine 100mg | Sigma-Aldrich | P7886 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | |
| Sodium chloride | VWR | 27800.360.5K | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| VWR INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 |
References
- Reynolds, B., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), e2393 (2010).
- Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).
- Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural Stem Cell Isolation and Characterization. Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).
- Xapelli, S., et al. Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures. PLoS ONE. 8 (5), e63529 (2013).
- Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).
- Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population. Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).
- Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures. RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. Journal of Visualized Experiments. (47), e2457 (2011).
- Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells. Journal of Visualized Experiments. (49), e2639 (2011).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
- Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities? Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain. SpringerPlus. 3 (1), 161 (2014).
- Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).
- Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage. PLoS ONE. 12 (6), e0178978 (2017).
- Khacho, M., et al. Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program. Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).
- Soares, R., et al. Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats. Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).
- Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebastião, A. M., Xapelli, S. Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis. Frontiers in Pharmacology. 8, 516 (2017).
- Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin? Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).
- Kim, H. J., et al. Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells. Scientific Reports. 5 (1), 15962 (2015).
