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Chemistry

कार्यात्मक चुंबकीय नैनोकणों का संश्लेषण, साइडरोपोर फेरोक्सामाइन के साथ उनका संवजन और बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए इसका मूल्यांकन

Published: June 16, 2020 doi: 10.3791/60842
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 3, 1
1Centro de Investigacións Científicas Avanzadas (CICA), Departamento de Química, Facultade de Ciencias, Universidade da Coruña, 2Centro de Investigacións Científicas Avanzadas (CICA), Unidad de Comunicación y Divulgación, Universidade da Coruña, 3Department of Microbiology and Parasitology, Institute of Aquaculture, Universidade de Santiago de Compostela

Summary

यह काम चुंबकीय नैनोकणों की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है,एसआईओ 2के साथ इसकी कोटिंग, इसके बाद (3-अमीनोप्रोपिल) ट्राइथॉक्सीलेन (एपीटीईएस) और एक लिंकर के रूप में एक संक्षिप्त मोइज़िटी का उपयोग करके डिफरोक्सामाइन के साथ इसका संयुग्मणकरण के साथ इसके समान कार्यात्मकता के बाद। सभी मध्यवर्ती नैनोकणों और अंतिम संयुग्म के लिए वाई एंटोकोलिटिका का उपयोग करके एक गहरी संरचनात्मक लक्षण वर्णन और कैप्चर बैक्टीरिया परख का भी विस्तार से वर्णन किया गया है।

Abstract

वर्तमान कार्य में, चुंबकीय नैनोकणों का संश्लेषण, एसआईओ2के साथ इसकी कोटिंग, इसके बाद (3-अमीनोप्रोपिल) ट्राइथॉक्सीलेन (एपीटीईएस) के साथ इसके अमीन कार्यात्मककरण और डिफरोक्सामाइन के साथ इसके संयुग्मण, यरसिनिया एंटोओक्लिटिकाद्वारा मान्यता प्राप्त एक साइडरोपोर, एक लिंकर के रूप में एक संक्षिप्तता मोइसाइट का उपयोग करके वर्णित किया जाता है।

मैग्नेटाइट (फे3ओ4)के चुंबकीय नैनोकण (एमएनपी) को सॉल्वथोथर्मल विधि द्वारा तैयार किया गया था और स्ओबर प्रक्रिया का उपयोग करकेएसआईओ 2 (MNP@SiO2)के साथ लेपित किया गया था जिसके बाद एपीटीईएस (MNP@SiO 2 @NH2)के साथ कार्यात्मकता का उपयोग कियागयाथा। फिर, फेरोक्सामाइन को कार्बोडिमाइड कपलिंग द्वारा MNP@SiO2@NH2 के साथ संयुग्मित किया गया ताकि MNP@SiO2@NH2@Fa दिया जा सके। कंजूगेट और इंटरमीडिएट के आकृति विज्ञान और गुणों की जांच पाउडर एक्स-रे विवर्तन (एक्सआरडी), फोरियर ट्रांसफॉर्म इंफ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफटी-आईआर), रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी, एक्स-रे फोटोइलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी (एक्सपीएस), ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टेम) और एनर्जी डिस्परिव एक्स-रे (ईडीएक्स) मैपिंग सहित आठ विभिन्न तरीकों से की गई । इस संपूर्ण लक्षण वर्णन ने संजूगेट के गठन की पुष्टि की। अंत में, नैनोकणों की क्षमता और विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए, वे यरसिनिया एंटोकोलिटिकाका उपयोग करके एक कैप्चर बैक्टीरिया परख में परीक्षण किए गए थे।

Introduction

एमएनपी का उपयोग करने वाले बैक्टीरिया का पता लगाने के तरीके रोगजनक बैक्टीरिया1द्वारा एमएनपी को संयोजित एंटीबॉडी, एप्टामर, बायोप्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट की आणविक मान्यता पर आधारित हैं। इस बात को ध्यान में रखते हुए कि बैक्टीरिया की बाहरी झिल्ली पर विशिष्ट रिसेप्टर्स द्वारा साइडोफोरस को पहचाना जाता है, वे अपनी विशिष्टता2को बढ़ाने के लिए एमएनपी से भी जुड़ सकते हैं। साइडरोफोरसबैक्टीरिया3,4द्वारा फे3 + तेज में शामिल छोटे कार्बनिक अणु हैं। बैक्टीरिया को पकड़ने और अलगाव के लिए उनके मूल्यांकन के साथ-साथ साइडोफोरस और एमएनपी के बीच संयोजित करने की तैयारी की अभी रिपोर्ट नहीं की गई है ।

छोटे अणुओं के साथ चुंबकीय नैनोकणों के संवधांव के संश्लेषण में महत्वपूर्ण चरणों में से एक यह सुनिश्चित करने के लिए कि छोटे अणु एमएनपी की सतह से जुड़ा हुआ है, उनके बीच बांड या बातचीत के प्रकार का चयन है। इस कारण से, चुंबकीय नैनोकणों और फेरोक्सामाइन के बीच संजूगेट तैयार करने की प्रक्रिया- येर्सिनिया एंटोकोलिटिकाद्वारा मान्यता प्राप्त साइडरोपोर - एमएनपी की एक संशोधित सतह की पीढ़ी पर केंद्रित थी ताकि इसे कार्बोडिमाइड रसायन द्वारा साइडरोपोर से जोड़ने की अनुमति दी जा सके। एक समान मैग्नेटाइट नैनोकणों (एमएनपी) को प्राप्त करने और नाभिक और आकार नियंत्रण में सुधार करने के लिए, बेंजाइल अल्कोहल के साथ एक सोल्डोलिसिस प्रतिक्रिया 5 मिलातेहुएबिना थर्मल ब्लॉक में ले जाया गया था। फिर, जलीय मीडिया6में नैनोकणों के निलंबन की सुरक्षा और स्थिरता में सुधार करने के लिए स्टोबर विधि द्वारा एक सिलिका कोटिंग उत्पन्न की गई थी। फेरोक्सामाइन की संरचना को ध्यान में रखते हुए, साइडरोपोर के साथ संयुग्मित होने के लिए उपयुक्त नैनोकणों (MNP@SiO2@NH2)का उत्पादन करने के लिए अमीन समूहों की शुरूआत आवश्यक है। यह एक सोल-जेल विधि7का उपयोग करके सिलिका संशोधित नैनोकणों (MNP@SiO2)की सतह पर मौजूद अल्कोहल समूहों के साथ (3-अमीनोप्रोपिल) ट्राइएथॉक्सीलेन (एपीटीईएस) के संघनन द्वारा प्राप्त किया गया था।

इसके समानांतर, फेरोक्सामाइन आयरन (III) परिसर को जलीय समाधान में लोहे की एसीटाइल एसिटोनेट के साथ वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध डेफरोक्सामाइन के परिसर द्वारा तैयार किया गया था। Nएन-succinylferoxamine, succinyl समूहों है कि लिंकर्स के रूप में कार्य करेंगे असर, succinic anhydride के साथ feroxamine की प्रतिक्रिया से प्राप्त किया गया था ।

MNP@SiO2@NH2 और एन-succinylferoxamine के बीच संयुग्मण MNP@SiO2@NH@एफए देने के लिए कार्बोडिमाइड रसायन विज्ञान के माध्यम से किया गया था जो कपलिंग रिएजेंट्स बेंजोट्रीजोल-1-आईएल-आईएल-ऑक्सी-ट्राइस-(डाइमेथिलमिनो)-फॉस्फोनियम हेक्साफ्लोरोफोस्फेट (बीओपी) और 1-हाइड्रोक्सीबेन्जोट्राजोल (एचओबीटी) एक सॉफ्ट बेसिक मीडिया में एन-succinylferoxamine8में टर्मिनल एसिड समूह को सक्रिय करने के लिए । N

एक बार एमएनपी की विशेषता होने के बाद, हमने जंगली प्रकार (डब्ल्यूसी-ए) और वाई एंटोकोलिटिका के एक उत्परिवर्ती को पकड़ने के लिए नंगे और कार्यात्मक चुंबकीय नैनोकणों की क्षमताओं का मूल्यांकन किया, जिसमें फेरोक्सामाइन रिसेप्टर फॉक्सए (फॉक्सए डब्ल्यूसी-ए 12-8) की कमी थी। सादे MNPs, कार्यात्मक MNPs और2MNP@SiO @NH@एफए के अनुरूप प्रत्येक Y. enterocolitica तनाव के साथ बातचीत करने की अनुमति दी गई । बैक्टीरिया-संजूगेट समुच्चय को चुंबकीय क्षेत्र के अनुप्रयोग द्वारा बैक्टीरिया निलंबन से अलग किया गया था। अलग-अलग एग्रीगेट को दो बार फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ धोया गया, जो सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी के लिए पीबीएस में फिर से निलंबित कर दिया गया और फिर उन्हें कॉलोनी की गिनती के लिए चढ़ाया गया । यह प्रोटोकॉल MNP@SiO2@NH@Fa के संश्लेषण के प्रत्येक चरण, सभी मध्यवर्ती और संघ के संरचनात्मक लक्षण वर्णन, और मध्यवर्ती के संबंध में संयुग्म की विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए एक आसान तरीका के रूप में एक जीवाणु कैप्चर परख को दर्शाता है। 9

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Protocol

नोट: निष्क्रिय वातावरण स्थितियों के तहत की गई प्रतिक्रियाओं के लिए, सभी ग्लासवेयर को पहले 65 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में सुखाया गया था, एक रबर पट के साथ सील किया गया था और तीन बार आर्गन के साथ शुद्ध किया गया था।

1. चुंबकीय नैनोकणों का संश्लेषण फेरोक्सामाइन के साथ संयोजित

  1. Fe3O4 चुंबकीय नैनोकणों का संश्लेषण (एमएनपी)
    1. 20 एमएल ग्लास शीशी में0.5 ग्राम फे (एक्सी) 3 जोड़ें और फिर 10 एमएल बेंजाइल अल्कोहल के साथ मिलाएं।
    2. इस मिश्रण को 2 मिनट के लिए सोनिकेट करें, फिर 72 घंटे के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग ब्लॉक और गर्मी में स्थानांतरित करें।
    3. प्रतिक्रिया पूरी होने के बाद, शीशियों को ठंडा होने दें, नैनोकणों को 30 मिनट के लिए 4000 x ग्राम पर 96% इथेनॉल और अपकेंद्रित्र के साथ कुल्ला करें। कम से कम दो बार अपकेंद्रित्र दोहराएं।
    4. एक नियोडिमियम (NdFeB) चुंबक का उपयोग करके चुंबकीय आकर्षण द्वारा नैनोकणों को सुपरनेट से अलग करें और अवशिष्ट सॉल्वेंट को त्यागें।
    5. 96% इथेनॉल दोहराने चरण 1.1.4 के साथ कुल्ला। और 40 kHz पर 1 मिनट के लिए एक स्नान में सोनीशन के साथ बारी-बारी से सुपरनेट को त्यागें जब तक कि सॉल्वेंट स्पष्ट न हो।
  2. चुंबकीय नैनोकण एसआईओ2 कोटिंग (MNP@SiO2)
    1. आइसोप्रोपैनॉल के 80 एमएल में एमएनपी के 2 ग्राम का निलंबन तैयार करें और फिर एक चुंबकीय हलचल बार के साथ एक गोल नीचे फ्लास्क में 21% अमोनिया के 4 एमएल, आसुत पानी के 7.5 एमएल और टेट्राएथिल ऑर्थोसिलिटेट (TEOS) (इस क्रम में) के 0.56 एमएल जोड़ें।
    2. मिश्रण को 2 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें निरंतर सरगर्मी के साथ और फिर 1 घंटे के लिए सोनिकेट करें।
    3. एमएनपी को चुंबक से अलग करें, सुपरनेट को त्यागें, और इसे आइसोप्रोपैनॉल के 30 एमएल में तितर-बितर करें।
    4. चरण 1.2.1 दोहराएं। और 1.2.2.
    5. सभी सामग्री को ठीक करने के लिए 96% इथेनॉल के साथ चुंबकीय हलचल बार को हटाएं और धोएं।
    6. चुंबक का उपयोग करके चुंबकीय आकर्षण द्वारा नैनोकणों को सुपरनेट से अलग करें।
    7. सुपरनेट को त्यागें और नैनोकणों को 96% इथेनॉल के साथ तीन बार सोनिकेशन के साथ बारी-बारी से कुल्ला करें।
    8. 12 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर वैक्यूम के तहत नैनोकणों को सुखाएं।
  3. (3-अमीनोप्रोपिल) ट्राइएथॉक्सीलेन (एपीटीईएस) के साथ MNP@SiO2 का कार्यात्मककरण
    1. निष्क्रिय वातावरण के तहत एन, एन-डाइमेथाइलफार्मेमाइड (डीएमएफ) के साथ पिछले चरण से प्राप्त MNP@SiO2 के 500 मिलीग्राम कुल्ला और फिर 40 किलोहर्ट्ज पर 1 मिनट के लिए sonicate। इसके बाद सुपरनेट को त्यागें और इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं।
    2. एक चुंबकीय हलचल बार के साथ सरगर्मी के तहत, एक गोल नीचे फ्लास्क में कणों को फिर से निलंबित करें और एपीटीईएस के 9 एमएल जोड़ें।
    3. 12 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण हिलाओ।
    4. सुपरनेट को त्यागें और नैनोकणों को 96% इथेनॉल के साथ तीन बार सोनिकेशन के साथ बारी-बारी से कुल्ला करें।
  4. फेरोक्सामाइन का संश्लेषण
    1. डिफेरोक्सामाइन मेसिलेट नमक के 100 मिलीग्राम (0.15 mmol) और फे (acac) के 53.0 मिलीग्राम (0.15 mmol)को 5 मिलीग्राम आसुत पानी में भंग करें और मिश्रण को रात भर कमरे के तापमान पर हिलाएं।
    2. एक जुदाई कीप में EtOAc के 20 एमएल के साथ परिणामी उत्पाद को तीन बार धोएं और फिर, एक रोटेरी वाष्पीकरण का उपयोग करके वैक्यूम के तहत कार्बनिक विलायक को हटा दें।
    3. फ्रीज-एक लाल ठोस के रूप में फेरोक्सामाइन बर्दाश्त करने के लिए जलीय चरण सूखी ।
  5. एन-सुसिंफ्रोक्सेमा का संश्लेषण
    1. 350 मिलीग्राम (3.50 mmol) succinic anhydride के एक समाधान के लिए जोड़ें 100 मिलीग्राम (0.17 mmol) फेरोक्समाइन के 5 मिली लीटर में एक 50 मिलीग्राम गोल तली फ्लास्क में inert वातावरण के तहत।
    2. 16 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर जिसके परिणामस्वरूप मिश्रण हिलाओ । उस समय के बाद, एक गहरे लाल ठोस देने के लिए एक रोटोरी वाष्पीकरण में कम दबाव के तहत पाइरिडीन की अधिकता को हटा दें।
    3. मेथनॉल के 3 एमएल में रिएक्शन क्रूड को भंग करें।
    4. मेथनॉलिक समाधान को सेफडेक्स कॉलम (20 मिमी व्यास के कॉलम में सेपडेक्स का 20 सेमी) में स्थानांतरित करें और 0.5 एमएल/मिनट पर एल्यूट करें।
    5. लाल अंश ले लीजिए और एक रोटेरी वाष्पीकरण का उपयोग कर वैक्यूम के तहत मेथनॉल को हटा दें।
  6. 2 @NH@Fa MNP@SiO संयोजित2का संश्लेषण
    1. डीएमएफ के साथ दो बार2MNP@SiO @NH 2 @NH30 मिलीग्राम शुष्क कुल्ला और निष्क्रिय वातावरण के तहत 30 मिनट के लिए 100 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में नैनोकणों को सोनिकेट करें।
    2. एन-succinylferoxamine (200 मिलीग्राम, 0.30 mmol), बेंजोट्रीजोल-1-एलिल-ऑक्सी-ट्राइस-(डाइमेथाइलमिनो) का समाधान तैयार करें- फॉस्फोनोनियम हेक्साफ्लोरोफोस्फेट (बीओपी, 173 मिलीग्राम, वातावरण में 50 मीटर नीचे के फ्लास्क में डीएमएफ (मिक्स ए) के 10 मीटर में 0.45 mmol), 1-हाइड्रोक्सीबेन्ज़ोट्राइसोल (एचओबीटी, 46 मिलीग्राम, 0.39 mmol) और N एन,एन-डिसोप्रोपिलेथिलमाइन (DIPEA, 128.8 मिलीग्राम, 1.21 mmol) ।N
    3. आर्गन गैस वातावरण (मिक्स बी) का उपयोग करके ऑक्सीजन मुक्त परिस्थितियों में शुष्क में सोनिकेशन के तहत डीएमएफ के 3 एमएल में पहले से कुल्ला MNP@SiO 2@NH2 को निलंबित करें।
    4. बी ड्रॉपवाइज मिश्रण करने के लिए मिक्स ए जोड़ें।
    5. रात भर कमरे के तापमान पर एक कक्षीय शेखर का उपयोग कर अंतिम मिश्रण हिलाएं।
    6. चुंबक का उपयोग करके निलंबन से परिणामी संजूगेट (MNP@SiO2@NH@Fa) को अलग करें।
    7. परिणामी ठोस कुल्ला और फिर, इथेनॉल के 10 एमसीएल के साथ इसे पांच बार सोनीकेट करें।
    8. 24 घंटे के लिए वैक्यूम के तहत ठोस सूखी।

2. नैनोकणों के साथ रोगजनक बैक्टीरिया के कब्जे की मात्रा निर्धारित करने के लिए वाई एंटेरोओलिटिका उपभेदों के साथ बैक्टीरियल परख

  1. सभी मध्यवर्ती नैनोकणों का निलंबन तैयार करें और पीएचबीएस में अंतिम संयुग्मण बाँझ 2 एमएल ट्यूबों में 1 मिलीग्राम/एमएल पर।
  2. लुरिया बर्टानी (एलबी) शोरबा के 5 मिलीलन में वाई एंटोकोलिटिका की संस्कृति तैयार करें रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करें।
  3. 10 m 2,2'-bipyridyl के 50 माइक्रोन जोड़कर लोहे की कमी ट्राइप्टिक सोया शोरबा (टीएसबी) का 5 एमएल तैयार करें।
  4. वाई एंट्रोकोलिटिका की रातोंरात संस्कृति के 50 माइक्रोन के साथ लोहे की कमी टीएसबी के 5 मिलीलीटर को टीका लगाएं और फिर, एक ओडी600 = 0.5\u20120.8 तक पहुंचने तक आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. कदम 2.4 में प्राप्त संस्कृति के 100 μL ले लो और एक 2.0 एमएल पीबीएस के 900 μL युक्त ट्यूब में पतला करने के लिए एक पहले 1/10 कमजोर पड़ने प्राप्त करने के लिए. फिर, 1 x 10 6 कॉलोनी बनाने इकाइयों (सीएलयू) /एमएल लगभग पर जीवाणु कोशिकाओं की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एक ही प्रक्रिया का उपयोग करते हुए पहले कमजोर पड़ने से1/100 कमजोर पड़ने तैयार करें ।
  6. 2.0 एमएल ट्यूब में बैक्टीरियल सस्पेंशन के 1/100 कमजोर पड़ने के 1 मिलीग्राम/एमएल में नैनोकणों के 100 माइक्रोन सस्पेंशन जोड़ें, और भंवर के साथ समरूप।
  7. 1 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति इनक्यूबेट।
  8. एमएनपी/बैक्टीरिया को चुंबक का उपयोग करके अलग करें और सुपरनैंट को सावधानीपूर्वक त्यागें।
  9. एक भंवर का उपयोग कर 1 एमएल पीबीएस के साथ दो बार अलग नैनोकणों कुल्ला।
  10. सीएफयू/एमएल में बैक्टीरियल कैप्चर की मात्रा गिनने के लिए पीबीएस के 1 एमएल में नैनोकणों को निलंबित करें ।
  11. 1 x 10 -4 कमजोर पड़ने तक पहुंचने तक पूर्व निलंबन से लगातार चार1/10 कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
  12. टीएस आगर प्लेटों पर प्रत्येक कमजोर पड़ने की प्लेट 10 μL और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
  13. एप व्हाइट मोड में जेल डिजिटलाइजर के साथ प्लेट की तस्वीर लें। अलग-अलग कॉलोनियों की संख्या गिनने के लिए एक स्थान को बढ़ाने के लिए एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ छवि को संसाधित करें।
    नोट: प्रत्येक एमएनपी मध्यवर्ती संश्लेषण की प्रगति का पालन करने के लिए विशेषता थी। सबसे पहले, क्रिस्टलीय संरचना की जांच करने के लिए एक्सआरडी द्वारा नंगे एमएनपी का अध्ययन किया गया था। फिर, प्रत्येक मध्यवर्ती के एफटी-आईआर स्पेक्ट्रम को इसी प्रतिक्रिया में हुए परिवर्तनों की जांच करने के लिए चलाया गया था। एफटी-आईआर स्पेक्ट्रा से प्राप्त निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक मध्यवर्ती का रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण भी किया गया था । टीजीए विश्लेषण ने हमें अपनी संरचना में कार्बनिक सामग्री वाले मध्यवर्ती के नुकसान के वजन का अनुमान लगाने की अनुमति दी। प्रत्येक मध्यवर्ती के आकृति विज्ञान और आकार का अध्ययन TEM द्वारा किया गया था। अंत में, XPS विश्लेषण प्रत्येक एमएनपी मध्यवर्ती सतह पर परमाणु ऑक्सीकरण राज्यों का निर्धारण करने और 2 @NH@Fa MNP@SiO संविलियन बांडगठनकी पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण था।

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Representative Results

आकृति विज्ञान और प्रत्येक मध्यवर्ती और अंतिम संविलियन के गुणों को निर्धारित करने के लिए एक संपूर्ण संरचनात्मक लक्षण वर्णन किया जाता है। इस उद्देश्य के लिए, तकनीक एक्सआरडी, एफटी-आईआर, रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी, टीजीए, टीईटी, ईडीएक्स मैपिंग और एक्सपीएस का उपयोग संजूगेट के गठन को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है। एक्स-रे फोटोइलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी (एक्सपीएस) द्वारा अधिग्रहीत नैनोकणों की सतह पर परमाणुओं के ऑक्सीकरण राज्य नैनोपार्टिकल और साइडरोपोर के बीच सहसंयोजक बांड के गठन की पुष्टि करने के लिए सबसे प्रासंगिक डेटा हैं। इन परिणामों के साथ समझौते में, यह प्रोटोकॉल प्रजनन योग्य है।

नंगे एमएनपी, कार्यात्मक एमएनपी और संजूगेट को पीबीएस समाधान में प्रत्येक वाई एंटोकोलिटिका तनाव के साथ मिलाया जाता है। बैक्टीरिया-एमएनपीएस समुच्चय को चुंबक का उपयोग करके निलंबन से अलग किया जाता है। पीबीएस के साथ दो बार समुच्चय को कुल मिलाने के बाद, उन्हें पीबीएस में फिर से निलंबित कर दिया जाता है ताकि कॉलोनी की गिनती के लिए चढ़ाया जाने वाले सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी की जा सके ।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार मध्यवर्ती और अंतिम संजूगेट संश्लेषण के प्रत्येक चरण में होने वाले परिवर्तनों को प्रदर्शित करने के लिए कई तकनीकों को प्रस्तुत किया गया था। इन्फ्रारेड और रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी संश्लेषण के प्रत्येक चरण की निगरानी करने के लिए एक आसान और तेज तरीका है। सी-ओ, सी-सी-सी, फे-ओ, ओ =सी अमीड कंपन, ओ = सी-एन हाइड्रोक्सामिक एसिड कंपन के अनुरूप विशेषता बैंड की उपस्थिति एफटी-आईआर और रमन में (नीचे देखें) स्पेक्ट्रा संश्लेषण के प्रत्येक चरण में चुंबकीय नैनोकणों की सतह पर हो रहे रासायनिक परिवर्तनों के पहले संकेतक थे।

एक्सआरडी डिक्रैक्टोग्राम

चित्रा 1 JCPDS फ़ाइल 00-003-0863 के साथ तुलना करके मैग्नेटाइट के सिंथेटिक चुंबकीय नैनोकणों (MNP) की संरचना और क्रिस्टलीय संरचना की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया XRD विश्लेषण से पता चलता है ।

तेम विश्लेषण

चित्रा 2C इलेक्ट्रॉन विवर्तन पैटर्न के उज्ज्वल धब्बे प्रदर्शित करता है जो (111), (220), (311), (400), (422), (511) और (440) मैग्नेटाइट के विवर्तन विमानों के साथ मेल खाते हैं, जो 4.9 के डी-स्पेसिंग के अनुरूप है। क्रमशः 2.9, 2.4, 2.0, 1.7, 1.6 और 1.4 Å। दूसरी ओर, चित्रा 2डी और चित्रा 4E MNP@SiO2@NH2@Fa की टेम छवियां दिखाती हैं जो असंगत अकार्बनिक-कार्बनिक सामग्री में एम्बेडेड एमएनपी कणों (~ 10 एनएम) को फैलाने के लिए संबंधित हैं। कोटिंग मोटाई ~ 10 एनएम से अधिक है।

EDX विश्लेषण

EDX नक्शे सतह पर एलिमेंट्स फे, ओ, सी और सी के वितरण को प्रदर्शित करते हैं। चित्र 3ए स्पष्ट रूप से2MNP@SiO की सतह पर एसआई की उपस्थिति को दर्शाता है । फेरोक्सामाइन के साथ अमीन कार्यात्मकता और संाधीनता के बाद, MNP@SiO2@NH@Fa के लिए नैनोकणों की सतह पर सी की वृद्धि को एक सफल संजुर्गन के सबूत के रूप में चित्रा 3 बी में दिखाया गया है।

आईआर विश्लेषण

नंगे एमएनपी, MNP@SiO2, MNP@SiO 2 @NH2और MNP@SiO2 @NH@Fa के FTIRस्पेक्ट्रा चित्रा 4में दिखाया गया है । सभी FTIR स्पेक्ट्रा 600 सेमी-1 पर विश्लेषण की स्पेक्ट्रल रेंज के भीतर एक बैंड की शुरुआत प्रदर्शित करते हैं जो Fe-O कंपन से संबंधित था। 1050 सेमी-1पर एक व्यापक बैंड की उपस्थिति - एसआई-ओ-सी खींच कंपन के लिए जिम्मेदार - MNP@SiO 2 के एफटीआर स्पेक्ट्रा में ,2MNP@SiO @NH2और MNP@SiO2 @NH@Fa सिलिका कोटिंग की पुष्टि की गई।2

MNP@SiO2 (चित्रा 4)का एफटीआईआर स्पेक्ट्रम 830 और 1275 सेमी-1 (एसआई-ओ बॉन्ड) के बीच एक व्यापक बैंड प्रदर्शित करता है; यह 2 @NH2MNP@SiO के FTIR स्पेक्ट्रम में APTES के साथ अपने कार्यात्मकता के बाद और अधिक तीव्र होजाताहै, शायद एसआई-सी बांड के कारण (1175 और 1250सेमी-1के बीच की उम्मीद)। अंत में, 2995 सेमी-1 (सी-एच स्ट्रेचिंग बांड), 1640 सेमी-1 (ओ= सी-एनएच अमीद द्वितीय कंपन) और 1577 सेमी-1 (ओ = सी-एन हाइड्रोक्सामिक एसिड कंपन) पर बैंड MNP@SiO2@NH@Fa के एफटीआईआर स्पेक्ट्रम में मनाया गया नैनोपार्टिकल्स100के साथ फेरामाइनॉक्स के संवहार की पुष्टि की।

थर्मोग्रैविमेट्री विश्लेषण

थर्मोग्रैविटी डेटा चित्र 5में दिखाया गया है, जो कार्बनिक सामग्री और पानी के अलावा के कारण वजन घटाने को प्रदर्शित करता है।

रमन विश्लेषण

प्रत्येक मध्यवर्ती और MNP@SiO2@NH@Fa(चित्रा 6)के रमन विश्लेषण द्वारा नंगे एमएनपी के सिलिका कोटिंग और कार्यात्मकता की भी पुष्टि की गई । सभी रमन स्पेक्ट्रा 305.8, 537.2 और 665.6 सेमी-1पर चोटियों, Fe-O कंपन(चित्रा 6A)11के अनुरूप, और 713.5 सेमी-1पर चोटी पर एक कंधे, एसआई-ओ-सी कंपन(चित्रा 6B)12से संबंधित दिखाते हैं। एपीटीईएस कार्यात्मकता के बाद, MNP@SiO2@NH2 का रमन स्पेक्ट्रम 1001.5 और 1027.4 सेमी-1पर तीव्र चोटियों को प्रदर्शित करता है, जो एसआईओ2की उपस्थिति के अनुरूप है, और 1578.6 और 1597.9 सेमी-1पर, एसआई-सी बांड के गठन की पुष्टि करता है। इसके अलावा, 703.0 सेमी-1 पर चोटी के कंधे की उपस्थिति ने भी एपीटीईएस(चित्र 6 सी)13, 14,14की उपस्थिति की पुष्टि की। अंत में, 14 9 0 और 1700 सेमी-1 (~ 1581 सेमी-1पर केंद्रित) के बीच व्यापक चोटी, एसआई-सी बांड के अनुरूप और MNP@SiO2@NH@Fa के रमन स्पेक्ट्रम में एमिड समूह, संजूगेट(चित्रा 6 डी)14के गठन के साथ समझौते में हैं।

एक्सपीएस विश्लेषण

सतह पर परमाणुओं के ऑक्सीकरण राज्य का अध्ययन एक्सपीएस विश्लेषण द्वारा किया गया था और संरचनाओं में बांड गठन की पुष्टि की गई थी। चित्रा 7 नंगे और विभिन्न कार्यात्मक एमएनपी के XPS स्पेक्ट्रा से पता चलता है। एमएनपी के लिए, C1s में एक संकीर्ण चोटी संश्लेषण के दौरान नमूने को संभालने में अशुद्धियों के कारण हो सकता है । कार्बन की शुरूआत 2 @NH 2 और MNP@SiO MNP@SiO2@NH@Faस्पेक्ट्रा में सी-सी और सी-एच बांडकेरूप में देखी जाती है। N1s स्पेक्ट्रा में ३९९ ईवी पर चोटी का विश्लेषण MNP@SiO2@NH@Fa के लिए मनाया अपने क्षीणन के साथ 2 @NH2और feroxamine MNP@SiO के बीच अमीड बांड केगठन की पुष्टि करता है । इसके अलावा, हाइड्रोक्सामिक मोइटिस के एन-ओ बॉन्ड का अस्तित्व 402 ईवी पर चोटी की उपस्थिति से सहमत है। सभी मध्यवर्ती और संजूगेट में एसआई2पी संकीर्ण स्पेक्ट्रा में 102 ईवी पर चोटी की उपस्थिति सिलोक्सेन समूह15,16के लिए बाध्यकारी ऊर्जा के साथ समझौते में है ।

Z संभावित

Z संभावित मूल्य तालिका 1में प्रदर्शित किए जाते हैं। एमएनपी के लिए क्रमशः -25.21 और -29.35 एमवी, परिणाम नकारात्मक हैं और2MNP@SiO हैं। 2 MNP@SiO देने के लिए एपीटीईएस के साथ कार्यात्मककरण2@NH2 ने सतह के चार्ज को नकारात्मक से सकारात्मक में बदल दिया। इस तथ्य को अमीन समूहों के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था और सतह का प्रभारMNP@SiO 2@NH@Fa के लिए सकारात्मक बना हुआ है। सकारात्मक सतह जेड क्षमता बैक्टीरिया (जिनकी सतह नकारात्मक है) और,संजूगेट17, 18,,19के बीच बातचीत की व्याख्या कर सकती है।19

बैक्टीरिया परख पर कब्जा

वाई एंटोकोलिटिका डब्ल्यूसी-ए और फॉक्सए डब्ल्यूसी-ए-ए 12-8 की कोशिकाओं की संख्या एमएनपी इंटरमीडिएट और MNP@SiO2@NH@Fa के साथ उन कमजोरुओं में निर्धारित की गई थी जहां 40 \u201260 कालोनियों को अलग किया गया था और आसानी से कल्पना की गई थी । नंगे, MNP@SiO2,और MNP@SiO 2 @NH2द्वारा कब्जा कर लिया कोशिकाओं की संख्या उन दोनों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर(चित्रा 8)से पता चलता है । 2 MNP@SiO @NH2में मुक्त अमीन समूहोंऔर बैक्टीरिया में फेरोक्सामाइन झिल्ली रिसेप्टर की कम एकाग्रता के कारण इलेक्ट्रोस्टैटिक बल अपेक्षित बाध्यकारी विशिष्टता की कमी को न्यायोचित ठहरा सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के संजूगेट्स के संश्लेषण में लागू किया जा सकता है, मुख्य रूप से वे जो कार्बोडाइमाइड रसायन का उपयोग करते हैं। बेहतर परिणाम प्राप्त करने के लिए संशोधनों को लागू करने के लिए यह काफी बहुमुखी है। वर्णित तकनीकों का उपयोग करके सभी मध्यवर्ती और अंतिम संजूगेट का पूर्ण लक्षण वर्णन, एक संश्लेषण के प्रत्येक चरण का पालन करने और इच्छा बांड के गठन की पुष्टि करने की अनुमति देता है। बैक्टीरिया में उपनिवेशों की गिनती परख पर कब्जा, एक 10 μL ड्रॉप का उपयोग कर, एक एक थाली में एक ही समय में सभी नमूनों का परीक्षण करने के लिए जो आसान प्रतिकृति पाने के लिए और विभिन्न परिस्थितियों में परख प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देता है ।

Figure 1
चित्रा 1: एमएनपी (फे 3 ओ4)(बैंगनी)और मैग्नेटाइट पैटर्न (ब्लैक) विवर्तनग्राम की तुलना।
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Figure 2
चित्रा 2: नंगे एमएनपी (ए, बी और सी) के उज्ज्वल क्षेत्र TEM और इलेक्ट्रॉन विवर्तन छवियां, और MNP@SiO2@NH@Fa (डी, ई और एफ) की।
छवियां मध्यम और उच्च संकल्प पर हैं । इस आंकड़े को मार्टिनेज-मातमोरोस एट अल9से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: MNP@SiO2के EDX नक्शे: HAADF छवि और इसी Fe, Si, O और C नक्शे ए MNP@SiO2 और बी MNP@SiO2@NH@Fa ।
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Figure 4
चित्रा 4: नंगे लोहे के ऑक्साइड (Fe3O4)एमएनपी, MNP@SiO2,MNP@SiO 2 @NH2और MNP@SiO2 @NH@Fa (4) केएफटी-आईआरस्पेक्ट्रा ।
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Figure 5
चित्रा 5: एमएनपी का थर्मोग्रैविजिक विश्लेषण,2@NH2MNP@SiO, और MNP@SiO2@NH@Fa।
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Figure 6
चित्रा 6: नंगे लोहे के ऑक्साइड (Fe3O4)एमएनपी (ए), MNP@SiO 2 (बी), MNP@SiO2@NH2 (सी) और MNP@SiO2 @NH@Fa (डी) के रमनस्पेक्ट्रा।
(*) APTES, (**) अन्य लौह ऑक्साइड चरणों, संभावना लेजर शक्ति द्वारा मैग्नेटाइट के परिवर्तन से गठन किया। इस आंकड़े को मार्टिनेज-मातमोरोस एट अल9से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: एमएनपी के एक्सपीएस संकीर्ण स्पेक्ट्रा,2@NH2 और MNP@SiO2@NH@Fa MNP@SiO। इस आंकड़े को मार्टिनेज-मातमोरोस एट अल9से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: वाई एंटोकोलिटिका के सीएफयू ने चुंबकीय नैनोकणों के प्रति 100 माइक्रोग्राम पर कब्जा कर लिया: नंगे, MNP@SiO2,MNP@SiO2@NH2 और MNP@SiO2@NH@Fa।
(A)WC-A (जंगली प्रकार)(B)FoxA WC-A 12-8 (उत्परिवर्ती की कमी feroxamine रिसेप्टर FoxA) और MNP@SIO2@NH@Fa की SEM छवि वाई एंटोकोलिटिकाके साथ बातचीत । इस आंकड़े को मार्टिनेज-मातमोरोस एट अल9से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नमूना Z संभावित
एमएनपी -25.21
MNP@SiO2 -29.35
MNP@SiO2@NH2 17.03
MNP@SiO2@NH@Fa 22.14
MNP@SiO2@NHBoc@Fa 19.16
MNP@SiO2@NHCOOH@Fa 10.96

तालिका 1: जेड संभावित माप। यह तालिका मार्टिनेज-मातमोरोस एट अल9से प्राप्त की गई है।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल चुंबकीय नैनोकणों और सहसंयोजक संबंध द्वारा साइडरोफोर फेरोक्सामाइन के बीच एक संयोजित के संश्लेषण का वर्णन करता है। मैग्नेटाइट का संश्लेषण पिन्ना एट अल द्वारा रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया गया था।5 इसके बाद जलीय प्रणालियों में जंग के चुंबकीय कोर की रक्षा के लिए सिलिका कोटिंग द्वारा एकत्रीकरण को कम करने और कार्यात्मकता6के लिए एक उपयुक्त सतह प्रदान करने के लिए किया गया था। सिलिका कोटिंग प्रक्रिया को संशोधित किया गया था। ली एट अल6द्वारा दी गई सूचना के अनुसार तीन कोटिंग्स करने के बजाय, एमएनपी को इस विधि(चित्रा 2डी)में दो सिलिका परतों से लेप किया गया था जो एपीटीईएस7के साथ कार्यात्मकता कदम को जारी रखने के लिए पर्याप्त था ।

Deferoxamine लोहे (III) के साथ जटिल था क्योंकि यह कमरे के तापमान पर कुछ ही घंटों के भीतर गिरावट के लिए अतिसंवेदनशील है । लोहे के परिसर को प्राप्त करने का सबसे अच्छा तरीका लोहे के एसीटाइल एसीटोनेट का उपयोग करना है क्योंकि तरल-तरल निष्कर्षण द्वारा इसका शुद्धिकरण बहुत सरल है और मात्रात्मक उपज में फेरोक्सामाइन प्राप्त किया जाता है। फेरोक्सामाइन स्थिर है और Nएक लिंकर के रूप में एक टर्मिनल अम्लीय समूह जोड़ने के लिए सुसिक एनाहाइड्राइड का उपयोग करके एन-सुसिंफ्रेमोक्सामाइन देने के लिए संशोधित किया जा सकता है। आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी द्वारा शुद्धिकरण एन-सुसिंफ्रेमोक्सामाइन से Nअतिरिक्त सुसिक एनाहाइड्राइड और सक्सिक एसिड को हटाने की अनुमति देता है।

अमीन नैनोकंपोसाइट का उपयोग Nसतह पर एन-succinylferoxamine को सहसंबद्ध रूप से जोड़ने के लिए किया गया था। आयरन ऑक्साइड के पैरामैग्नेटिक व्यवहार के कारण उत्पादों की संरचनात्मक स्पष्टता के लिए परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) का उपयोग नहीं किया जा सकता है। इस कारण से, प्रत्येक प्रतिक्रिया कदम एफटी-आईआर द्वारा निगरानी की गई और फिर रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की गई। चोटियों deconvolution और फिटिंग एक सुविधाजनक सॉफ्टवेयर के साथ बनाया गया था ध्यान में रखते हुए कि रमन स्पेक्ट्रा ३,००० एस के कुल उपाय समय के साथ ३०० एस के दस उपाय शामिल थे आकृति विज्ञान और आकार TEM द्वारा मापा गया TEM द्वारा 10 एनएम(चित्रा 2A,बी)के एक सजातीय आकार वितरण के साथ छद्म आकार मैग्नेटाइट देख रहे थे । संजूगेट कोटिंग मोटाई उपाय एक 10 एनएम सजातीय परत(चित्रा 2 डी,ई)दिखाते हैं ।

एक टेम क्षेत्र प्राप्त करना बहुत मुश्किल है जहां नैनोकणों को व्यक्तिगत रूप से इसके चुंबकीय चरित्र और समूह के लिए इसकी प्रवृत्ति के कारण देखा जा सकता है। सतह पर प्रत्येक तत्व की संरचना के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए EDX मानचित्रण का उपयोग किया गया था(चित्र 3 ए)। मध्यवर्ती MNP@SiO MNP@SiO 2 के सापेक्ष2@NH@एफए (चित्रा 3बी) के संजूगेट में कार्बन घनत्व स्पष्ट रूप से बढ़ गया था.

बैक्टीरिया पर कब्जा परख के क्रम में conjugate की क्षमता का परीक्षण करने के लिए feroxamine बाहरी झिल्ली प्रोटीन रिसेप्टर के माध्यम से बैक्टीरिया पर कब्जा करने के लिए डिजाइन किया गया था । यरसिनिया एंटोकोलिटिका WC-A तनाव का चयन किया गया था क्योंकि यह फॉक्सए फेरोक्सामाइन रिसेप्टर व्यक्त करता है और विकसित करने के लिए आसान है । इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम गैर कब्जा कर लिया बैक्टीरिया को हटाने था । यह दो बार बाँझ PBS के साथ rinsing और भंवर द्वारा प्राप्त किया गया था एक चुंबक का उपयोग कर बैक्टीरिया-conjugate समुच्चय ठीक करने के बाद । प्रत्येक एमएनपी इंटरमीडिएट द्वारा कैप्चर की गई कोशिकाओं की संख्या, नियंत्रण के रूप में उपयोग की जाती है, और2@NH@Fa MNP@SiO संजूगेट कमजोर पड़ने की विधि से कॉलोनी गिनती द्वारा निर्धारित किया गया था। 10 माइक्रोन बूंदों का उपयोग प्रयोगात्मक प्रक्रिया की सुविधा और पट्टिका गिनती कालोनियों की शास्त्रीय विधि की तुलना में समय और सामग्री के मामले में परीक्षण की लागत को कम करने के चार से अधिक नमूनों को संभालने के लिए अनुमति देता है ।

MNP@SiO2@NH@Fa के संश्लेषण की सबसे महत्वपूर्ण सीमा यह है कि एनएमआर द्वारा बांड गठन की पुष्टि करना संभव नहीं है। यद्यपिMNP@SiO 2@NH@Fa की तैयारी सरल लगती है, लेकिन एक सहसंयोजक बांड के माध्यम से साइडोफोर और एमएनपी के बीच जोड़ने की पुष्टि करने के लिए संरचनात्मक लक्षण वर्णन तकनीकों का उपयोग महत्वपूर्ण है।

वर्तमान प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, कार्बोडिमाइड रसायन शास्त्र का उपयोग करके संजूगेट उत्पन्न करना संभव है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, एमएनपीएस सतह पर अमीनो समूहों की उपस्थिति और ब्याज के यौगिक में कार्बोक्सिलिक एसिड कार्यक्षमता आवश्यक है। विभिन्न लिंकर्स का परीक्षण करना और अन्य कार्यात्मक समूहों के साथ एमएनपी की सतह को कोटिंग करना इस पर सकारात्मक शुल्क बनाने से बचने के लिए बैक्टीरियल कैप्चर भेदभाव में सुधार हो सकता है ।

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Disclosures

हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक इस काम में उपयोग किए जाने वाले येर्सिनिया एंटोकोलिटिका उपभेदों की आपूर्ति के लिए प्रोफेसर क्लाऊस हैनके (यूनिवर्सिटी ऑफ तुबिनजेन, जर्मनी) को स्वीकार करते हैं। इस कार्य को अनुदान AGL2015-63740-C2-1/2-R और RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, EU) द्वारा स्पेन के राज्य अनुसंधान के लिए राज्य एजेंसी (AEI) से समर्थित किया गया था, सह यूरोपीय संघ से FEDER कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित । यूनिवर्सिटी ऑफ सैंटियागो डी कंपोस्टेला और यूनिवर्सिटी ऑफ ए कोरुना में काम को अनुदान GRC2018/018, GRC2018/039, और ED431E 2018/03 (CICA-INIBIC स्ट्रैटेजिक ग्रुप) से Xunta de Galicia से भी समर्थन मिला । अंत में, हम उसकी महान आवाज कर इस वीडियो प्रोटोकॉल के सहयोग के लिए Nuria Calvo को शुक्रिया अदा करना चाहता हूं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate
HOBT		 Acros 300561000
2,2′-Bipyridyl Sigma Aldrich D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99% Acros 151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3 Sigma Aldrich 338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent Acros 209800050
Benzyl alcohol Sigma Aldrich 822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) Sigma Aldrich D9533
Ethanol, anhydrous, 96% Panreac 131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97% Sigma Aldrich F300
LB Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal Acros 459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal Acros 326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal Acros 339421000
Sephadex LH-20 Sigma Aldrich LH20100
Succinic anhydride >99% Sigma Aldrich 239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0% Sigma Aldrich 86578

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References

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Martínez-Matamoros, D., Castro-García, S., Ojeda Romano, G., Balado, M., Rodríguez, J., Lemos, M. L., Jiménez, C. Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection. J. Vis. Exp. (160), e60842, doi:10.3791/60842 (2020).

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