Derribo estable de genes que codifican proteínas de matriz extracelular en la línea celular de mioblaste C2C12 utilizando small-Hairpin (sh)RNA
Summary
Proporcionamos un protocolo para derribar genes que codifican las proteínas de matriz extracelular (ECM) en los mioblastos C2C12 utilizando ARN de horquilla pequeña (sh). Apuntando a ADAMTSL2 como ejemplo, describimos los métodos para la validación de la eficiencia de derribo en el ARNm, la proteína y el nivel celular durante la diferenciación de mioblasto c2C12 a miotubo.
Abstract
Las proteínas de matriz extracelular (ECM) son cruciales para el desarrollo del músculo esquelético y la homeostasis. El derribo estable de genes que codifican proteínas ECM en mioblastos C2C12 se puede aplicar para estudiar el papel de estas proteínas en el desarrollo del músculo esquelético. Aquí, describimos un protocolo para agotar la proteína ECM ADAMTSL2 como ejemplo, utilizando ARN de horquilla pequeña (sh) en células C2C12. Tras la transfección de plásmidos de ARNS, las células estables se seleccionaron por lotes mediante puromicina. Además, describimos el mantenimiento de estas líneas celulares y el análisis fenotípico a través de la expresión de ARNm, la expresión de proteínas y la diferenciación C2C12. Las ventajas del método son la generación relativamente rápida de células de derribo C2C12 estables y la diferenciación confiable de células C2C12 en miotubos multinucleados tras el agotamiento del suero en el medio de cultivo celular. La diferenciación de las células C2C12 puede controlarse mediante microscopía de campo brillante y midiendo los niveles de expresión de los genes marcadores canónicos, como MyoD, miogenina o cadena pesada de miosina (MyHC), lo que indica la progresión de la diferenciación de mioblastos C2C12 en miotubos. En contraste con el derribo transitorio de genes con ARN de interferencia pequeña (si), los genes que se expresan más tarde durante la diferenciación C2C12 o durante la maduración del miotubo pueden ser dirigidos de manera más eficiente mediante la generación de células C2C12 que expresan establemente el ARNS. Las limitaciones del método son una variabilidad en las eficiencias de derribo, dependiendo del ARNS específico que se puede superar mediante el uso de estrategias de eliminación genética basadas en CRISPR/Cas9, así como los posibles efectos fuera del objetivo del ARNS que deben ser considerados.
Introduction
Las proteínas de matriz extracelular (ECM) proporcionan soporte estructural para todos los tejidos, median la comunicación celular y determinan el destino celular. La formación y remodelación dinámica de ECM es por lo tanto crítica para mantener la homeostasis tisular y órgano1,2. Variantes patológicas en varios genes que codifican proteínas ECM dan lugar a trastornos musculoesqueléticos con fenotipos que van desde distrofias musculares hasta pseudomouscular build3,4. Por ejemplo, las variantes patógenas en ADAMTSL2 causan la displasia geleóísica del trastorno musculoesquelético extremadamente rara, que presenta con la construcción pseudomuscular, es decir, un aumento aparente en la masa muscular esquelética5. Junto con los datos de expresión génica en ratón y humanos, esto sugiere un papel para ADAMTSL2 en el desarrollo del músculo esquelético o homeostasis6,7.
El protocolo que describimos aquí fue desarrollado para estudiar el mecanismo por el cual ADAMTSL2 modula el desarrollo del músculo esquelético y /o homeostasis en un entorno de cultivo celular. Hemos derribado establemente ADAMTSL2 en la línea de células de mioblasto Murine C2C12. C2C12 myoblasts y su diferenciación en miotubos es un modelo de cultivo celular bien descrito y ampliamente utilizado para la diferenciación muscular esquelética y la bioingeniería muscular esquelética8,9. Las células C2C12 pasan por distintos pasos de diferenciación después de la retirada del suero, lo que resulta en la formación de miotubos multinucleados después de 3 a 10 días en cultivo. Estos pasos de diferenciación se pueden controlar de forma fiable midiendo los niveles de ARNm de genes marcadores distintos, como MyoD, miogenina o cadena pesada de miosina (MyHC). Una ventaja de generar derribos genéticos estables en las células C2C12 es que los genes que se expresan en etapas posteriores de la diferenciación C2C12 pueden ser dirigidos de manera más eficiente, en comparación con el derribo transitorio logrado por el ARN de interferencia pequeña (si), que normalmente dura de 5 a 7 días después de la transfección, y está influenciado por la eficiencia de la transfección. Una segunda ventaja del protocolo como se describe aquí es la generación relativamente rápida de lotes de células de derribo C2C12 utilizando la selección de puromicina. Las alternativas, como el knockout genético mediado por CRISPR/Cas9 o el aislamiento de precursores primarios de células musculares esqueléticas de ratones humanos o con deficiencia de genes diana, son técnicamente más difíciles o requieren la disponibilidad de biopsias musculares del paciente o ratones con deficiencia de genes diana, respectivamente. Sin embargo, al igual que otros enfoques basados en el cultivo celular, existen limitaciones en el uso de células C2C12 como modelo para la diferenciación de células musculares esqueléticas, como la naturaleza bidimensional (2D) de la configuración del cultivo celular y la falta del microambiente in vivo que es fundamental para mantener las células precursoras del músculo esquelético indiferenciadas10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un protocolo para el derribo estable de proteínas ECM en mioblastos C2C12 y para el análisis fenotípico de la diferenciación de mioblastos C2C12 en miotubos. Varios factores determinan el resultado del experimento y deben ser considerados cuidadosamente. Mantener las células C2C12 en la fase de proliferación es un paso crítico para mantener las células C2C12 en el estado del precursor del mioblasto. Conservar la capacidad de las células C2C12 para diferenciarse consistentemente en miotubos depe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.H. cuenta con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel, NIAMS, número de subvención AR070748) y fondos semilla del Departamento de Ortopedia de Leni & Peter W. Monte Sinaí.
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
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