Summary
Эта работа описывает протоколы для подготовки магнитных наночастиц, его покрытие с SiO2, а затем его аминь функционализации с (3-аминопропил) триэтоксисилана (APTES) и его спряжения с deferoxamine с помощью succinyl moiety в качестве связучателя. Глубокое описание структурной характеристики и анализ бактерий захвата с помощью Y. enterocolitica для всех промежуточных наночастиц и окончательный конъюгированный также описаны в деталях.
Abstract
В настоящей работе, синтез магнитных наночастиц, его покрытие с SiO2, а затем его аминь функционализации с (3-аминопропил) триетоксисилана (APTES) и его спряжение с deferoxamine, боковой дрофор признан Yersinia enterocolitica, используя succinyl moiety в качестве связувателя описаны.
Магнитные наночастицы (MNP) магнетита (Fe3O4) были подготовлены solvothermal методом и покрыты SiO2 (MNP@SiO2) с использованием процесса Стёбер следуют функционализации с APTES (MNP@SiO2@NH2). Затем, фероксамин был конъюгированных с MNP@SiO2@NH2 карбодиимид соединения дать MNP@SiO2@NH2@Fa. Морфология и свойства конъюгированных и промежуточных были изучены восемью различными методами, включая дифракцию порошкового рентгеновского излучения (XRD), фурье трансформировать инфракрасную спектроскопию (FT-IR), спектроскопию Романа, рентгеновскую фотоэлектронную спектроскопию (XPS), микроскопию электронов передачи (TEM) и энергетическую дисперсию X-Ray. Эта исчерпывающая характеристика подтвердила формирование конъюгата. Наконец, для того, чтобы оценить емкость и специфичность наночастиц, они были протестированы в захвате бактерий анализа с помощью Yersinia enterocolitica.
Introduction
Методы обнаружения бактерий с использованием MNP основаны на молекулярном распознавании антител, апгтемеров, биопротеинов, углеводов, спряженных к MNP патогенными бактериями1. Принимая во внимание, что siderophores признаются конкретных рецепторов на внешней мембране бактерий, они также могут быть связаны с MNP, чтобы увеличить их специфичность2. Siderophores являются небольшие органические молекулы, участвующие в Fe3 "поглощение бактериями3,4. О подготовке спряжений между бокофорами и МНП наряду с их оценкой для улавливания и изоляции бактерий пока не сообщалось.
Одним из важнейших шагов в синтезе конъюгированных магнитных наночастиц с небольшими молекулами является выбор типа связи или взаимодействия между ними для обеспечения того, чтобы небольшая молекула была прикреплена к поверхности MNP. По этой причине, процедура подготовки конъюгировать между магнитными наночастицами и фероксамином- siderophore признанных Yersinia enterocolitica-была сосредоточена на генерации модифицируемой поверхности MNP, чтобы увязать его ковалентно в siderophore карбодиимицидной химии. Для того, чтобы получить единый наночастицы магнетита (MNP) и улучшить нуклеацию и контроль размера, реакция solvolysis с бензиловым спиртом была проведена в тепловом блоке без встряхивания5. Затем кремнеземное покрытие было сгенерировано методом Стёбера для защиты и повышения устойчивости подвески наночастиц в aqueous media6. Принимая во внимание структуру фероксамина, введение аминь групп необходимо для производства подходящих наночастиц (MNP@SiO2@NH2),чтобы быть сопряжены с siderophore. Это было достигнуто путем конденсации (3-аминопропил) триетоксисилана (APTES) с алкогольными группами, присутствующими на поверхности кремнезема модифицированных наночастиц (MNP@SiO2) с использованием метода соль-геля7.
Параллельно комплекс фероксаминов железа (III) был подготовлен комплексом коммерческого дефероксамина с ацетонатом железа ацетилата в аквеевом растворе. N-succinylferoxamine, подшипник succinyl групп, которые будут выступать в качестве связунов, был получен реакцией фероксамина с сукциническим ангидридом.
Спюгация между MNP@SiO2@NH2 и N-succinylferoxamine дать MNP@SiO2@NHиФа была проведена через карбодииимид химии с использованием в качестве соединения реагентов бензорифотризол-1-й дифологтиуфос -оксофторофос (BOP) и 1-гидроксибензотриазол (HOBt) в мягком базовом носителе для активации терминальной кислотной группы в N-succinylferoxamine8. N
После того, как MNPs были охарактеризованы, мы оценили возможности голых и функциональных магнитных наночастиц для захвата дикого типа (WC-A) и мутант Y. enterocolitica не хватает фероксамина рецептора FoxA (FoxA WC-A 12-8). Равнины MNPs, функционализуемые MNPs и конъюгированных MNP@SiO2@NHФабыло разрешено взаимодействовать с каждым Y. enterocolitica штамма. Бактерии-конъюгированные агрегаты были отделены от бактерий подвески путем применения магнитного поля. Разделенные агрегаты дважды промывались фосфатным буферизированным физраствором (PBS), повторно приостанавливались в PBS для подготовки серийных разбавлений, а затем, они были покрыны для подсчета колоний. Этот протокол демонстрирует каждый шаг синтеза MNP@SiO2@NH@Fa, структурную характеристику всех промежуточных и конъюгированных, а также анализ захвата бактерии как простой способ оценить специфику спряжения по отношению к промежуточным. 9 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Для реакций, выполняемых в условиях инертной атмосферы, вся стеклянная посуда была ранее высушена в духовке при температуре 65 градусов по Цельсию, запечатана резиновой перегородкой и трижды продувается аргоном.
1. Синтез магнитных наночастиц, конъюгированных с фероксамином
- Синтез наночастиц магнитного синтеза Fe3O4 (MNPs)
- Добавьте 0,5 г Fe (acac)3 в стеклянный флакон 20 мл, а затем смешайте с 10 мЛ бензилового спирта.
- Sonicate эту смесь в течение 2 мин, затем передать в отопительный блок и тепла при температуре 180 градусов по Цельсию в течение 72 ч.
- После завершения реакции дайте флаконам остыть, промыть наночастицы 96% этанолом и центрифугой при 4000 х г в течение 30 мин. Повторите центрифугирование не менее двух раз.
- Отделить наночастицы от супернатанта магнитным притяжением с помощью магнита неодимия (NdFeB) и отбросить остаточный растворитель.
- Промыть с 96% этанола повторяя шаг 1.1.4. и отбросить супернатант, чередующийся с звуковой в ванне в течение 1 мин при 40 кГц, пока растворитель не будет выглядеть ясным.
- Магнитные наночастицы SiO2 покрытие (MNP@SiO2)
- Подготовьте подвеску 2 г МНП в 80 мл изопропанола, а затем добавьте 4 мл 21% аммиака, 7,5 мл дистиллированной воды и 0,56 мл тетраэтил ортилического ортосиликата (TEOS) (в этом порядке) в круглую нижнюю колбу с магнитной решеткой.
- Нагрейте смесь при температуре 40 градусов по Цельсию при непрерывном перемешивании, а затем sonicate в течение 1 ч.
- Отделить MNP с магнитом, отбросить супернатант, и разогнать его в 30 мл изопропанола.
- Повторите шаги 1.2.1. и 1.2.2.
- Удалить и вымыть магнитного перемешать бар с 96% этанола, чтобы восстановить весь материал.
- Отделить наночастицы от супернатанта магнитным притяжением с помощью магнита.
- Откажитесь от супернатанта и промойте наночастицы 96% этанола, три раза чередуясь с звуковой.
- Высушите наночастицы при вакууме при комнатной температуре в течение 12 ч.
- Функционализации MNP@SiO2 с (3-аминопропил) триэтоксисилана (APTES)
- Промыть 500 мг MNP@SiO2, полученных от предыдущего шага с N,N-диметилформамид (DMF) под инертной атмосферой, а затем sonicate в течение 1 мин на 40 кГц. Затем отбросьте супернатант и повторите этот процесс три раза.
- Повторно приостановить частицы в круглой нижней колбе, под перемешиванием с магнитной бар перемешать и добавить 9 мл APTES.
- Перемешать смесь при 60 градусов по Цельсию на 12 ч.
- Откажитесь от супернатанта и промойте наночастицы 96% этанола, три раза чередуясь с звуковой.
- Синтез фероксамина
- Растворите 100 мг (0,15 ммоль) соли дефоксамина мезилата и 53,0 мг (0,15 ммоль) Fe (acac)3 в 5 мл дистиллированной воды и перемешайте смесь на ночь при комнатной температуре.
- Вымойте полученный продукт три раза с 20 мл EtOAc в разделительной воронке, а затем удалить органический растворитель под вакуумом с помощью вращательного испарителя.
- Заморозить-сухой aqueous фазы позволить себе фероксамин, как красный твердый.
- Синтез N-сукцинильфероксимин
- Добавьте 350 мг (3,50 ммоль) сучцинического ангидрида в раствор 100 мг (0,17 ммоль) фероксамина в 5 л пиризина в 50-м л круглой нижней колбе под инертной атмосферой.
- Перемешать полученную смесь при комнатной температуре в течение 16 ч. По истечении этого времени, удалить избыток пиридин под пониженным давлением в ротатор испаритель, чтобы дать темно-красный твердый.
- Растворите реакцию сырой в 3 мл метанола.
- Перенесите метаноловый раствор в колонку Sephadex (20 см Sephadex в столбе диаметром 20 мм) и elute на 0,5 м/мин.
- Соберите красную фракцию и удалите метанол под вакуум с помощью ротатора испарительного.
- Синтез сопряженного MNP@SiO2@NH@Fa
- Промыть 30 мг сухого MNP@SiO2@NH2 дважды с DMF и sonicate наночастицы в 100 мл Erlenmeyer колбу в течение 30 минут под инертной атмосферой.
- Приготовьте раствор NN-succinylferoxamine (200 мг, 0,30 ммоль), бензотриазол-1-ил-окс-трис-(диметиламино)-фосфоний гексафторосфат (БОП, 173 мг, 0,45 ммоль), 1-гидроксибензотриоз (HOBt, 46 мг, 0,39 ммоль) и N,N-diisopropythylamine (DIPEA, 128,8 мг, 1,21 ммоль) в 10 ммл DMF (Mix A) в 50 мЛ круглое дном в атмосфере.
- Приостановить ранее промыть MNP@SiO2@NH2 в 3 мЛ DMF под sonication в сухих в условиях, свободных от кислорода с использованием аргона газовой атмосферы (Mix B).
- Добавить смесь А, чтобы смешать B dropwise.
- Встряхните окончательную смесь с помощью орбитального шейкера при комнатной температуре на ночь.
- Отделите полученную конъюгированную (MNP@SiO2@NH@Fa) от подвески с помощью магнита.
- Промыть полученный твердый, а затем, sonicate его пять раз с 10 мл этанола.
- Высушите твердое тело под вакуумом на 24 ч.
2. Бактериальный анализ с штаммами Y. enterocolitica для количественной оценки улавливания патогенных бактерий с помощью наночастиц
- Подготовьте суспензию всех промежуточных наночастиц и окончательный конъюгации в PBS на 1 мг/мл в стерильных 2 мЛ трубках.
- Приготовьте культуру Y. enterocolitica в 5 мл бульона Лурия Бертани (LB) ночью инкубации при 37 градусов по Цельсию.
- Приготовьте 5 мл железа дефицитный триптический соевый бульон (TSB), добавив 50 мл 10 мМ 2,2'-bipyridyl.
- Прививайте 5 мл железа дефицитным TSB с 50 мл ночной культуры Y. enterocolitica, а затем, инкубировать при 37 градусов по Цельсию с агитацией до тех пор, пока не будет достигнут OD600 и 0.5'u20120.8.
- Возьмите 100 мл культуры, полученной в шаге 2.4 и разбавляйте в трубке 2,0 мл, содержащей 900 мл PBS, чтобы получить первое разбавление 1/10. Затем подготовьте разбавление 1/100 от первого разбавления с помощью той же процедуры, чтобы получить концентрацию бактериальных клеток на 1 х 106 колонии Формация единиц (CFU)/mL примерно.
- Добавьте 100 мл наночастиц суспензии при 1 мг/мл до 1 мл от 1/100 разбавления бактериальной подвески в трубке 2,0 мл и гомогенизировать вихрем.
- Инкубировать культуру при 20 градусов по Цельсию на 1 ч.
- Разделите агрегаты MNP/bacteria с помощью магнита и тщательно отбросьте супернатант.
- Промыть разделенные наночастицы дважды с 1 mL PBS с помощью вихря.
- Приостановите наночастицы в 1 мл PBS, чтобы подсчитать количество бактериального захвата в CFU/mL.
- Подготовка четырех последовательных 1/10 разбавления от бывшей подвески до 1 х 10-4 разбавления достигается.
- Плита 10 мл каждого разбавления на пластины агара TS и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в одночасье.
- Фотография пластины с гелевым диджитализатором в эпи-белом режиме. Обработайте изображение с соответствующим программным обеспечением для усиления пятна для подсчета количества отдельных колоний.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый промежуточный MNP был охарактеризован для наблюдения за ходом синтеза. Во-первых, голые депутаты были изучены XRD, чтобы проверить кристаллическую структуру. Затем, FT-IR спектр каждого промежуточного был запущен, чтобы проверить изменения, которые произошли в соответствующей реакции. Был также проведен анализ спектроскопии каждого промежуточного анализа Романа, с тем чтобы подтвердить выводы, сделанные из спектра FT-IR. Анализ TGA позволил оценить вес потери промежуточных веществ, несущих органический материал в его структуре. Морфология и размер каждого промежуточного были изучены TEM. Наконец, анализ XPS имеет решающее значение для определения состояния окисления атома на каждой промежуточной поверхности МНП и подтверждения образования ковалентных связей в конъюгированном MNP@SiO2@NH@Fa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для определения морфологии и свойств каждого промежуточного и окончательного спряжения проводится исчерпывающая структурная характеристика. Для этого для демонстрации формирования конъюгации используются методы XRD, FT-IR, Рамановской спектроскопии, TGA, TEM, EDX mapping и XPS. Состояния окисления атомов на поверхности наночастиц, приобретенные рентгеновской фотоэлектронной спектроскопией (XPS), являются наиболее актуальными данными, подтверждающими образование ковалентных связей между наночастицами и бокофором. В соответствии с этими результатами этот протокол воспроизводится.
Голые MNP, функционализированные MNPs и конъюгации смешиваются с каждым Y. enterocolitica штамма в решении PBS. Агрегаты бактерий-МНМп отделены от подвески с помощью магнита. После полоскания агрегатов дважды с PBS, они повторно приостановлены в PBS для подготовки серийных разбавлений, которые покрыты для подсчета колоний.
Промежуточные и окончательные спряжения, подготовленные с использованием этого протокола, были представлены нескольким методам отображения изменений, происходящих на каждом этапе синтеза. Инфракрасная и Рамановская спектроскопия представляют собой простой и быстрый способ мониторинга каждого шага синтеза. Присутствие характерных полос, соответствующих спектрам Si-O, C-Si-C, Fe-O, O'C amide, вибрации гидроксамической кислоты O'C-N в спектре FT-IR и Raman (см. ниже) были первыми индикаторами химических изменений, происходящих на поверхности магнитных наночастиц на каждом этапе синтеза.
Диффрактограмма XRD
На рисунке 1 показан анализ XRD, используемый для подтверждения состава и кристаллической структуры синтетических магнитных наночастиц (MNP) магнетита по сравнению с файлом JCPDS 00-003-0863.
Анализ TEM
Рисунок 2C отображает яркие пятна шаблона дифракции электронов, которые совпадают с (111), (220), (311), (400), (422), (511) и (440) дифракционных плоскостей магнетита, соответствующих d-интервалам 4,9, 2,9, 2,4, 2,0, 1,7, 1,6 и 1,4 евро соответственно. С другой стороны, на рисунке 2D и рисунке 4E показаны изображения TEM2MNP@SiO2@NH 2 @Fa, соответствующие рассеянным MNP частиц (10 нм), встроенным в аморфный неорганический органический материал. Толщина покрытия составляет более 10 нм.
Анализ EDX
На картах EDX отображается распределение элементов Fe, O, Si и C на поверхности. На рисунке 3A отчетливо видно присутствие Si на поверхности MNP@SiO2. После деентализации амина и спряжения с фероксамином, приращение C на поверхности наночастиц для MNP@SiO2@NH@Fa показано на рисунке 3B как свидетельство успешного спряжения.
ИК-анализ
FTIR спектры голые MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 и MNP@SiO2@NH@Fa показано на рисунке 4. Все спектры FTIR отображают начало полосы в спектральном диапазоне анализа на уровне 600 см-1, что было связано с вибрациями Fe-O. Наличие широкой полосы на 1050 см-1- связано с Si-O-Si растяжения вибрации-в FTIR спектра MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 и MNP@SiO2@NH@Fa подтвердил кремнезем покрытие.
Спектр FTIR MNP@SiO2 (рисунок 4) отображает широкую полосу между 830 и 1275 см-1 (Si-O облигаций); он становится более интенсивным после его функционализации с APTES в спектре FTIR MNP@SiO2@NH2, вероятно, из-за Si-C облигаций (ожидается между 1175 и 1250 см-1). Наконец, полосы на 2995 см-1 (C-H растяжения связей), 1640 см-1 (O'C-NH амиде II вибрации) и 1577 см-1 (O'C-N гидроксамической кислоты вибрации) наблюдается в спектре FTIR MNP@SiO2@NH@Fa подтвердил конъюгации фероксамина с наночастицами10.
Анализ термогравиметрии
Данные термогравиметрии приведены на рисунке 5,который отображает потерю веса из-за добавления органического материала и воды.
Анализ Романа
Покрытие кремнезема и функционализации голого MNP были также подтверждены Анализом Романа каждого промежуточного и MNP@SiO2@NH@Fa(рисунок 6). Все Спектры Рамана показывают пики на 305,8, 537,2 и 665,6 см-1,соответствующие вибрациям Fe-O(рисунок 6A)11, и плечо на пике на 713,5 см-1, относящиеся к вибрациям Si-O-Si(рисунок 6B)12. После функционализации APTES спектр MNP@SiO2@NH2 отображает интенсивные пики на уровне 1001,5 и 1027,4 см-1,что соответствует присутствию SiO2,и на 1578,6 и 1597,9 см-1,что подтверждает образование si-C облигаций. Кроме того, наличие плеча пика на уровне 703,0 см-1 также подтвердило наличие APTES(рисунок 6C)13,14. Наконец, широкий пик между 1490 и 1700 см-1 (в центре на 1581 см-1), соответствующие Si-C облигаций и амид групп в спектре Раман MNP@SiO2@NH@Fa, в согласии с формированием конъюгации (Рисунок 6D)14.
Анализ XPS
Изучение состояния окисления атомов на поверхности было проведено с помощью анализа XPS и подтвердило образование связей в структурах. На рисунке 7 показаны XPS спектры голых и различных функциональных MNPs. Для MNP, узкий пик в C1s может быть связано с примесями в обработке образца во время синтеза. Введение углерода наблюдается как C-C и C-H облигаций в MNP@SiO2@NH2 и MNP@SiO2@NH@Fa спектра. Анализ пика на 399 эВ в спектре N1s вместе с его затуханием, наблюдаемым в течение MNP@SiO2@NH@Fa подтверждает формирование амидных связей между MNP@SiO2@NH2 и фероксамином. Кроме того, существование N-O связи гидроксамических moieties находится в согласии с наличием пика на 402 eV. Наличие пика на 102 eV в Si2p узкие спектры во всех промежуточных и конъюгации в согласии с обязательной энергии для силоксан группы15,16.
Потенциал
Потенциальные значения отображаются в таблице 1. Результаты отрицательные, -25,21 и -29,35 мВ, по MNP и MNP@SiO2, соответственно. Функционализация с APTES, чтобы дать MNP@SiO2@NH2 изменила поверхностный заряд с отрицательного на положительный. Этот факт был приписан аминь групп и поверхностный заряд остается положительным для MNP@SiO2@NH@Fa. Положительная поверхность потенциал может объяснить взаимодействие между бактериями (чья поверхность является отрицательным) и спряжение17,18,19.
Бактерии захвата анализа
Количество клеток Y. enterocolitica WC-A и FoxA WC-A 12-8, захваченных с MNP промежуточных и MNP@SiO2@NH@Fa были количественно в тех разбавлений, где 40'u201260 колоний были разделены и легко визуализированы. Количество захваченных клеток голыми, MNP@SiO2,и MNP@SiO2@NH2 не показывает существенных различий между ними(рисунок 8). Электростатические силы из-за свободных групп амина в MNP@SiO2@NH2 и низкая концентрация рецептора фероксамина мембраны в бактериях может оправдать отсутствие ожидаемой связывающей специфичности.
Этот протокол может быть применен в синтезе различных типов конъюгированных веществ, в основном тех, которые используют карбодиимид химии. Это достаточно универсальный, чтобы ввести модификации для того, чтобы получить лучшие результаты. Полная характеристика всех промежуточных и окончательных спряжений, используя описанные методы, позволяет следить за каждым этапом синтеза и подтверждать формирование связи желания. Подсчет колоний в бактериях захвата анализа, используя 10 МЛ падение, позволяет проверить все образцы в то же время в одной пластине, что делает легче получить репликации и выполнять анализы в различных условиях.
Рисунок 1: Сравнение MNP (Fe3O4) (фиолетовый) и магнетитового рисунка (черный) диффрактограмм.
Эта цифра была изменена с Мартинес-Матаморос и др.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Яркое поле TEM и электронные дифракционные изображения голых MNP (A, B и C), а также MNP@SiO2@NH@Fa (D, E и F).
Изображения имеют среднее и высокое разрешение. Эта цифра была изменена с Мартинес-Матаморос и др.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: EDX карты MNP@SiO2: HAADF изображения и соответствующие Fe, Si, O и C карты A. MNP@SiO2 и B. MNP@SiO2@NH@Fa.
Эта цифра была изменена с Мартинес-Матаморос и др.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: FT-IR спектры голого оксида железа (Fe3O4) MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 и MNP@SiO2@NH@Fa (4).
Эта цифра была изменена с Мартинес-Матаморос и др.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Термогравиметрический анализ MNP, MNP@SiO2@NH2, и MNP@SiO2@NH@Fa.
Эта цифра была изменена с Мартинес-Матаморос и др.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Раман спектра голого оксида железа (Fe3O4) MNP (A), MNP@SiO2 (B), MNP@SiO2@NH2 (C) и MNP@SiO2@NH@Fa (D).
(*) APTES, (яп.) Другие фазы оксида железа, вероятно, формируется в результате преобразования магнетита лазерной энергии. Эта цифра была изменена с Мартинес-Матаморос и др.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: УЗКИе спектры XPS MNP, MNP@SiO2@NH2 и MNP@SiO2@NH@Fa. Эта цифра была изменена с Мартинес-Матаморос и др.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: CFU Y. enterocolitica захватили на 100 мкг магнитных наночастиц: голые, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 и MNP@SiO2@NH@Fa.
()WC-A (дикий тип) (B) FoxA WC-A 12-8 (мутант отсутствует рецептор фероксамина FoxA) и SEM изображение MNP@SiO2@NH@Fa взаимодействующих с Y. enterocolitica. Эта цифра была изменена с Мартинес-Матаморос и др.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
| Образец | Потенциал |
| Mnp | -25.21 |
| MNP@SiO2 | -29.35 |
| MNP@SiO2@NH2 | 17.03 |
| MNP@SiO2@NH@Fa | 22.14 |
| MNP@SiO2@NHBoc@Fa | 19.16 |
| MNP@SiO2@NHCOOH@Fa | 10.96 |
Таблица 1: Потенциальные измерения. Эта таблица была получена от Мартинес-Матаморос и др.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает синтез спряжения между магнитными наночастицами и бокофором фероксамином путем ковалентной связи. Синтез магнетита был проведен с использованием протокола, о которого сообщает Pinna et al.5 с последующим кремнеземным покрытием для защиты магнитного ядра коррозии в аквеи, чтобы свести к минимуму агрегацию и обеспечить подходящую поверхность для функционализации6. Был изменен процесс кремнеземного покрытия. Вместо того, чтобы проводить три покрытия, как сообщает Li et al.6,депутаты были покрыты двумя слоями кремнезема в этомметоде (Рисунок 2D),который был достаточно, чтобы продолжить с шагом функционализации с APTES7.
Дефероксамин был комплекс с железом (III), потому что он подвержен деградации в течение нескольких часов при комнатной температуре. Лучший способ получить железный комплекс – использовать ацетил ацетонат железа, потому что его очистка с помощью жидкой жидкости очень проста и фероксамин получается в количественном урожае. Фероксамин стабилен и может Nбыть изменен, чтобы дать N-succinylferoxamine с помощью succinic ангидрид, чтобы добавить терминальной кислой группы в качестве связучателя. Очистка по размеру исключения хроматографии позволяет удалить избыток сукцинического Nангидрида и сукциновой кислоты из N-succinylferoxamine.
Амин нанокомпозит был использован Nдля связи N-succinylferoxamine ковалентно на поверхности. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) не может быть использован для структурного выяснения продуктов из-за парамагнитного поведения оксида железа. По этой причине каждый шаг реакции отслеживался FT-IR, а затем подтверждался спектроскопией Романа. Пики деконволюции и фитинга были сделаны с удобным программным обеспечением, учитывая, что Спектры Романа включали десять мер 300 с общим временем измерения 3000 с. Морфология и размер измерялись ТЕМ, наблюдая за псевдосферическим магнетитом формы с однородным распределением размера 10 Нм(рисунок 2A,B). Измерение толщины конъюгированного покрытия показывает 10 нм однородного слоя(Рисунок 2D,E).
Очень трудно получить поле TEM, где наночастицы могут наблюдаться индивидуально из-за его магнитного характера и его склонности к агломерату. EDX отображение было использовано для получения информации о составе каждого элемента на поверхности(рисунок 3A). Плотность углерода была явно увеличена в конъюгированном MNP@SiO2@NHФа(Рисунок 3B) по сравнению с промежуточным MNP@SiO2.
Бактерии захвата анализ был разработан для того, чтобы проверить способность конъюгации для захвата бактерий через фероксамин наружной мембраны белка рецептора. Yersinia enterocolitica Штамм WC-A был выбран, потому что он выражает рецептор фероксамина FoxA и легко растет. Критическим шагом в этой процедуре было удаление не захваченных бактерий. Это было достигнуто путем полоскания и вихря с стерильными PBS дважды следуют восстановления бактерий конъюгированных агрегатов с помощью магнита. Количество захваченных клеток каждым из промежуточных MNP, используемых в качестве контроля, и сопряжение MNP@SiO2@NH@Fa определялись колонией, подсчитывая от метода разбавления. Использование 10 капель Л облегчает экспериментальную процедуру и позволяет обрабатывать более четырех образцов, снижающих стоимость теста с точки зрения времени и материала по сравнению с классическим методом подсчета бляшек колоний.
Наиболее важным ограничением синтеза MNP@SiO2@NH@Fa сопряжения является то, что невозможно подтвердить образование облигаций NMR. Хотя подготовка MNP@SiO2@NH@Fa представляется простой, использование методов структурной характеристики имеет решающее значение для подтверждения связи между боковым форором и MNP через ковалентную связь.
В соответствии с настоящим протоколом можно создавать конъюгации с использованием карбодиимидовой химии. Для достижения этой цели необходимо наличие аминокислот на поверхности MNPs и функции карбокцилиновой кислоты в комплексе интересов. Тестирование различных связующих и покрытие MNPs поверхности с другими функциональными группами, чтобы избежать создания положительных зарядов на нем может улучшить бактериальной дискриминации захвата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы с благодарностью признают профессора Клауса Хантке (Университет Тюбингена, Германия) за любезное снабжение штаммов Yersinia enterocolitica, используемых в этой работе. Эта работа была поддержана грантами AGL2015-63740-C2-1/2-R и RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, EU) от Государственного агентства по исследованиям (AEI) Испании, финансируемого программой FEDER от Европейского союза. Работа в Университете Сантьяго-де-Компостела и Университете А Корунья также была поддержана грантами GRC2018/018, GRC2018/039 и ED431E 2018/03 (стратегическая группа CICA-INIBIC) от Сюй-де-Галиции. Наконец, мы хотим поблагодарить Нурия Кальво за ее большое сотрудничество делать голос-офф этого видео-протокола.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
References
- Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).
- Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109 (10), 4580-4595 (2010).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17 (15), 3044-3049 (2005).
- Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76 (5), 484-489 (2010).
- Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
- El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129 (44), 13392-13393 (2007).
- Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9 (24), 13533-13542 (2019).
- Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788 (1-3), 1-6 (2006).
- Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174 (4), 424-430 (2003).
- González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320 (12), 92-99 (2003).
- Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14 (3-7), 1051-1056 (2005).
- You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93 (10), 103111-103113 (2008).
- Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603 (18), 2849-2860 (2009).
- Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).
- Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
- Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
- Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).
