Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Isolering och expansion av neurosfärer från Postnatala (P1−3) Mus neurogena nischer
Chapters
Summary May 23rd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
I den här artikeln beskriver vi i detalj ett protokoll för generering av neurosfärkulturer från postnatala mus neurala stamceller som härrör från de viktigaste mus neurogena nischer. Neurosfärer används för att identifiera neurala stamceller från hjärnvävnad som gör det möjligt att uppskatta prekursorcellnummer. Dessutom kan dessa 3D-strukturer pläteras i differentiativa förhållanden, vilket ger upphov till nervceller, oligodendrocyter och astrocyter, vilket gör det möjligt att studera cellöde.
Transcript
Neurosfären assay är användbar in vitro-teknik för att studera de inneboende egenskaperna hos neurala stam/progenitor celler inklusive proliferation, självförnyelse och multipotens i både fysiologiska och patologiska sammanhang. På grund av dess tredimensionella struktur, denna teknik är ett kraftfullt verktyg för att studera vuxna neurogenes. Det är också användbart för odling och erhålla högre avkastning av neurala stam /progenitor celler.
Denna neurosfäranalys kan appliceras på studien av hjärnsjukdomar som Alzheimers och Parkinsons sjukdomar eller multipel skleros. Neurosfärer kan också erhållas från andra hjärnregioner eller system, såsom fettvävnad eller tarmen. Demonstrera förfarandet med Filipa Ribeiro kommer att Rita Soares, en doktorand i min grupp.
För att skörda postnatal dag ett till tre mus hjärnor, håll den ventrala delen av kroppen vid basen av huvudet och använda små spetsiga saxar för att göra en mittlinjen snitt i huden över hela längden av huvudet för att exponera skallen. Gör ett längsgående snitt vid skallbasen och fortsätt skära längs den sagittala suturen i en grund vinkel som möjligt för att undvika att skada hjärnstrukturerna. Använd böjda tärna för att skala skallen till sidorna för att exponera hjärnan och skjut en liten spatel under hjärnan för att skära kranialnerven och blodkärl som är anslutna till basen av hjärnan.
Placera hjärnan i en petriskål av kall HBSS kompletterad med antibiotika och placera skålen under ett dissekerande mikroskop vid låg förstoring. Placera hjärnan på dess ryggyta. Medan du håller hjärnan vid lillhjärnan, använd fina tång för att ta bort hjärnhinnor från den ventrala sidan av hjärnan och luktlökar.
Rotera hjärnan på den ventrala aspekten och skala av resten av hjärnhinnorna. Använd sedan tärnarna för att ta bort lillhjärnan och använd böjda spetsiga tyckor för att överföra hjärnan på ett stycke filterpapper med en 11 mikrometer por ovanpå en vävnadshacka. För SVZ och GD mikrodissektion, börja med att hugga hjärnan i 450 mikrometer koronal sektioner.
Använd en våt lamina för att samla in den sektionerade hjärnan i en ny Petri skålen fylld med kallt antibiotikum kompletteras HBSS under en dissekera mikroskop och använda forceps för att separera koronala skivor i en främre-till-posterior mode tills skivor med laterala ventriklar nås. Använd fina tång för att skära det tunna lagret av vävnaderna som omger ventriklarnas laterala vägg, utom den striatala parenkymen och corpus callosum och placera den ena spetsen av tångarna omedelbart under corpus callosum och den andra i vävnaden omedelbart intill det ventrala området i den laterala ventrikeln för att isolera SVZ. Skär en liten linje av vävnader som omger den laterala ventrikeln och samla den dissekerade vävnaden i ett provrör som innehåller kompletterad HBSS-lösning.
När alla skivor har mikroupptäckts med tuppar och hippocampusbildning har uppnåtts, kasta den första biten med hippocampus där GENERALDIREKTORATET fortfarande är oigenkännligt. För att ta bort GD, först isolera hippocampus från skivor och fokusera mikroskopet för att visualisera gränserna runt DG. För att skörda generaldirektoratet, använd forceps för att göra en nedskärning mellan GD och CA1-regionen följt av ett vertikalt snitt mellan GD och CA3-regionen. Ta sedan bort fimbria och eventuell intilliggande vävnad och placera den skördade vävnaden i separat rör av antibiotika kompletterad HBSS-lösning.
För att ta isär SVZ- och GD-proverna, lägg trypsin-EDTA 0,05%till en slutlig koncentration av 5-10%av Trypsin-EDTA 0,05%i HBSS till varje rör för en cirka 50 minuters inkubation vid 37 grader Celsius. Hela användningen av trypsin eller för lång inkubationstid kan leda till ökad celldöd, negativt påverkar celltillväxt. När vävnaden har klumpat ihop, ersätta enzymlösningen för fyra på varandra följande tvättar med en milliliter färsk kompletterad HBSS per tvätt.
Efter den sista tvätten, resuspend de rötade vävnaderna i en milliliter av serumfritt medium kompletterat med 10 nanogram per milliliter av epidermal tillväxtfaktor och fem nanogram per milliliter av grundläggande fibroblast tillväxtfaktor per rör. Därefter tar man mekaniskt isär vävnaderna med skonsam pipettering sju till tio gånger med en P1000 pipet tills en homogen celllösning har erhållits. För att bestämma densiteten för den dissocierade DG- eller SVG-cellen, räkna cellerna i varje suspension på en hematocytometer.
För att expandera cellerna till neurosfärer, späd de enskilda cellpopulationerna på en två gånger tio till de fjärde cellerna per milliliter densitet i serumfritt medium kompletterat med tillväxtfaktorer och frö fem milliliter av cellen suspensionen i obestruket 60 millimeter diameter Petri rätter. Sedan inkubera SVZ-cellerna i sex till åtta dagar och GD-cellerna i 10 till 12 dagar vid 37 grader Celsius för primär neurosfärbildning. När majoriteten av neurosfärerna har 150 till 200 mikrometerdiameterdiameter diameter, skörda cellen suspension från kulturerna och samla in neurosfärerna genom centrifugeringen.
Resuspend neurosfären pall med en mus kemisk dissociation kit enligt tillverkarens anvisningar innan samla in cellerna med en annan centrifugeringen. Ersätt supernatanten med en milliliter serumfritt medium kompletterat med tillväxtfaktorer och försök försiktigt att betygsätta pelleten ca 10 gånger. Räkna de dissocierade neurocellerna som visats och reseed cellerna på en två gånger 10 till den fjärde celler per milliliter densitet i serum-free medium kompletteras med tillväxtfaktorer till nya 60 milliliter Petri rätter.
Sedan tillbaka cellen till cellodlingen inkubator för ytterligare sex till åtta eller 10 till 12 dagar som lämpligt att erhålla sekundära neurosfärer. SVG och GD neurosfärer som erhålls genom att använda neurosfären analysen består av odifferentierade Sox2 positiva, nestin positiva celler. Noterbart är att SVG-härledda neurosfärer har större dimensioner än sina GD-motsvarigheter.
Viktigt, under differentiering villkor, SVG och DG-härledda neurala stam/stamceller migrera ut ur neurosfärer, bildar en pseudomonolayer av celler. I båda neurogenic regioner, är det möjligt att observera förekomsten av Sox2 dubbel positiv, nestin dubbel positiv, doublecortin dubbel negativ cell par som motsvarar symmetriska divisioner som tyder på självförnyelse. Cellpar där en cell av Sox2 positiva, nestin positiva och doublecortin negativ, och den andra cellen Sox2 negativ, nestin negativ, och doublecortin positiva visar asymmetriska divisioner.
Och Sox2 dubbel negativ, nestin dubbel negativ, och doublecortin dubbel positiva cellpar som motsvarar symmetriska divisioner som tyder på differentiering. Totalt sett ändrar passaging celldödsfrekvensen vid andra dagen in vitro. Neuritogenesis kan utvärderas i nervceller som erhållits från differentiering av SVG och GD neurala stamceller/progenitor celler i början av differentiering.
Som observerats ökar längden och förgreningen av neuriterna med differentiering. En hög andel proliferativa celler observeras i SVG jämfört med GD. Även om andelen proliferering progenitors som differentierar till mogna nervceller är liknande i både neurogena nischer. Båda celltyperna är också kunna differentiera till omogna nervceller, mogna neutroner, oligodendrocytes prekursorceller, mogna oligodenadtrocyter, och astrocyter.
Efter erhållande av neurospheresna, kan flera metoder däribland immunocytochemistry, calciumavbildning, västra blottor och RT-PCR utföras för att studera stemnessen och multipotencyen av de neurala stemen/progenitorcellerna. Neurosfären assay kan tillämpas på genetiska och sjukdomsmodeller för att ytterligare utvärdera de molekylära och cellulära processer innebär både spridning och differentiering av neurala stamceller / stamceller.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
