クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失
Summary
ここで説明する、フラミジア・トラコマティスにおける標的化されたマーカーレス遺伝子欠失の方法であり、フロキサセット対立遺伝子交換変異誘発、FLAEMを用いた。
Abstract
クラミジア・トラコマティスは、歴史的に遺伝的に操作することが困難であった細胞内病原体である。C.トラコマティスが特権的な細胞内ニッチを作成し維持するために使用するメカニズムを解明する上で決定的な進歩は、遺伝的ツールの欠如のために限られている。幸いなことに、最近、遺伝子操作技術のいくつかの新しい進歩がありました。これらの中には、蛍光報告されたアレリック交換変異誘発(FRAEM)の開発がある。この方法は、抗生物質耐性と緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするセレクションカセットの挿入と結合した標的遺伝子欠失を可能にする。下流の遺伝子に対する極性作用の可能性があるため、ポリシストロニックオペロン内の遺伝子を標的とする場合、この戦略への依存は複雑になる可能性があります。フロクサセットアレリック交換変異型(FLAEM)は、ここで説明するプロトコルを、カセット誘発極性の影響を緩和するために開発された。FLAEMは、アレリック交換による標的欠失後の選択カセットを除去するためにCre-loxPゲノム編集を利用する。得られた株は、1つ以上のコード配列のマーカーレス遺伝子欠失を含む。この技術は、遺伝子機能の直接評価を容易にし、C.トラコマティスにおける遺伝子操作のためのツールのレパートリーを拡大する。
Introduction
クラミジア・トラコマティスは、細菌性感染症の主な原因であり、人間の健康に大きな負担を表しています。毎年1億人以上の人々がC.トラコマティス1に感染しています。女性の感染の約70%は、骨盤炎症性疾患、子宮外妊娠、および/または不妊症などの有害な生殖健康への影響にもかかわらず、無症候性である。病気の後遺症は、C.トラコマティス感染によって開始される免疫病理学に直接関連している2.効力のあるワクチンはまだ開発されていません。したがって、細菌の病原性因子および他の細菌遺伝子産物の機能を理解することは、重要かつ緊急の研究課題である。
細胞内細菌として、宿主細胞の侵入、細胞内複製、子孫の放出、および宿主免疫応答の回避は重要なプロセスである。C.トラコマティスは、細胞内発達のために、インクルージョンと呼ぶ、寄生虫膜結合液胞を形成する。この包接および他の多くの重要なプロセスの確立は、III型分泌システム(T3SS)3を介したエフェクタータンパク質の分泌によって達成される。これらの分泌されたエフェクターの機能を解明することは、C.トラコマティスの遺伝的難治性のために長年にわたって制限されていた。大腸菌とは異なり、クラミジアには多くの古典的なクローニング技術は適用されません。いくつかの大きな制限は、変換効率、sacBなどのカウンターセレクションレポーターの欠如、プラスミドのメンテナンスを含みます。大腸菌プラスミドは、一般に複製の起源および適切な選択圧力を有して無期限に維持することができるが、C.トラコマティスプラスミドは、L2セロバー4内の天然pL2プラスミド上に見られる維持のために追加の8つのオープンリーディングフレーム(pgp1-8)を必要とする。
近年、クラミジアのユニークな生物学に対応する複数の遺伝的ツールが生成されていますが、まだ限界5、6、7があります。エチルメタンスルホン酸(EMS)治療による化学変異は、ミスセンス突然変異を導入することができ、または(より少ない頻度で)ヌクレオチド遷移を生じ、ナンセンス突然変異を生じさせる早期停止コドンを導入し得る。トランスポゾン挿入は遺伝子破壊に有効ですが、クラミジアの研究における現在の技術は手間がかかり、時間がかかる9.EMS治療とトランスポゾン変異発生法の両方がランダムな突然変異を生成し、変異株を分離するために厳格なスクリーニング方法を必要とします。グループIIイントロンの挿入によって遺伝子を破壊する方法(例えば、TargeTron)は、指示された変異発生を可能にする。ただし、この方法は効率によって制限され、挿入部位が常に適切に予測されるわけではありません。
蛍光報告された対立遺伝子交換(FRAEM)は、抗生物質耐性および蛍光レポーター11を提供する選択カセットの挿入と相まって標的遺伝子欠失に使用される戦略である。しかし、FRAEMは、特にポリシストロニックオペロン内の遺伝子を標的とする場合、カセット誘発性の極性作用が下流遺伝子に及ぼす可能性によって複雑化する。フロキスカセットアレリック交換変異型(FLAEM)は、FRAEM選択カセット12で以前に観察されたカセット誘発性極性作用を緩和するために開発された新しい遺伝的アプローチである。FLAEMは、Cre-loxPゲノム編集を利用して、選択カセットを除去し、下流遺伝子の発現を回復させます。抗生物質耐性および緑色蛍光タンパク質(GFP)を含む選択カセットは、横並びのloxP部位で再設計される。これらのloxP部位は、Cre recombinaseの存在下で再結合し、ゲノム13からのカセットの切除をもたらす。この戦略は、欠失12、14のためにtmeAを標的とする場合のカセット誘導極性の影響を緩和することが示されている。
FRAEM法およびFLAEM法は、pgp6の誘導式を通じて条件付きで維持することができる同じ自殺ベクトルpSUmC 4.0を利用する。pgp6の発現は、プラスミド保持に必要であることが以前に示されており、したがってプラスミド維持11、15を制御するために活用される。C.トラコマティスが無水テトラサイクリン(aTc)を加えた培地で増殖してpgp6発現を誘導すると、ベクターは維持される。aTc がない場合、ベクトルは失われます。標的遺伝子欠失は、選択カセットに対する遺伝子の対立遺伝子交換を通じて達成される。標的遺伝子の上流と下流の3kb領域は、組換えのための相同性アームとして機能する。これらの腕は選択カセットに隣接するpSUmC 4.0ベクトルにクローン化される。C.トラコマティス変換と再結合事象の成功は、蛍光報告によって観察される。ベクターバックボーン上のmCherryの発現と選択カセット内のgfpの生成赤と緑の蛍光包括体。培養培地からaTcが除去されると、グリーンのみのインクルージョンは、自殺ベクターの喪失と細菌ゲノムへの選択カセットの統合との正常な組み換え事象を示す。
FLAEMは、新たに作成された変異株へのCreリコンビナーゼ発現ベクターpSU-Creのその後の変換を介してFRAEMの延長を表す。Cre recombinaseは、loxP部位と選択カセットの切除との再結合を容易にする。再結合事象は、蛍光報告を介して示される。pSU-Cre ベクトルはmCherryをコードします。したがって、正常な変換は、gfp-発現インクルージョンに赤蛍光を加えることによって示される。カセットに対する選択的圧力がない場合の培養は、loxP部位でのCre媒介的再結合をもたらし、かつカセットの損失は、赤色のみの含有物によって示される。pSUmC-4.0 と同様に、pGP6の誘導式は条件付きで pSU-Cre を維持するために使用されます。aTcおよび抗生物質の選択が除去されると、プラスミドは硬化し、結果として生じるマーカーレス欠失株は非蛍光である。この方法はカセット誘発性極性効果の問題に取り組む。
Protocol
Representative Results
Discussion
FLAEMによるC.トラコマティスにおけるマーカーレス遺伝子欠失の発生に関してここで説明するプロトコルは、非必須遺伝子の標的欠失を可能にし、カセット誘発性極性作用を排除する。このプロトコルは、pSUmC 4.0自殺ベクターに挿入された5’および3’の相同性アームの慎重な設計、C.トラコマティスの効率的な変換、および分離された変異株の慎重なスクリーニングに依存する。こ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(助成金A1065530とAl124649)からK.A.フィールズへの公衆衛生サービス助成金によって支えられていました。
Materials
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam–/dcm– Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
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