Summary
Detta arbete beskriver protokoll för beredning av magnetiska nanopartiklar, dess beläggning med SiO2, följt av dess amin funktionalisering med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) och dess konjugation med deferoxamin med hjälp av en succinyl moiety som en länker. En djup strukturell karakterisering beskrivning och en fånga bakterier analys med Y. enterocolitica för alla mellanliggande nanopartiklar och den slutliga konjugat beskrivs också i detalj.
Abstract
I det nuvarande arbetet, syntesen av magnetiska nanopartiklar, dess beläggning med SiO2, följt av dess amin funktionalisering med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) och dess konjugation med deferoxamin, en siderophore erkänns av Yersinia enterocolitica, med hjälp av en succinyl moiety som en länkare beskrivs.
Magnetiska nanopartiklar (MNP) av magnetit (Fe3O4) har utarbetats med solvotermisk metod och belagda med SiO2 (MNP@SiO2) med stöberprocessen följt av funktionalisering med APTES (MNP@SiO2@NH2). Sedan var feroxamin konjugerad med MNP@SiO2@NH2 av carbodiimide koppling för att ge MNP@SiO2@NH2@Fa. Konjugatens och intermediärernas morfologi och egenskaper undersöktes av åtta olika metoder, inklusive pulverröntgendiffraktion (XRD), Fourier transform infrared spektroskopi (FT-IR), Raman spektroskopi, röntgenfotoelektronspektroskopi (XPS), transmissionselektronmikroskopi (TEM) och energidispersive X-Ray (EDX) kartläggning. Denna uttömmande karakterisering bekräftade bildandet av konjugat. Slutligen, för att utvärdera nanopartiklarnas kapacitet och specificitet, testades de i en analys av avskiljningsbakterier med hjälp av Yersinia enterocolitica.
Introduction
De metoder för detektion av bakterier som använder MNP baseras på molekylär igenkänning av antikroppar, aptamerer, bioprotein, kolhydrater som konjugerats till MNP av de patogena bakterierna1. Med hänsyn till att sideroforer känns igen av specifika receptorer på bakteriernas yttre membran, kan de också kopplas till MNP för att öka deras specificitet2. Siderophores är små organiska molekyler som deltar i Fe3 + upptag av bakterier3,,4. Beredningen av konjugat mellan siderophores och MNP tillsammans med deras utvärdering för fångst och isolering av bakterier har ännu inte rapporterats.
Ett av de avgörande stegen i syntesen av konjugat av magnetiska nanopartiklar med små molekyler är valet av typ av bindning eller interaktion mellan dem för att säkerställa att den lilla molekylen är fäst vid MNP:s yta. Av denna anledning var förfarandet för att förbereda konjugatet mellan magnetiska nanopartiklar och feroxamin-siderophore erkänns av Yersinia enterocolitica-fokuseradepå generering av en modifierbar yta av MNP att tillåta att koppla den kovalent till siderofor av karbodiimid kemi. För att få en enhetlig magnetit nanopartiklar (MNP) och för att förbättra kärnbildning och storlekskontroll, en solvolys reaktion med bensylalkohol bars i ett termiskt block utan skakning5. Därefter genererades en kiseldioxidbeläggning med Stöber-metoden för att ge skydd och förbättra stabiliteten hos nanopartiklarnas suspension i vattenhaltigt medium6. Med hänsyn till feroxaminens struktur är införandet av amingrupper nödvändigt för att producera lämpliga nanopartiklar (MNP@SiO2@NH2) som skall konjugeras med sideroforen. Detta uppnåddes genom kondensering av (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) med de alkoholgrupper som finns på ytan av de kiseldioxidmodifierade nanopartiklarna (MNP@SiO2) med hjälp av en sol-gel metod7.
Parallellt med detta har feroxaminjärn(III) komplexet utarbetats genom complexation av kommersiellt tillgängliga deferoxamin med järn acetylactonat i vattenlösning. N-succinylferoxamine, med succinyl grupper som kommer att fungera som länkare, erhölls genom reaktionen av feroxamin med succinic anhydride.
Konjugationen mellan MNP@SiO2@NH2 och N-succinylferoxamin för att ge MNP@SiO2@NH@Fa utfördes genom karbodiimidkemi med hjälp av som kopplingsreagenser benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimetylamino)-fosfonium hexafluorophosphate (BOP) och 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) i en mjuk basmedia för att aktivera terminalsyragruppen i N-succinylferoxamin8.
När MNPs karakteriserades, utvärderade vi funktionerna hos nakna och funktionella magnetiska nanopartiklar för att fånga vilda typer (WC-A) och en mutant av Y. enterocolitica saknar feroxaminreceptor FoxA (FoxA WC-A 12-8). Vanliga parlamentsledamöter, funktionaliserade parlamentsledamöter och konjugat MNP@SiO2@NH@Fa fick interagera med varje Y. enterocolitica stam. Bakteriekonjugataggregaten separerades från bakterieupphängningen genom tillämpning av ett magnetfält. De separerade aggregat sköljdes två gånger med fosfat buffrad saltlösning (PBS), åter avbrytas i PBS att förbereda seriell utspädningar och sedan var de pläterade för kolonin räkna. Detta protokoll visar varje steg i syntesen av MNP@SiO2@NH@Fa, den strukturella karakterisering av alla intermediärer och konjugat, och en bakterie fånga analys som ett enkelt sätt att utvärdera specificitetkonjugat i förhållande till intermediärer. 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: För de reaktioner som utfördes under inert atmosfär villkor, var alla glas tidigare torkas i en ugn vid 65 °C, förseglade med en gummi septum och rensas med argon tre gånger.
1. Syntes av magnetiska nanopartiklar konjugerade med feroxamin
- Syntes av Fe3O4 magnetiska nanopartiklar (MNPs)
- Tillsätt 0,5 g Fe(acac)3 i en 20 ml glasflaska och blanda sedan med 10 ml bensylalkohol.
- Sonicate denna blandning i 2 min, sedan överföra till ett värmeblock och värme vid 180 °C för 72 h.
- När reaktionen är klar, låt injektionsflaskan svalna, skölj nanopartiklarna med 96% etanol och centrifug på 4000 x g i 30 min. Upprepa centrifugeringen minst två gånger.
- Separera nanopartiklarna från supernatanten genom magnetisk attraktion med hjälp av en neodymmagnet (NdFeB) och kassera restlösningsmedlet.
- Skölj med 96% etanol upprepande steg 1.1.4. och kasta supernatant omväxlande med ultraljudsbehandling i ett bad i 1 min vid 40 kHz tills lösningsmedlet ser klart.
- Magnetiska nanopartiklar SiO2 beläggning (MNP@SiO2)
- Förbered en suspension på 2 g MNP i 80 ml isopropanol och tillsätt sedan 4 ml 21% ammoniak, 7,5 ml destillerat vatten och 0,56 ml tetraetyl ortosiliat (TEOS) (i denna ordning) i en rund bottenkolv med en magnetisk omrörstång.
- Värm blandningen vid 40 °C i 2 timmar med kontinuerlig omrörning och sedan sonikerat i 1 h.
- Separera MNP med en magnet, kasta supernatanten och sprid den i 30 ml isopropanol.
- Upprepa steg 1.2.1. och 1.2.2.
- Ta bort och tvätta den magnetiska omrörstången med 96% etanol för att återvinna allt material.
- Separera nanopartiklarna från supernatanten med magnetisk attraktion med hjälp av en magnet.
- Kasta supernatant och skölj nanopartiklar med 96% etanol tre gånger omväxlande med ultraljudsbehandling.
- Torka nanopartiklarna under vakuum vid rumstemperatur i 12 timmar.
- Funktionalisering av MNP@SiO2 med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES)
- Skölj 500 mg av MNP@SiO2 som erhållits från föregående steg med N,N-dimetylformamid (DMF) under inert atmosfär och sedan sonikera i 1 min vid 40 kHz. Kasta sedan supernatanten och upprepa den här processen tre gånger.
- Åter avbryta partiklarna i en rund bottenkolv under omrörning med en magnetisk omrörstång och tillsätt 9 ml APTES.
- Rör om blandningen vid 60 °C i 12 timmar.
- Kasta supernatant och skölj nanopartiklar med 96% etanol tre gånger omväxlande med ultraljudsbehandling.
- Syntes av feroxamin
- Lös 100 mg (0,15 mmol) deferoxaminmysylatsalt och 53,0 mg Fe(acac)3 i 5 ml destillerat vatten och rör om blandningen över natten vid rumstemperatur.
- Tvätta den resulterande produkten tre gånger med 20 ml EtOAc i en separationstratt och ta sedan bort det organiska lösningsmedlet under vakuum med hjälp av en rotatory förångare.
- Frystorka vattenfasen för att ge feroxamin som ett rött fast ämne.
- Syntes av N-succinylferoxamin
- Tillsätt 350 mg (3,50 mmol) konnisk anhydrid till en lösning på 100 mg feroxamin i 5 ml pyridin i en 50 ml rund bottenkolv under inert atmosfär.
- Rör om den resulterande blandningen i rumstemperatur i 16 h. Efter den tiden, ta bort överskottet av pyridin under minskat tryck i en ruttnande förångare för att ge en mörkröd fast.
- Lös upp reaktionen rå i 3 ml metanol.
- Överför metanollösningen till en Sephadex-kolonn (20 cm Sephadex i en kolonn med diametern 20 mm) och eluterade vid 0,5 ml/min.
- Samla upp den röda fraktionen och ta bort metanolen under vakuum med hjälp av en ruttnande förångare.
- Syntes av konjugat MNP@SiO2@NH@Fa
- Skölj 30 mg torr MNP@SiO2@NH2 gånger med DMF och sonikera nanopartiklarna i en 100 ml Erlenmeyerkolv i 30 minuter under inert atmosfär.
- Bered en lösning av N-succinylferoxamin (200 mg, 0,30 mmol), bensotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimetylamino)-fosfoniumhexafluorfosfat (BOP, 173 mg, 0,45 mmol), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt, 46 mg, 0,39 mmol) och N,N-diisopropylylamin (DIPEA, 128,8 mg, 1,21 mmol) i 10 ml DMF (Mix A) i en 50 ml rund bottenkolv under inert atmosfär.
- Suspend den tidigare sköljda MNP@SiO2@NH2 i 3 ml DMF under ultraljudsbehandling i torr under syrefria förhållanden med hjälp av en argon gas atmosfär (Mix B).
- Tillsätt blanda A för att blanda B dropwise.
- Skaka den sista blandningen med hjälp av en orbital shaker vid rumstemperatur över natten.
- Separera den resulterande konjugat (MNP@SiO2@NH@Fa) från suspensionen med hjälp av en magnet.
- Skölj den resulterande fasta och sedan, sonicate det fem gånger med 10 ml etanol.
- Torka fast fast under vakuum i 24 timmar.
2. Bakteriell analys med Y. enterolitica stammar för att kvantifiera avskiljning av patogena bakterier med nanopartiklar
- Förbered en suspension av alla mellanliggande nanopartiklar och det slutliga konjugatet i PBS vid 1 mg/ml i sterila 2 ml-rör.
- Förbered en kultur av Y. enterocolitica i 5 ml Luria Bertani (LB) buljong över natten inkubera vid 37 °C.
- Förbered en 5 ml järn brist tryptic sojabuljong (TSB) genom att lägga till 50 μL av 10 mM 2,2′-bipyridyl.
- Inokulera 5 ml järn brist TSB med 50 μL av natten kultur Y. enterocolitica och sedan, inkubera vid 37 °C med agitation tills en OD600 = 0,5\u20120.8 uppnås.
- Ta 100 μL av den odling som erhålls i steg 2.4 och späd i ett 2,0 ml-rör som innehåller 900 μl PBS för att erhålla en första 1/10 utspädning. Förbered sedan en 1/100 utspädning från den första utspädningen med samma förfarande för att få en koncentration av bakterieceller vid 1 x 106 koloniformningsenheter (CFU)/ml ungefär.
- Tillsätt 100 μl nanopartiklar suspension vid 1 mg/ml till 1 ml av 1/100 utspädning av bakteriell suspension i en 2,0 ml rör, och homogenisera med virvel.
- Inkubera kulturen vid 20 °C i 1 h.
- Separera MNP/bakteriernas aggregat med hjälp av en magnet och kassera supernatanten försiktigt.
- Skölj de separerade nanopartiklarna två gånger med 1 ml PBS med hjälp av en virvel.
- Suspendera nanopartiklarna i 1 ml PBS för att räkna mängden bakteriell avskiljning i CFU/ml.
- Förbered fyra på varandra följande 1/10 utspädningar från den tidigare suspensionen tills en 1 x 10-4 utspädning uppnås.
- Platta 10 μL av varje utspädning på TS agarplattor och ruva dem vid 37 °C över natten.
- Fotografera plattan med en geldigerisator i epivitt läge. Bearbeta avbildningen med en lämplig programvara för att förstärka en plats för att räkna antalet enskilda kolonier.
OBS: Varje MNP mellanliggande kännetecknades för att följa upp utvecklingen av syntesen. För det första studerades nakna parlamentsledamöter av XRD för att kontrollera den kristallina strukturen. Sedan kördes FT-IR-spektrumet för varje mellanliggande för att kontrollera de förändringar som inträffade i motsvarande reaktion. Raman spektroskopi analys av varje mellanliggande genomfördes också för att bekräfta de slutsatser som följer av FT-IR spektra. TGA analys tillät oss att uppskatta förlustvikten av intermediärer som bär organiskt material i sin struktur. Morfologi och storleken på varje mellanliggande studerades av TEM. Slutligen var XPS-analysen avgörande för att fastställa atomoxidationstillstånden vid varje MNP-mellanyta och bekräfta kovalent bindningsbildningen i konjugatet MNP@SiO2@NH@Fa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En uttömmande strukturell karakterisering utförs för att bestämma morfologi och egenskaperna hos varje mellanliggande och den slutliga konjugat. För detta ändamål används teknikerna XRD, FT-IR, Raman spektroskopi, TGA, TEM, EDX-kartläggning och XPS för att påvisa konjugatets bildande. Atomernas oxidationstillstånd vid ytan av de nanopartiklar som förvärvats genom röntgenfotoelektronspektroskopi (XPS) är de mest relevanta uppgifterna för att bekräfta bildandet av kovalenta bindningar mellan nanopartikeln och sideroforen. I samförstånd med dessa resultat kan detta protokoll reproduceras.
Bare MNP, functionalized MNPs och konjugat blandas med varje Y. enterocolitica stam i PBS-lösning. Bakterie-MNPs aggregat separeras från suspensionen med hjälp av en magnet. Efter sköljning av aggregaten två gånger med PBS, de åter avbrytas i PBS för att förbereda seriella utspädningar som är pläterade för koloniräkning.
Intermediärer och den slutliga konjugat som utarbetats med hjälp av detta protokoll överlämnades till flera tekniker för att visa de förändringar som sker i varje steg i syntesen. Infraröd och Raman spektroskopi utgör ett enkelt och snabbt sätt att övervaka varje steg i syntesen. Förekomsten av karakteristiska band som motsvarar Si-O, C-Si-C, Fe-O, O = C mitt vibrationer, O = C-N hydroxamin syra vibrationer i FT-IR och Raman (se nedan) spektra var de första indikatorerna på de kemiska förändringar som ägde rum på ytan av de magnetiska nanopartiklar i varje steg av syntesen.
XRD-diffractogram
Figur 1 visar den XRD-analys som används för att bekräfta sammansättningen och kristallinstrukturen hos de syntetiska magnetiska nanopartiklarna (MNP) av magnetit i jämförelse med JCPDS-filen 00-003-0863.
TEM-analys
Figur 2C visar ljuspunkter i elektrondiffraktionsmönstret som matchar med (111), (220), (311), (400), (422), (511) och (440) diffraktionsplan av magnetit motsvarande d-avstånd på 4,9, 2,9, 2,4, 2,0, 1,7, 1,6 respektive 1,4 Å. Å andra sidan visar figur 2D och figur 4E TEM-bilder av MNP@SiO2@NH2@Fa motsvarande spridda MNP-partiklar (~10 nm) inbäddade i det amorfa oorganiska organiska materialet. Beläggningen tjocklek är över ~ 10 nm.
EDX-analys
EDX kartor visar fördelningen av elementen Fe, O, Si och C på ytan. Figur 3A visar tydligt förekomsten av Si på ytan av MNP@SiO2. Efter aminfunktionalisering och konjugering med feroxamin visas ökningen av C på nanopartiklarnas yta MNP@SiO2@NH@Fa i figur 3B som ett bevis på en lyckad konjugation.
IR-analys
FTIR-spektra av nakna MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 och MNP@SiO2@NH@Fa visas i figur 4. Alla FTIR-spektra visar början av ett band inom analysens spektralområde vid 600 cm-1 som var relaterad till Fe-O-vibrationer. Närvaron av ett brett band på 1050 cm-1 -1-tillskrivs Si-O-Si stretching vibrationer-i FTIR spektra av MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 och MNP@SiO2@NH@Fa bekräftade kiseldioxid beläggning.
FTIR-spektrumet på MNP@SiO2 (figur 4) visar ett brett band mellan vid 830 och 1275 cm-1 (Si-O-bindning). det blir mer intensivt efter dess functionalization med APTES i FTIR-spectrumen av MNP@SiO2@NH2, antagligen tack vare Si-C-förbindelsen (förväntat mellan 1175 och 1250 cm-1). Slutligen, banden på 2995 cm-1 (C-H stretching obligationer), 1640 cm-1 (O = C-NH amid II vibrationer) och 1577 cm-1 (O = C-N hydroxaminsyra vibrationer) observerats i FTIR spektrum av MNP@SiO2@NH@Fa bekräftade konjugation av feroxamin med nanopartiklar10.
Termogravimetrianalys
Termogravimetridata visas i figur 5, som visar viktminskningen på grund av tillsats av organiskt material och vatten.
Raman analys
Kiseldioxidbeläggningen och funktionaliseringen av den nakna MNP bekräftades också genom Raman-analys av varje mellanliggande och MNP@SiO2@NH@Fa (figur 6). Alla Raman spektra visar toppar på 305,8, 537,2 och 665,6 cm-1, motsvarande Fe-O vibrationer (figur 6A)11, och en axel på toppen på 713,5 cm-1, som avser Si-O-Si vibrationer(figur 6B)12. Efter APTES-funktionalisering visar Raman-spektrumet på MNP@SiO2@NH2 intensiva toppar på 1001,5 och 1027,4 cm-1, vilket motsvarar förekomsten av SiO2, och vid 1578,6 och 1597,9 cm-1, vilket bekräftar bildandet av Si-C-bindningar. Dessutom bekräftade närvaron av en axel av toppen på 703,0 cm-1 också förekomsten av APTES (figur 6C)13,14. Slutligen är den breda toppen mellan 1490 och 1700 cm-1 (centrerad på ~1581 cm-1),motsvarande Si-C-obligationer och blandgrupper i Raman-spektrumet på MNP@SiO2@NH@Fa, överens med bildandet av konjugatet (figur 6D)14.
XPS-analys
Studien av atomernas oxidationstillstånd på ytan utfördes av XPS-analys och bekräftade bindningsbildningen i strukturerna. Figur 7 visar XPS-spektra för de nakna och olika funktionaliserade mnps. För MNP kan en smal topp i C1:or bero på föroreningar vid hantering av provet under syntesen. Införandet av kol observeras som C-C- och C-H-bindningar i MNP@SiO2@NH2 och MNP@SiO2@NH@Fa spektra. Analysen av toppen på 399 eV i N1s spektra tillsammans med dess dämpning observerats för MNP@SiO2@NH@Fa bekräftar bildandet av amidbindningar mellan MNP@SiO2@NH2 och feroxamin. Dessutom är förekomsten av N-O-band av hydroxiska moieties i samförstånd med förekomsten av en topp på 402 eV. Förekomsten av en topp på 102 eV i Si2p smala spektra i alla intermediärer och konjugat är överens med bindande energi för siloxan grupp15,16.
Z Potential
Z-potentiella värden visas i tabell 1. Resultaten är negativa, -25,21 respektive -29,35 mV, för MNP respektive MNP@SiO2. Funktionalisering med APTES för att ge MNP@SiO2@NH2 ändrade ytladdningen från negativ till positiv. Detta faktum tillskrevs amingrupperna och ytladdningen är fortfarande positiv för MNP@SiO2@NH@Fa. Den positiva ytan Z potential kan förklara samspelet mellan bakterier (vars yta är negativ) och konjugat17,18,19.
Bakterier fånga analys
Antalet celler i Y. enterocolitica WC-A och FoxA WC-A 12-8 fångas med MNP intermediärer och MNP@SiO2@NH@Fa kvantifierades i de utspädningar där 40\u201260 kolonier separerades och lätt visualiserades. Antalet fångade celler med nakna, MNP@SiO2och MNP@SiO2@NH2 visar inga signifikanta skillnader mellan dem (figur 8). De elektrostatiska krafterna på grund av fria amingrupper i MNP@SiO2@NH2 och den låga koncentrationen av feroxaminmembranreceptor hos bakterier kan motivera bristen på förväntad bindningss specificitet.
Detta protokoll skulle kunna tillämpas i syntesen av olika typer av konjugat, främst de som använder carbodiimide kemi. Den är mångsidig nog att införa ändringar för att få bättre resultat. Den fullständiga karakteriseringen av alla intermediärer och det slutliga konjugatet, med hjälp av de beskrivna teknikerna, gör det möjligt för en att följa varje steg i syntesen och bekräfta bildandet av lustbindningen. Räkna av kolonier i bakterierna fånga analysen, med hjälp av en 10 μL droppe, gör det möjligt för en att testa alla prover samtidigt i en platta som gör det lättare att få replikerar och utföra analyser under olika förhållanden.
Figur 1: Jämförelse av MNP (Fe3O4) (lila) och magnetitmönster (svart) diffractogram.
Denna siffra har ändrats från Martínez-Matamoros et al.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Ljusa fält TEM- och elektrondiffractionbilder av nakna MNP (A, B och C) och MNP@SiO2@NH@Fa (D, E och F).
Bilderna har medelhöga och höga upplösningar. Denna siffra har ändrats från Martínez-Matamoros et al.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: EDX kartor över MNP@SiO2:HAADF bild och motsvarande Fe, Si, O och C kartor över A. MNP@SiO2 och B. MNP@SiO2@NH@Fa.
Denna siffra har ändrats från Martínez-Matamoros et al.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: FT-IR-spektra av bar järnoxid (Fe3O4) MNP, MNP@SiO2,MNP@SiO2@NH2 och MNP@SiO2@NH@Fa (4).
Denna siffra har ändrats från Martínez-Matamoros et al.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Termogravimetrisk analys av MNP, MNP@SiO2@NH2och MNP@SiO2@NH@Fa.
Denna siffra har ändrats från Martínez-Matamoros et al.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Ramanspektra av bar järnoxid (Fe3O4) MNP (A), MNP@SiO2 (B), MNP@SiO2@NH2 (C) och MNP@SiO2@NH@Fa (D).
(*) APTES, (**) Andra järnoxidfaser, troligen bildade av omvandlingen av magnetit av laserkraften. Denna siffra har ändrats från Martínez-Matamoros et al.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: XPS smala spektra av MNP, MNP@SiO2@NH2 och MNP@SiO2@NH@Fa. Denna siffra har ändrats från Martínez-Matamoros et al.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: CFU av Y. enterocolitica som fångas per 100 μg magnetiska nanopartiklar: nakna, MNP@SiO2,MNP@SiO2@NH2 och MNP@SiO2@NH@Fa.
(A)WC-A (vild typ) (B) FoxA WC-A 12-8 (mutant saknar feroxaminreceptor FoxA) och SEM bild av MNP@SiO2@NH@Fa interagerar med Y. enterocolitica. Denna siffra har ändrats från Martínez-Matamoros et al.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Prov | Z Potential |
| Mnp | -25.21 |
| MNP@SiO2 | -29.35 |
| MNP@SiO2@NH2 | 17.03 |
| MNP@SiO2@NH@Fa | 22.14 |
| MNP@SiO2@NHBoc@Fa | 19.16 |
| MNP@SiO2@NHCOOH@Fa | 10.96 |
Tabell 1: Z potentiella mätningar. Denna tabell har erhållits från Martínez-Matamoros et al.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver syntesen av en konjugat mellan magnetiska nanopartiklar och siderophore feroxamin genom kovalent bindning. Syntesen av magnetit utfördes med hjälp av det protokoll som rapporterats av Pinna et al.5 följt av kiseldioxidbeläggning för att skydda korrosions magnetiska kärna i vattensystem, för att minimera aggregering och för att ge en lämplig yta för funktionalisering6. Kiseldioxidbeläggningsprocessen ändrades. Istället för att utföra tre beläggningar som rapporterats av Li et al.6,var mnps belagd med två kiseldioxid lager i denna metod (figur 2D) som var tillräckligt för att fortsätta med funktionalisering steg med APTES7.
Deferoxamin var komplex med järn (III) eftersom det är mottagliga för nedbrytning inom några timmar vid rumstemperatur. Det bästa sättet att få järnkomplexet är att använda järnacetylacetonat eftersom dess rening genom vätske-flytande extraktion är mycket enkel och feroxamin erhålls i en kvantitativ avkastning. Feroxamin är stabil och kan Nmodifieras för att ge N-succinylferoxamin med hjälp av bärnstenssyraanhydrid för att lägga till en terminal sur grupp som en länkare. Reningen efter storlek uteslutning kromatografi tillåter avlägsnande av överskottet av bärnstenssyra anhydrid och bärnstenssyra från N-succinylferoxamin. N
Amin nanokomposit användes för att länka N-succinylferoxamine covalently på ytan. Kärn- magnetisk resonans (NMR) kan inte användas för den strukturella klareringen av produkterna tack vare det paramagnetiska uppförandet av stryka oxid. Av denna anledning övervakades varje reaktionssteg av FT-IR och bekräftades sedan av Raman spektroskopi. Peaks deconvolution och montering gjordes med en bekväm programvara med hänsyn till att Raman spektra ingår tio åtgärder på 300 s med en total måtttid på 3.000 s. Morfologi och storlek mättes av TEM observera pseudosfäriska form magnetit med en homogen storleksfördelning på 10 nm (figur 2A,B). Konjugatbeläggningens tjockleksmått visar ett homogent skikt på 10 nm (figur 2D,E).
Det är mycket svårt att få ett TEM-fält där nanopartiklar kan observeras individuellt på grund av dess magnetiska karaktär och dess tendens att agglomerera. EDX-kartläggning användes för att få information om sammansättningen av varje element på ytan (figur 3A). Koltätheten ökade klart i konjugatet MNP@SiO2@NH@Fa (figur 3B) i förhållande till den mellanliggande MNP@SiO2.
Bakterien fånga analysen utformades för att testa förmågan hos konjugat att fånga bakterier genom feroxamin yttre membran proteinreceptorn. Yersinia enterocolitica WC-A stam valdes eftersom det uttrycker FoxA feroxamin receptorn och är lätt att växa. Det kritiska steget i detta förfarande var avlägsnandet av icke-fångade bakterier. Detta uppnåddes genom sköljning och virvlande med steril PBS två gånger följt av att återvinna bakterier-konjugat aggregat med hjälp av en magnet. Antalet fångade celler av var och en av MNP mellanliggande, används som kontroll, och konjugat MNP@SiO2@NH@Fa fastställdes genom kolonin räkna från utspädning metod. Genom att använda 10 μl droppar underlättas det experimentella förfarandet och gör det möjligt att hantera mer än fyra prover vilket minskar kostnaden för testet i fråga om tid och material jämfört med den klassiska metoden för skylträkning kolonier.
Den viktigaste begränsningen av syntesen av MNP@SiO2@NH@Fa konjugat är att det inte är möjligt att bekräfta bindningsbildningen av NMR. Även om beredningen av MNP@SiO2@NH@Fa verkar enkel, är användningen av den strukturella karakteriseringstekniker avgörande för att bekräfta kopplingen mellan siderophore och MNP genom en kovalent bindning.
Enligt detta protokoll är det möjligt att generera konjugat med hjälp av karbodiimidkemi. För att uppnå detta är förekomsten av aminogrupper på MNPs yta och en karboxylsyra funktionalitet i föreningen av intresse nödvändigt. Testa olika länkare och beläggning MNPs ytan med andra funktionella grupper för att undvika att skapa positiva avgifter på det kan förbättra bakteriell fånga diskriminering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt professor Klaus Hantke (Universitetar av Tübingen, Tyskland) för vänligt tillförsel Yersiniaen enterocolitica anstränger använt i detta arbete. Detta arbete stöddes av bidragen AGL2015-63740-C2-1/2-R och RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, EU) från den statliga forskningsbyrån (AEI) i Spanien, som medfinansieras av Feder-programmet från Europeiska unionen. Arbetet vid universitetet i Santiago de Compostela och universitetet i A Coruña stöddes också av bidrag GRC2018/018, GRC2018/039 och ED431E 2018/03 (CICA-INIBIC strategisk grupp) från Xunta de Galicien. Slutligen vill vi tacka Nuria Calvo för hennes stora samarbete gör voice-off detta videoprotokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
References
- Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).
- Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109 (10), 4580-4595 (2010).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17 (15), 3044-3049 (2005).
- Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76 (5), 484-489 (2010).
- Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
- El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129 (44), 13392-13393 (2007).
- Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9 (24), 13533-13542 (2019).
- Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788 (1-3), 1-6 (2006).
- Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174 (4), 424-430 (2003).
- González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320 (12), 92-99 (2003).
- Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14 (3-7), 1051-1056 (2005).
- You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93 (10), 103111-103113 (2008).
- Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603 (18), 2849-2860 (2009).
- Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).
- Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
- Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
- Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).
