Summary
我们提供一种协议，使用小发夹（sh）RNA在C2C12表细胞细胞细胞中稳稳地敲除编码细胞外基质（ECM）蛋白质的基因。以 ADAMTSL2 为例，我们描述了在 C2C12 霉细胞到霉细胞分化期间，mRNA、蛋白质和细胞水平的敲除效率验证方法。
Abstract
细胞外基质 （ECM） 蛋白质对骨骼肌发育和平衡至关重要。C2C12肌细胞中ECM蛋白基因编码的稳定敲除可用于研究这些蛋白质在骨骼肌发育中的作用。在这里，我们描述了一个协议，以耗尽ECM蛋白ADAMTSL2为例，使用小发夹（sh）RNA在C2C12细胞。在shRNA质粒转染后，使用紫霉素分批选择稳定细胞。我们进一步描述了这些细胞系的维持以及通过mRNA表达、蛋白质表达和C2C12分化进行的型皮分析。该方法的优点是，在细胞培养基中血清耗尽后，稳定C2C12敲除细胞的生成速度较快，C2C12细胞可可靠地分化成多核化月管。C2C12细胞的分化可以通过明亮的场显微镜和测量规范标记基因的表达水平，如肌D、肌激素或肌苷重链（MyHC）来监测，表明C2C12肌细胞分化到肌管的进展。与具有小干扰（si）RNA的基因的瞬时击倒不同，在C2C12分化期间或在核管成熟期间表达的基因可以通过生成稳定表达shRNA的C2C12细胞来更有效地靶向。该方法的局限性是敲除效率的可变性，这取决于使用基于CRISPR/Cas9的基因敲除策略可以克服的特定shRNA，以及应考虑的shRNA的潜在偏离目标效应。
Introduction
细胞外基质 （ECM） 蛋白质为所有组织提供结构支持，调解细胞-细胞通信，并确定细胞命运。因此，ECM的形成和动态重塑对于维持组织和器官平衡1，2至关重要。为ECM蛋白编码的几个基因中的病理变异导致肌肉骨骼疾病，其表型从肌肉萎缩症到伪造血症3，4。例如，ADAMTSL2中的致病变异导致极其罕见的肌肉骨骼紊乱，表现为假肌肉生成，即骨骼肌质量明显增加5。加上小鼠和人类的基因表达数据，这表明ADAMTSL2在骨骼肌发育或平衡6，7中的作用。
我们在这里描述的协议是为了研究ADAMTSL2在细胞培养环境中调节骨骼肌发育和/或平衡的机制而开发的。我们稳稳地击倒了鼠C2C12霉菌细胞系中的ADAMTSL2。C2C12肌细胞及其分化成肌管是骨骼肌分化和骨骼肌生物工程8、9的一种描述良好且广泛使用的细胞培养模型。C2C12细胞在血清戒断后经历明显的分化步骤，导致培养3~10天后形成多核化月管。通过测量不同标记基因（如肌D、肌激素或肌苷重链（MyHC）的mRNA水平，可以可靠地监测这些分化步骤。在C2C12细胞中产生稳定基因敲除的一个优点是，与小干扰（si）RNA实现的瞬时敲除相比，在C2C12分化后期表达的基因可以更有效地定向，这种核化通常持续5~7天，并受转染效率的影响。此处所述协议的第二个优点是使用紫霉素选择快速生成批次 C2C12 敲除细胞。替代方案，如CRISPR/Cas9介导的基因敲除或从人类或靶基因缺陷小鼠分离原发性骨骼肌细胞前体，在技术上更具挑战性，或需要分别提供患者肌肉活检或靶基因缺陷小鼠。然而，与其他基于细胞培养的方法类似，使用C2C12细胞作为骨骼肌细胞分化模型存在局限性，如细胞培养的二维（2D）性质和缺乏对维持未分化的骨骼肌前体细胞至关重要的体内微环境10。
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Protocol
1. 从大肠杆菌制备shRNA疟原体DNA
- 产生携带shRNA质粒的克隆细菌菌落
- 从商业来源获得携带靶性shRNA质粒的大肠杆菌的甘油库存和控制质粒（材料表）。
注：使用了三种不同的shRNA质粒，针对的鼠阿达姆茨尔2 mRNA的不同区域。一个 shRNA 被选定针对Adamtsl2的 3'未翻译区域 （3'UTR）， 以方便使用表达质粒编码重组全长 ADAMTSL2 或单个 ADAMTSL2 蛋白质域的救援实验。此外，一个炒shRNA质粒被列入阴性对照。图1A提供了shRNA序列的详细信息。 - 在室温 （RT） 下解冻 shRNA 细菌甘油。将10 μL的细菌甘油库存转移到Luria-Bertani （LB） 琼脂板，辅以100微克/mL阿霉素（LB-Amp）。
注：LB-Amp 板由高压灭菌 1 L LB 介质（对于 1 L： 10 g 的试青尼、5 克酵母提取物、10克NaCl、将 pH 度调整到 7.0）与 12克琼脂一起制备。让介质冷却至+50°C，并将阿霉素（无菌水中的库存溶液：50mg/mL）添加到μg/mL（LB-Amp琼脂）的最终浓度中。立即将 ±20 mL 的 LB-Amp 琼脂倒入 10 厘米培养皿中，并在使用前让琼脂凝固。1 L-Amp 琼脂通常足以倒入约 40 个 10 厘米培养皿。含有LB-Amp琼脂的培养皿在黑暗中密封在4°C下，至少稳定一个月。 - 传播细菌与无菌干加尔斯基铲或任何其他适当的方法，以实现单一细菌菌落。在37°C下孵育细菌板过夜。
- 从商业来源获得携带靶性shRNA质粒的大肠杆菌的甘油库存和控制质粒（材料表）。
- 疟原虫制剂
- 第二天早上，取出具有单个细菌菌落的培养皿，储存在4°C处，以避免细菌菌落的过度生长和卫星菌落的形成。如果储存过夜或更长时间，则密封培养皿。
- 下午，将5mL的LB-Amp培养基加入聚丙烯细菌培养管中。从培养皿中选择一个细菌菌群，在一夜之间用移液器尖端培养，并通过在含有LB-Amp培养基的细菌培养管中弹出移液器尖端，接种LB-Amp培养基。
- 在 37°C 下以 250 rpm 的转速在摇床中孵育细菌培养物，盖子松散连接以允许曝气。
- 第二天早上拿出细菌培养管，并保持在4°C，以避免细菌过度生长。下午，通过涡旋重新悬浮细菌，在250 mL锥形烧瓶中转移50 mL LB-Amp培养基的过夜细菌培养物1 mL。在 37°C 下以 250 rpm 的转速在摇床中孵育过夜。
- 第二天早上，将细菌转移到50 mL一次性离心管和离心细菌在RT下6000 x g上15分钟。取出该介质，继续步骤1.2.6。
注：如果质粒DNA不能立即分离，在离心步骤后取出LB-Amp培养基，并将细菌颗粒储存在-20°C。 - 按照质粒制备试剂盒（米氏鳞）的说明从细菌中提取质粒DNA。使用分光光度计测量 A260/A280比率，评估质粒 DNA 质量。
注：A260/A280比 >1.8 是可取的，表示质粒 DNA 制备的高纯度。较低的 A260/A280比率表示蛋白质污染或提取试剂去除不足。可能需要额外的质粒纯化步骤。
2. C2C12细胞和紫霉素选择的培养和转染
- C2C12 细胞培养
- 解冻C2C12细胞（材料表）在37°C水浴中快速，在无菌一次性15mL离心管中倒入细胞，其中含有8mL的Dulbeco改性Eagle培养基（DMEM）介质，并在细胞培养罩中补充100单位青霉素和链霉素抗生素（无血清DMEM）。离心细胞在RT时160 x g下3分钟。
- 吸气上清液，在10 mL无血清DMEM中重新悬浮细胞颗粒，辅以10%胎儿牛血清（FBS）（完整DMEM）。将细胞转移到10厘米组织培养处理塑料皿。在5%的CO2大气中，在37°C的加湿培养箱中孵育细胞。
- 第二天，用全新完整的 DMEM 替换介质。
- 在 3⁄4 10 厘米的盘子上展开低通道 C2C12 细胞。当 C2C12 细胞达到 50–60% 汇合时，用 10 mL 的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 吸气并冲洗 C2C12 细胞。
- 加入1 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA，在RT.监测细胞分离在显微镜下孵育2分钟，必要时延长孵育时间，直到大部分细胞分离。
注意：小心地敲击盘子有助于清除细胞。 - 当大多数细胞分离时，向培养皿中加入10 mL的完整DMEM，将音量上下移移几次，并将细胞悬浮液转移到无菌的一次性15 mL离心管中。离心细胞在RT.增压上清液下160 x g下3分钟，在2mL冷冻培养基（10%二甲基硫酸盐[DMSO]/90%FBS）中重新悬浮细胞颗粒。
- 在冷冻液中每10厘米的菜中转移两个1 mL等分。在充满RT异丙醇的细胞冷冻容器中孵育至少24小时，在-80°C冷冻器中，使冷冻速率达到每分钟约-1 °C，以避免形成冰晶。储存细胞，在液氮的蒸气相中长期使用。
注： 供应商建议使用 C2C12 单元，最多 15 个通道。作者的经验还表明，低通道数细胞在月管中表现出更一致和快速的分化。保持C2C12细胞在低细胞密度（<50%汇合）下是必要的，以避免过早的分化。区分或分化的 C2C12 细胞不能恢复到原始霉细胞状态，必须丢弃。
- 准备C2C12细胞转染
- 培养未分化的C2C12细胞，在10厘米的培养皿中，直到它们达到50-60%的汇合。吸出培养基，用10mL的PBS冲洗C2C12细胞，并加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。在RT孵育2分钟，在显微镜下监测细胞分离，并在必要时延长孵育时间，直到大部分细胞分离。
注意：小心地敲击盘子有助于清除细胞。 - 当大多数细胞分离时，将10 mL的完整DMEM添加到培养皿中，并将细胞悬浮液转移到无菌的一次性15 mL离心管中。离心细胞在RT.吸气上清液下160 x g下3分钟，在4 mL的完整DMEM中重新悬浮细胞颗粒。
- 在 1.5 mL 反应管中将 10 μL 的细胞悬浮液与 10 μL 的锥片蓝色结合，通过上下移液混合并仔细轻拂反应管，并将细胞转移到计数滑块。使用自动细胞计数器确定细胞编号/mL。
- 将C2C12细胞稀释至50，000个细胞/mL，并在6孔板中每孔100，000个细胞（2 mL）的种子，在一夜孵育后达到约40~50%的汇合。在5%的CO2大气中，在37°C的加湿培养箱中孵育细胞。
- 培养未分化的C2C12细胞，在10厘米的培养皿中，直到它们达到50-60%的汇合。吸出培养基，用10mL的PBS冲洗C2C12细胞，并加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。在RT孵育2分钟，在显微镜下监测细胞分离，并在必要时延长孵育时间，直到大部分细胞分离。
- 使用聚乙烯胺（PEI）和紫霉素选择，用shRNA质粒转染C2C12细胞
- 准备 PEI 库存解决方案
- 将 16 毫克 PEI 溶解在 50 mL 的无菌蒸馏水中（库存溶液浓度：0.32 mg/mL）中，装在带螺钉盖的 50 mL 玻璃介质瓶中。在65°C孵育溶液1小时，在孵育期间多次大力涡旋溶液，以完全溶解PEI。
- 每 50 mL 添加 15 μL 的 1N HCl，以 pH 8 调节。
注意：HCl 具有腐蚀性。浓缩 HCl 应在烟罩下处理。调查人员应穿戴适当的个人防护装备。 - 将PEI溶液在-80°C下冷冻1小时，盖松连接，在水浴中37°C快速解冻，以进一步提高溶解度。重复冻结-解冻循环 3 倍。
- 将 PEI 库存溶液储存在 0.5 mL 等分，一次性在 -20°C 下使用。
- C2C12细胞的转染
- 将PEI库存溶液的25.5μL（8.5μL/μg质粒DNA）与100μL的25 mM NaCl结合在1.5 mL反应管中，在37°C下孵育5分钟。将3 μg质粒DNA与100μL的25 mM NaCl结合，在37°C下孵育5分钟。
- 将稀释的PEI试剂的整个体积与稀释的质粒混合，通过轻轻上下移液进行混合。在37°C下孵育25分钟。
- 在孵育期间，在没有FBS或抗生素的情况下，将用于转染的C2C12细胞的培养基改变至DMEM。
- 将PEI/DNA转染混合物加入C2C12细胞，通过仔细移动细胞培养皿不断混合。在37°C的加湿培养箱中孵育，在5%的CO2大气中。6 小时后，更改介质以完成 DMEM。
- 普洛霉素选择
- 转染后24小时，将介质切换到选择介质（完整的DMEM加5μg/mL紫霉素）。继续选择紫霉素，直到获得抗紫霉素的C2C12细胞，这通常需要10~14天。
- 在低细胞密度（<50~60%汇合）下扩大抗紫霉素的C2C12细胞，即保持6~10瓶的无差别状态和冷冻保存，以便今后进行步骤2.1.4_2.1.7所述。
注：在存在5μg/mL紫霉素的情况下，保持抗紫霉素的C2C12细胞，用于常规细胞培养和扩张。然而，在分化实验中省略了紫霉素。
- 准备 PEI 库存解决方案
3. C2C12分化的质象分析
注：下面描述的方法可以很容易地适应C2C12霉变分化到近管的一般型板分析，通过改变在西方印迹中使用的特定抗体或定量聚合酶中使用的基因特异性引物链式反应（qPCR）分析。
- C2C12 微分方案与明场显微镜
- 种子 150，000 细胞/孔在 12 孔板。培养抗紫霉素的C2C12稳定细胞，在5%CO2大气中的37°C中，在37°C的加湿培养箱中，在选择培养基中的12孔板中稳定细胞。培养C2C12细胞在完整的DMEM，直到他们达到+95%的汇合。
- 要诱导C2C12细胞的分化，用无血清DMEM（分化第0天）替换完整的DMEM。每两天更换一次介质，并使用带摄像头的倒置明亮场显微镜跟踪 C2C12 myotube 的形成。
注：许多协议使用2%马血清将C2C12细胞分化为月管。在作者的手中，完全去除血清也有类似的效果。胰岛素被描述为细胞培养基的添加剂，以加速C2C12分化。然而，在目前的协议中，C2C12细胞在血清剥夺和胰岛素添加后3~5天内可靠地分化成近管。
- 肌苷重链 （MyHC） 免疫染色可视化肌管
- 种子 50，000 抗紫霉素 C2C12 细胞每个腔室在 8 井室滑动在 500 μL 的完整 DMEM。培养细胞，直到它们达到95%的汇合在完整的DMEM（约24小时）。
- 要诱导分化，从完全的DMEM切换到500μL的无血清DMEM（分化第0天）。在所需的时间点，用0.5 mL的PBS吸气和冲洗细胞3x。
注：在 RT 上执行以下所有步骤。 - 用0.2 mL的4%甲醛（PFA）在PBS中稀释15分钟，用0.5 mL的PBS3x冲洗细胞，每次5分钟。
注意：PFA 是危险的。采取适当的预防措施，将甲醛溶液作为危险废物丢弃。 - 在PBS中用0.2 mL的0.2 mL（0.5M甘氨酸）冲洗细胞5分钟。用0.5 mL的PBS3x冲洗细胞，每次5分钟。
- 在PBS中用0.2 mL的0.1%非离子表面活性剂/洗涤剂（材料表）孵育细胞10分钟，使细胞膜渗透。在PBS中用0.2 mL的5%牛血清白蛋白块1小时，用0.5 mL的PBS3x冲洗细胞，每次5分钟。
- 用0.2 mL的MyHC抗体（PBS为1：200）孵育细胞2小时，用0.5 mL的PBS3x冲洗细胞，每次5分钟。
- 用0.2 mL的山羊抗小鼠红结合二级抗体孵育细胞（PBS为1：200）。用 0.5 mL 的 PBS 3x 冲洗细胞，每次 5 分钟。
- 定量去除PBS后，每腔内加入一滴含有4°，6-二酰胺-2-苯林多尔（DAPI）的安装介质。根据制造商的说明，盖玻片和固化安装介质。用指甲油密封。
- 使用适当的滤芯集使用荧光显微镜观察 C2C12 细胞。
- 通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）评估击倒效率
- 培养C2C12细胞在分化条件下的12孔板，如第3.1节所述。
- 在所需时间点，去除分化介质，用1mL的PBS冲洗细胞一次，每口井加入0.5 mL的RNA提取试剂（材料表）。通过仔细上下移液，将细胞分解液转移到无菌的1.5 mL反应管中，使细胞获得脂质。通过仔细遵循制造商的协议来分离RNA。
注意：RNA提取试剂含有苯酚。它应该在烟罩下使用。收集RNA提取试剂废物，并作为危险废物处理。调查人员应穿戴适当的个人防护装备。 - 将最终RNA颗粒溶解在20μL的二乙酰热盐（DEPC）处理水中。使用分光光度计确定RNA制备的数量和质量，并确定A260/A280比率作为质量度量。
注：12孔板1孔的典型收率为总RNA的5⁄7微克，A260/A280比率为1.8⁄2。 - 为了消化残留共纯化基因组DNA，在PCR管中稀释1μgRNA，总体积为8μL的DEPC处理水。加入1μL的10x反应缓冲液和1μL的DNase I（1单位/μL）（材料表），并在RT孵育15分钟。加入1μL的停止溶液（25米M EDTA），并在70°C孵育10分钟。
- 要生成cDNA，将10μL的DNase处理RNA与10μL的2x逆转录酶主混合物，包含逆转录酶，随机引物，4 mM dNTP混合（1 mM每个dATP，dTTP，dGTP和dCTP），和逆转录酶反应缓冲液。根据制造商的建议，使用程序在热循环器中孵育反应。以 1：5 的比例用水稀释 cDNA。
- 为了制备qRT-PCR反应，将5μL的SYBR绿色qPCR主混合物与0.5μL基因特异性正向和反向引基器（库存：10μM）和2μL的DEPC处理水每个反应。移液器qPCR反应在96孔qRT-PCR板的一个孔中，并加入2μL的稀释cDNA。为每个生物复制设置三个技术复制，并包括一个内务管理基因，如Gapdh或Hprt1。
- 使用以下程序使用 qRT-PCR 热循环器放大 PCR 产品：50°C 2 分钟（尿酸 DNA 糖基酶 [UDG] 激活），95°C 2 分钟（双锁 DNA 聚合酶激活），40 周期 95°C 15 s，60 °C 30 s，72 °C 1 分钟。
- 使用DDCt方法量化qRT-PCR结果，以归一化为内务管理基因，如Gapdh或Hprt1。
- 评估西方印迹的击倒效率
- 种子 300，000 抗紫霉素 C2C12 细胞每孔在 6 孔板用于西方印斑分析。24小时后，将培养基改为无血清的DMEM以启动分化（分化第0天）。
- 在所需时间点，在1.5 mL反应管中收集两个1 mL无血清调节介质，在RT处500 x g下用离心机5分钟，以清除分离的细胞和细胞碎片。
注：只有在研究ECM蛋白或条件介质中的其他分泌蛋白时，此步骤才是必要的。如果感兴趣的蛋白质在细胞质中局部或膜结合，吸出细胞培养基，然后继续细胞分部步骤（3.4.7±3.4.12）。细胞溶化应与无血清条件介质的蛋白质沉淀平行进行，以尽量减少蛋白解降解和细胞层长期储存的其他意外后果。 - 离心后，通过加入三氯乙酸（TCA）和非离子表面活性剂/洗涤剂的混合物0.391 mL，在新的1.5 mL反应管中转移1mL的调节介质和沉淀蛋白。短暂涡旋混合物，在冰上孵育10分钟。
注：在使用前直接制备蛋白质沉淀混合物，将55%TCA的0.252 mL和1%非离子表面活性剂/洗涤剂的1%非离子表面活性剂/洗涤剂（每mL）与条件介质和涡旋短暂结合。溶液变得浑浊。
注意：TCA 具有腐蚀性，必须妥善处理。 - 在 4°C 下将沉淀的蛋白质在 >16，000 x g下进行 10 分钟。丢弃上清液。
注意：上清液含有TCA，应单独收集并作为有害物质处理。 - 每次在 >16，000 x g下用冰冷的丙酮清洗蛋白颗粒 3x 和离心机 10 分钟，在 4 °C 下。
- 在RT处空气干燥蛋白质颗粒3⁄4分钟，并溶解在50μL的1x硫酸二烯酰二醇聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样品缓冲液（50 mM Tris pH 6.8，2%SDS，6%甘油和0.004%溴酚蓝，辅以5%β-麦卡托乙醇）。在95°C下将样品煮沸5分钟，用于西方印迹，使用标准程序检测所需的靶蛋白。
注意：β-汞醇有异味和毒性，必须在烟罩中处理。 - 对于细胞内和膜结合蛋白，用2 mL的PBS冲洗细胞层一次。
- 加入1 mL的PBS，并使用细胞刮刀刮掉孔中的细胞，将细胞取出。在1.5 mL反应管中收集细胞，在3，420 x g下收集细胞，在4°C下3分钟。用1 mL的PBS清洗细胞颗粒3x，在3，420 x g下，每次在4°C下清洗3分钟。
- 要对细胞进行赖舍，将细胞颗粒重新悬浮在0.2 mL的赖沙缓冲液中（20 mM Tris-HCl pH 7.5， 150 mM NaCl， 1 mM Na2EDTA， 1 mM EGTA， 1% NP40， 1% 脱氧胆酸钠， 2.5 mM 焦磷酸钠， 1 mM β-糖酸钠， 和 1 mM 酸原酸钠） 补充 1x EDA 无蛋白酶抑制剂鸡尾酒试剂，在冰上孵育 30 分钟。
- 在工作频率为 23 kHz 时，在冰上用 15 s 的超声波，功率输出设置为 10。
- 在 4°C 下以 13，680 x g离心清除细胞碎片 20 分钟。在新的1.5 mL反应管中收集上清液，并使用商业布拉德福德测定或任何其他合适的方法确定蛋白质浓度。
- 对于每个样品，将100μg蛋白质与5xSDS-PAGE样品缓冲液混合在60μL的总体积中，在95°C下煮5分钟。通过标准的西方印迹程序分析样品，以检测所需的靶蛋白。
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Representative Results
由于有效消除非耐药细胞，即未转染的细胞（图1B），在转染后10~14天内即可选择抗紫霉素的C2C12。通常，超过80%的细胞从细胞培养皿分离，这些细胞在常规细胞维护期间被移除。抗普诺霉素的C2C12细胞表达控制（分散）shRNA保持主轴形状，在低细胞密度下，长长细胞形态，并能分化成月管。血清提取时的C2C12分化可以通过明场显微镜和肌管标记肌苷重链（MyHC）的免疫染色进行监测（图2）。在分化启动后3~5天内观察到MyHC阳性心肌。Myotube 是多核的，如在 MyHC 阳性细胞边界内存在多个 DAPI 阳性核所示。图3A显示了在完全DMEM中培养的稳定C2C12细胞的明亮场图像。此处介绍的击倒效率范围从 40–60% （图 3B）。由于 mRNA 是在表达小Adamtsl2的增殖状态下收获的，因此敲入效率似乎较低，但在 C2C12 分化期间，在后期时间点，内源性Adamtsl2被诱导，从而在更高的水平上表示， 敲除效率预计会更大。西方印斑分析证实，从C2C12细胞获得的细胞中ADAMTSL2在细胞中成功击倒，与对照shRNA相比，稳稳地表达shRNA 3086（图3C）。
图1：使用shRNA编码质粒DNA转染后选择稳定的C2C12细胞。（A） 显示目标区域（CDS、编码序列;3'-UTR、3'-未翻译区域）、克隆 ID（以下称为 1977、3086 和 972）的表，以及用于定位Adamtsl2的 shRNA 序列。（B） 面板显示使用对照 shRNA 和三个Adamtsl2靶向 shRNA 转染的 C2C12 细胞的选择。C2C12细胞用shRNA质粒转染，在24小时后将紫霉素添加到培养基中。相比之下，含有集成shRNA质粒的抗紫霉素细胞呈主轴状，略长，附着，且可行（蓝色箭头）。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：C2C12霉杆菌与霉管分化。区分C2C12细胞的明亮场图像显示，在分化开始时（第0+1天）细胞的密集鹅卵石外观，并在第5天（上排）后观察到多核化月管。在分化第3天（中面板）诱导用肌苷重链（MyHC，红色）分化C2C12细胞的免疫染色，这是肌管的标记物。核被DAPI染色，合并的图像显示在下面板中。比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：在增殖C2C12细胞中稳定敲除的验证。（A） 在完全 DMEM 中培养的稳定 C2C12 细胞的明亮场图像。在稳定的C2C12细胞中，对Adamtsl2 mRNA表达的量程条 = 300 μm （B） qRT-PCR 分析.Ct值被归化为家政基因Hprt1。mRNA是在分化开始之前收获的。误差条表示标准偏差。（C） 西方斑点分析显示，从C2C12细胞中细胞中酶酸/ECM部分中减少的ADAMTSL2蛋白，以均匀地表达shRNA 3086。使用定制的多克隆肽抗体检测内源性ADAMTSL2（可应要求提供）。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
我们在这里描述了C2C12异型细胞中ECM蛋白稳定敲除的协议，以及C2C12表细胞分化到近骨的表型分析。有几个因素决定实验的结果，需要仔细考虑。在增殖阶段维持C2C12细胞是使C2C12细胞保持在霉细胞前体状态的关键步骤。保持C2C12细胞持续分化成月管的能力取决于i）细胞的通过数，ii）在日常维护期间培养细胞的密度，以及iii）营养供应，需要频繁和定期补充细胞培养基11，12，13。由于一些未知的机制，较高的通道数C2C12细胞也失去了进一步细胞融合11的潜力。来自C2C12细胞提供者的指令建议将这些细胞保持至15号。此后，分化电位可能降低，用此类细胞进行实验可能导致心肌形成不太一致。另一方面，在维护过程中的细胞密度可以产生类似的效果9。在常规细胞培养过程中达到结对C2C12细胞密度可促进C2C12霉细胞分化的启动，从而可能对细胞群的分化潜力产生负面影响。因此，在常规C2C12细胞维护期间，防止C2C12细胞达到高细胞密度至关重要。这可以通过已经在低细胞密度（<50-60%汇合）下对C2C12细胞进行分培养来实现。血清饥饿用于诱导C2C12细胞分化成月管。因此，在不补充介质的情况下，保持细胞更长时间会严重耗尽营养和血清水平。至少每两天补充一次含有培养基的新鲜血清，可以防止因营养和血清缺乏而出现不必要的过早分化。
C2C12分化通常由血清饥饿引起。用于诱导C2C12分化的血清的百分比可以极大地影响结果，特别是形成MyHC阳性近管14，15所需的时间。几种方案显示在各种血清浓度下成功地诱导分化。使用2+10%FBS或马血清和完全血清剥夺报告和所有条件导致C2C12霉管形成。血清百分比或血清批次的变化可以显著改变分化的标记。此外，血清的来源可能会影响实验结果，因为来源国可能或可能不允许某些添加剂在牛血清生产8。血清水平可根据具体实验要求进行调整，达到分化率。胰岛素可添加到C2C12细胞的培养基培养基中，以加速分化和心肌形成16。
通过转染将编码shRNA或重组蛋白的质粒输送到C2C12细胞的能力是C2C12细胞的一个有吸引力的特点。若干商业性脂质体转染试剂以前曾用于将质粒DNA输送到C2C12细胞中，其转化效率为17、18、19、20、21。PEI 还表现出合理的转染效率，是基于脂体转染试剂的具有成本效益的替代品。转染与商用脂体转染试剂和PEI的比较表明，在转染效率上没有显著变化，PEI22的效率稍高。在我们手中，PEI的转染效率足以产生稳定的抗紫霉素C2C12细胞。然而，该协议的一个关键步骤是缩短转染试剂的孵育时间。如上所述，C2C12细胞对血清提取敏感，在转染过程中长时间接触低血清条件可能有利于C2C12细胞分化。由于转染是在没有血清的情况下进行的，转染后的孵育时间保持短，以快速再供应含血清的培养基，以防止过早分化。在转染后24小时将紫霉素添加到培养基中，以启动抗普霉素C2C12细胞的选择。将质粒DNA引入分化肌管的方法包括转染（效率高达85%）、电穿孔或生物方法23、24、25。或者，在肌管分化的后期或肌管成熟期26时，可以生成含有诱导shRNA质粒的稳定C2C12细胞，以击倒基因。
本文描述的方法导致ADAMTSL2在C2C12细胞中稳定敲除，现在可以确定其在分化为月管过程中的功能。生成稳定的敲除细胞对于研究在核子管形成或成熟过程中诱导的蛋白质的功能尤为重要。例如，使用siRNA的瞬态转染不足以有效地敲除这些基因，因为siRNA的瞬时敲除效应可能在5~7天后断掉。或者，使用CRISPR/Cas9敲除ECM蛋白在技术上更具挑战性，需要选择和测序单个克隆，以确保敲除所需基因。然而，不断发展的试剂线可能使CRISPR/Cas9成为未来功能丧失实验的首选方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
D.H. 由美国国家卫生研究院（国家关节炎和肌肉骨骼和皮肤病研究所，NIAMS，赠款编号AR070748）和种子资助从Leni & Peter W. 五月骨科，伊坎医学院西奈山
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
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