Summary
Описанный здесь метод для целенаправленного, маркеров удаления генов в Chlamydia trachomatis с помощью флексной кассеты аллельный обмен мутагенез, FLAEM.
Abstract
Chlamydia trachomatis является обликгейтвнутрино внутриклеточного патогена, который был исторически трудно генетически манипулировать. Окончательный прогресс в выяснении механизмов, которые C. trachomatis использовать для создания и поддержания привилегированной внутриклеточной ниши была ограничена из-за отсутствия генетических инструментов. К счастью, в последнее время произошло несколько новых достижений в области методов генетических манипуляций. Среди них развитие флуоресценции сообщили аллелики обмена мутагенеза (FRAEM). Этот метод позволяет целенаправленное удаление генов в сочетании с вставкой выделенной кассеты, кодирующей устойчивость к антибиотикам и зеленого флуоресцентного белка (GFP). Зависимость от этой стратегии может быть осложнена при ориентации генов в полицистронных оперонах из-за потенциального полярного воздействия на нисходяшие гены. Флоксс кассета аллельный обмен мутагенез (FLAEM), протокол, для которого описано здесь, был разработан, чтобы облегчить кассеты индуцированных полярных эффектов. FLAEM использует редактирование генома Cre-loxP для удаления кассеты после целевого удаления путем аллельного обмена. Полученные штаммы содержат безмаркерые генные удаления одной или нескольких последовательностей кодирования. Этот метод облегчает прямую оценку функции генов и расширяет репертуар инструментов для генетических манипуляций при C. trachomatis.
Introduction
Хламидиоз трахоматис является основной причиной бактериальных заболеваний, передающихся половым путем, и представляет собой значительное бремя для здоровья человека. Более 100 миллионов человек заражаются каждый год c. trachomatis1. Приблизительно 70% инфекций у женщин протекают бессимптомно, несмотря на пагубные последствия для репродуктивного здоровья, такие как воспалительные заболевания таза, внематочная беременность и/или бесплодие. Сиквелы болезни напрямую связаны с иммунопатологией, инициированной инфекцией C. trachomatis 2. Эффективная вакцина еще не разработана; поэтому понимание функции бактериальных факторов вирулентности и других продуктов бактериального гена является важным и срочным исследовательским вопросом.
Как внутриклеточные бактерии, вторжение клеток-хозяев, внутриклеточная репликация, высвобождение потомства и уклонение от иммунологических реакций хозяина являются критическими процессами. C. trachomatis образует паразитофорную мембрану, связанную вакуолой, называется включение, для внутриклеточного развития. Создание включения и многих других критических процессов достигается путем секреции белков-эффекторов через систему секреции типа III (T3SS)3. Выяснение функций этих секретируемых эффекторов было ограничено в течение многих лет из-за генетической неразрешимости C. trachomatis. В отличие от кишечной палочки,многие классические методы клонирования не применимы к хламидиозу. Несколько основных ограничений включают эффективность преобразования, отсутствие контротбора репортеров, таких как sacB, и плазмидное обслуживание. В то время как E. coli плазмиды, как правило, поддерживается на неопределенный срок с происхождением репликации и соответствующего селективного давления, C. trachomatis плазмиды требует дополнительных восьми открытых кадров чтения(pgp1-8) для обслуживания, которые находятся на родном pL2 плазмида в L2 serovar4.
В последние годы было несколько генетических инструментов, созданных, которые вмещают уникальной биологии Хламидия, но Есть еще ограничения5,6,7. Химический мутагенез с помощью этилового метанасульфоната (EMS) лечение может привести к неправильной мутации, или (менее часто) может привести к нуклеотидных переходов введения преждевременной остановки кодон, чтобы дать нонсенс мутации8. Транспосона вставка эффективна для нарушения генов, но современные технологии в исследованиях хламидиоза трудоемкие и отнимают много времени9. Как методы лечения EMS, так и методы транспозогенеза генерируют случайные мутации и требуют строгих методов скрининга для изоляции штаммов мутантов. Метод нарушения генов путем вставки интронов группы II (например, TargeTron) позволяет направлять мутагенез; однако, этот метод ограничен эффективностью, и место вставки не всегда правильно предсказано10.
Флуоресценция сообщили аллельский обмен мутагенез (FRAEM) является стратегия, используемая для целевого удаления генов в сочетании с вставкой выбора кассеты предоставления устойчивости к антибиотикам и флуоресценции репортер11. Тем не менее, FRAEM осложняется потенциалом вызванных кассетами полярных эффектов на нисходяизны гены, особенно при ориентации генов в полицистронных оперонов. Floxed кассета аллельный обмен мутагенез (FLAEM) является новый генетический подход, разработанный для облегчения кассеты индуцированных полярных эффектов, ранее наблюдалось с FRAEM выбор кассеты12. FLAEM использует редактирование генома Cre-loxP для удаления кассеты выбора и восстановления экспрессии низшихих генов. Отборочная кассета, содержащая устойчивость к антибиотикам и зеленый флуоресцентный белок (GFP), перестроена с фланговыми участками локса. Эти локс-сайты могут рекомбинироваться в присутствии рекомбиназы Cre и привести к иссечению кассеты из генома13. Эта стратегия была показана, чтобы облегчить кассеты индуцированных полярных эффектов при ориентации tmeA для удаления12,14.
Оба метода FRAEM и FLAEM используют один и тот же вектор самоубийства, pSUmC 4.0, который может быть условно поддерживается через индуцируемое выражение pgp6. Выражение pgp6 ранее было показано, что необходимо для удержания плазмида и поэтому используется для контроля плазмидобслуживания обслуживания11,15. Когда C. trachomatis выращивается в средствах массовой информации, дополненной анигэсустететециклин (aTc), чтобы вызвать выражение pgp6, вектор сохраняется. При отсутствии aTc вектор теряется. Целенаправленное удаление гена достигается путем аллельного обмена гена для селекционной кассеты. 3 кб регионов непосредственно вверх по течению и вниз по течению целевого гена служат в качестве гомологии оружия для рекомбинации. Эти руки клонируются в вектор pSUmC 4.0, обрамляющий кассету выбора. Успешная трансформация C. trachomatis и рекомбинационные события наблюдаются через флуоресцентную отчетность. Выражение mCherry на векторном позвоночнике и gfp в пределах выделенной кассеты дает красные и зеленые флуоресцентные включения. Как только aTc извлекается от средств культуры, зеленые-только включения показывают успешно случаи рекомбинации с потерей вектора суицида и интеграции кассеты выбора в бактериальный геном.
FLAEM представляет собой расширение FRAEM через последующее преобразование рекомбиназы-выражения вектор, pSU-Cre, в недавно созданный штамм мутантов. Рекомбиназа крема облегчает рекомбинацию между участками loxP и иссечение кассы выбора. События рекомбинации указываются с помощью флуоресценции. Вектор ПГУ-Кре кодирует mCherry; таким образом, успешное преобразование указывается добавлением красной флуоресценции в gfp-выражениевключений. Культивирование при отсутствии селективного давления для кассеты приводит к рекомбинации cre-опосредованности на участках loxP, а потеря кассеты указывается только красными включениями. Как и в pSUmC-4.0, индуцируемое выражение pgp6 используется для условного поддержания pSU-Cre. Как только aTc и выбор антибиотика извлекаются, плазмида вылечена, и результирующее немаркерный штамм удаления нефторный. Этот метод решает проблему вызванных кассетами полярных эффектов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Дизайн и сборка pSUmC-4.0 с гомологических оружия Конкретные гена интересов
- Определите области 3 кб непосредственно вверх по течению и вниз по течению гена, предназначенного для удаления, чтобы служить в качестве 5' и 3' гомологических оружия для гомологионной рекомбинации (Рисунок 1).
- Дизайн ПЦР праймеры до 1) усилить 3 кб 5 'гомологические руки из хламидиальной геномной ДНК и 2) содержат 15-30 bp свес, характерный для pSUmC-4.0 при переваривании на месте фермента ограничения Sall. Убедитесь, что грунтовые области, перекрывающиеся с pSUmC-4.0, имеют температуру плавления 55 градусов по Цельсию и что температура плавления шпильки для всей грунтовой части будет йlt;35 c.
- Дизайн ПЦР праймеры до 1) усилить 3 кб 3 'гомологии руку из хламидиальной геномной ДНК и 2) содержат 15-30 bp свес, характерный для pSUmC-4.0 при переваривании на сайте ограничения SbfI фермента. Убедитесь, что грунтовые области, перекрывающиеся с pSUmC-4.0, имеют температуру плавления 55 градусов по Цельсию и что температура плавления шпильки для всей грунтовой части будет йlt;35 c.
- Дизайн ПЦР скрининг атлетов, которые будут усиливать вставку каждой руки гомологии в вектор pSUmC-4.0 после реакции сборки ДНК16. Дизайн этих грунтовки для anneal 500 bp за пределами места ограничения, чтобы легко визуализации продукта ПЦР, даже если вставка была неудачной (Рисунок 1).
- Усиль 3 кб 5' и 3' гомологические руки из свежеизвлекаемой хламидиальной геномной ДНК ПЦР в одной-двух реакциях, чтобы дать достаточно фрагмента для последующей сборки ДНК. Следуйте протоколу производителя полимеразы ДНК для конкретных населок реакции и условий езды на велосипеде.
- Убедитесь, что оба продукта ПЦР являются правильным размером и что реакции не содержат никаких загрязняющих полос. Выполнить 5 ЗЛ каждой реакции ПЦР на 1% ДНК агарозный гель.
- Очистите и сконцентрируйте фрагменты ПЦР путем извлечения фенола/хлороформа и осадков этанола.
- Объедините все 3' ПЦР реакции вместе в трубке 1,5 мл и довести до окончательного объема 200 КЛ с нукле-бесплатно H2O. Повторите этот процесс для 5' ПЦР реакций.
- Добавьте 200 кl фенола к каждой трубке и вихрю для 30-60 s. Спин каждая трубка в микроцентрифуге на йgt;21,000 x g на 20 минут при комнатной температуре (RT).
- Перенесите верхний слой каждой трубки в новую трубку объемом 1,5 мл, добавьте одну десятую объема ацетата 3 М натрия к каждой трубке, затем прольйте, чтобы смешать.
- Добавить 3 тома 100% этанола к каждой трубке и Флик, чтобы смешать. Инкубировать обе трубы при -80 градусах по Цельсию в течение 20 мин.
- Пеллет ДНК, вращая каждую трубку на йgt;21,000 х г в течение 5 минут на RT. Отбросьте супернатант.
- Вымойте гранулы ДНК с 100 зл 70% этанола. Спин каждой трубки на йgt;21,000 х г в течение 5 минут на RT. Отбросьте супернатант.
- Снова вымойте гранулы ДНК 100 зл 100% этанола. Спин каждой трубки на йgt;21,000 в течение 5 минут на RT. Отбросьте супернатант.
- Пусть гранулы полностью воздух-сухой, а затем осторожно resuspend ДНК в 12 Зл нукле-бесплатно H2O, щелкая, чтобы смешать.
- Дайджест 500 нг вектора pSUmC-4.0 в 20 л реакции с 1 единицей Sall и 1 единицей SbfI в соответствии с протоколом производства. Инкубировать реакцию в течение примерно 3 ч или на ночь, чтобы обеспечить полное переваривание переносчика.
- Очистите и сконцентрируйте переваренный позвоночник путем экстракции фенола/хлороформа и осадков этанола, как описано ранее (шаг 1,7,1–1,7.9).
- Объедините переваренный вектор pSUmC-4.0 и как 5' и 3' гомологические руки ПЦР продукты вместе в соотношении 0,01 pmol pSUmC-4.0 до 0.09 pmol каждая рука гомологии. Соберите фрагменты в реакции сборки ДНА согласно протоколу изготовления.
- Преобразуйте 50 зл электрокомпетентной кишечной палочки с 1 л реакции сборки ДНК. Плита преобразованы E. coli на LB агар пластин, содержащих 100 мкг / мл спектриномицина путем распространения 150 л. на тарелку. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия на ночь.
- На следующий день, экран колоний для зеленого и красного флуоресценции с помощью эпифлюоресценции перевернутый микроскоп. В общей сложности 5-30 колоний на агар пластины, как ожидается.
- Выберите 5-10 колоний, чтобы привить 4 мл бульона LB дополнен ы 100 мкг/мл спектриномицина. Инкубировать культур при 37 градусах Цельсия ночь с тряской при 250 об/мин.
- Используя ночные культуры кишечной палочки, выполняйте мелкомасштабную очистку ДНК. Выясните ДНК с 50 зл нуклеазы без H2O.
- Подтвердите включение каждой руки-гомологии в вектор pSUmC-4.0 с помощью праймеров пЦР скрининга (разработанных в шаге 1.4) для усиления каждой вставки. Если сборка ДНК успешна, в 1% агарозного геля ДНК должно быть обнаружено 4 кБ. Продукт ПЦР стоимостью 1 кБ указывает на отсутствие вставки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вставка оружия homology неудачно в двойной реакции сборки части, то выполните 2 реакции агрегата для того чтобы вставить рукоятки 5' после этого 3' рукоятки, индивидуально. Дайджест вектор только с Sall перед сборкой с 5 ' руку, а затем переварить вектор с SbfI собрать 3 ' руку. - Преобразование плотины-/ dcm- компетентные E. coli с 200 нг pSUmc-4.0 собраны с обеих гомологических оружия. Плита преобразованных бактерий на LB агар пластин, содержащих 100 мкг /мл спектриномицина путем распространения 25 ЛЛ на тарелку. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия на ночь. Ожидается в общей сложности 20-200 колоний.
- Экран пластин для красных и зеленых флуоресцентных колоний, как описано в шаге 1.13.
- Настроили культуру для крупномасштабной очистки ДНК путем прививки 100 мл бульона LB, содержащего 100 мкг/мл спектриномицина с красными и зелеными колониями. Инкубировать культуру при 37 градусах Цельсия на ночь с тряской при 250 об/мин.
- Урожай культуры и очистить ДНК с помощью крупномасштабной очистки ДНК.
- Приостановить очищенную плазмидную ДНК в 100 Зл NF-H2O. Общий выход ДНК не менее 2 мкг/Л идеально подходит для преобразования C. trachomatis.
- Последовательность 5' и 3 ' гомология руки регионов для обеспечения правильной сборки в pSUmC-4.0 до преобразования C. trachomatis.
2. Преобразование C. trachomatis с pSUmC 4.0 - Гомологические оружия для удаления генов Аллелик exchange
- Семена Маккой клетки, мыши фибробласты стандартно используется для выращивания хламидиоз, в двух 6 хорошо пластин (1 х 106 клеток / хорошо) с ростом медиа #1. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 до тех пор, пока монослой не слив (примерно 24 ч).
- В трубке 1,5 мл добавьте объем C. trachomatis WT серовар L2 элементарных тел (EBs), что достаточно, чтобы заразить 12 скважин 6 пластины хорошо на МВД 2. Пеллет EBs на йgt;20,000 х г в течение 30 минут, а затем отказаться от супернатанта.
- Инициировать хламидийную трансформацию, осторожно применяя EBs в 600 qL буфера CaCl2, а затем добавить 24 мкг pSUmC-4.0 й homology оружия в трубку. Аккуратно перемешайте решение, щелкнув. Инкубировать трубку на RTfor 30 мин и Флик, чтобы смешать каждые 10 минут.
- Добавьте решение преобразования к 24 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) и перемешайте, аккуратно потворуя. Передача 2 мл инокулума к каждой скважине сопливых клеток Маккой в 6 скважинных пластинах и заразить центрифугированием при 900 х г на 1 ч при 20 градусах Цельсия.
- Удалить инокулум и заменить 2 мл/ хорошо RPMI рост медиа-#2. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
- После минимум 7 ч, но не более 12 ч, замените носители 2 мл/хорошо выбора носителя #1. Продолжить инкубацию при 37 градусах По цельсии в течение 48 ч с момента заражения.
- Урожай и прохождение бактерий на свежий монослой клеток Маккой.
- Используя клеточный скребок, аккуратно соскребите монослой Маккой, чтобы поднять клетки в среду. Перенесите материал из каждой скважины в трубку 2 мл. Пеллеты клеточного материала на йgt;20,000 х г в микроцентрифуге в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия.
- Удалите и отбросьте супернатант. Приостановите действие клеточной гранулы в 1 мл HBSS путем мягкого пипетки.
- Пеллети тетрадь в 200 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант на свежий колодец совмещения клеток Маккой. Добавьте дополнительный 1 мл HBSS к каждой скважине общим объемом 2 мл/хорошо.
- Заразить центрифугированием при 900 х г на 1 ч при 20 градусах Цельсия. Замените инокулум с #1 выбора сразу после заражения.
- Продолжить прохождение бактерий на свежий монослой клеток Маккой (раздел 2.7) каждые 48 ч в течение трех или более проходов, пока красные и зеленые включения обнаружены с помощью эпифлюоресценции перевернутый микроскоп 24 ч после инфекции (24 hpi).
- После обнаружения красных и зеленых включений продолжайте прокладку монослой (раздел 2.7) с использованием #2 #2.
- Продолжить прохождение монослой до зеленого только включения обнаружены 24 hpi (проход #3 или позже), что указывает на потерю pSUmC-4.0 вектор и включение loxP выбор кассеты в геном.
- Выберите один колодец только зеленый включений, чтобы обогатить путем прохождения. Урожай и замораживание любых других скважин, которые также содержат только зеленые включения в сахарозе-фосфат-глутамата буфера (SPG).
- Чтобы обогатить только зеленые включения, проход монослой из одного колодца 6 хорошо пластины, как это делается в шаге 2.7, но после гранулирования клеточного мусора (шаг 2.7.3), передать супернатант в конический с 12 мл HBSS. Используйте этот инокулум, чтобы заразить две 6 пластины хорошо, добавив 2 мл на хорошо, а затем спина пластин на 900 х г в течение 60 минут при 20 градусах Цельсия.
- Чтобы заморозить дополнительные скважины, собирай монослой как в шаге 2.7.1, но приостанавливай гранулы в 1 мл СПГ вместо HBSS. Пелле клеточного мусора (шаг 2.7.3) и передать супернатант в криотубеш 1,5 мл. Заморозить материал при -80 градусах По Цельсию.
- После обогащения только зеленых включений в МВД 0,5-1,0 (от одного до двух проходов после обнаружения), урожай монослой в SPG, как описано в шаге 2.11.2. Получить aliquots 50 л в 1,5 мл труб и заморозить при -80 градусов по Цельсию.
- Титер зеленый только бактерии для определения включения, формирование единиц / Зл, в соответствии со стандартным протоколом титрования17.
3. Клональная изоляция только зеленый C. trachomatis Удаление мутант, содержащий loxP Flanked Выбор кассеты путем ограничения разбавления
- Семя 384 хорошо ткани культуры пластины с 50 qL клеток Маккой на 2000 клеток / хорошо в росте средств массовой информации #1. Инкубировать при 37 градусах Цельсия с 5 % CO2 для 24 ч или до слияния.
- Разбавить аликвот зеленых бактерий только в HBSS для достижения 50 EBs на 20 мл. Перенесите разбавленный инокулум в поднос резервуара.
- Удалите средства массовой информации из 384 хорошо пластины, твердо стряхивая всю тарелку вверх дном в контейнер для отходов. Используя многоканальный пипетку, добавьте 50 КЛ C. trachomatis inoculum к каждой скважине. Заразить центрифугированием при 900 х г на 1 ч при 20 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, чтобы не щелкнуть так сильно, что монослой отделяется. Если клетки чрезмерно сливны, они будут отсоединяться легче.
- Удалите средства массовой информации из 384 хорошо пластины, твердо стряхивая всю тарелку вверх дном в контейнер для отходов. Используя многоканальный пипетку, добавьте 50 КЛ C. trachomatis inoculum к каждой скважине. Заразить центрифугированием при 900 х г на 1 ч при 20 градусах Цельсия.
- Удалите инокулум, щелкнув и замените 50 л/колодец медиа-#2. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе интеграция кассеты выбора в геном стабильна, поэтому отбор антибиотиков с спектромицином больше не требуется. - После инкубации пластины в течение 5-12 дней, определить отдельные скважины с зелеными флуоресцентными включениями с помощью эпифлюоресцентного перевернутого микроскопа или платформы скрининга высокого содержания.
- Урожай скважин с зелеными только включений путем соскабливания монослой с p-10 наконечник и передачи всего содержимого колодца в трубку, содержащую 2 мл HBSS. Аккуратно перемешать и применить 2 мл инокулума на свежий сопло Маккой монослой в 6 хорошо пластины для инфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: При идентификации отдельных скважин с включениями включения будут находиться в кластере в связи с расширением от первоначального включения. Если скважина имеет несколько кластеров, вполне вероятно, что более одного EB первоначально инфицированных, что хорошо. Эти скважины не должны быть собраны, и в некоторых случаях, несколько раундов клональной изоляции путем последовательного разбавления может быть необходимо. - Заразить 6 хорошо пластины центрифугирования на 900 х г на 1 ч при 20 градусов по Цельсию. Замените инокулум на 2 мл/колодец, медиа-#2. Инкубировать при 37 градусах Цельсия с 5 % CO2 на 48 ч.
- Повторите шаги 2.11-2.13 для обогащения, замораживания и титера клональных популяций.
- Подтвердите удаление целевых генов из клонально изолированных C. trachomatis с помощью qPCR, как ранее описано12.
4. Преобразование C. trachomatis FRAEM Мутант с pSU-Cre инициировать удаление loxP Flanked Выбор кассеты
- Повторите процесс преобразования в 6 скважинной пластине, как описано ранее (шаги 2.1-2.8) с помощью клонально изолированного C. trachomatis FRAEM mutant, вектора pSU-Cre и #3 подбора средств.
ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная трансформация указывается включений, которые красные и зеленые флуоресцентные.- Прохождение монослой до тех пор, пока красные включения не будут обнаружены с помощью перевернутого эпифлюоресценции, что указывает на потерю выделенной кассеты (два-три прохода). Продолжайте проходить мимо монослой до тех пор, пока включения только для красного цвета не обогащаются до МВД в размере 0,5 евро.
- Клонально изолировать красные включения, ограничивая разбавление в 384 скважины пластины, как описано ранее (шаги 3,1-3,8); однако для всех шагов используйте #3 #3 выбора.
- Обогащают клональные популяции, проходя до МВД 0,1. После обогащения, заменить раздел сми с ростом средств массовой информации #2 инициировать потерю pSU-Cre вектор (примерно три-четыре прохода).
- Клонально изолировать нефторесцентные бактерии (шаги 3.1-3.8); однако, вручную сканировать пластину с ярко-поля микроскопом для обнаружения включений. Обогащать и замораживать бактерии (шаг 2.11-2.12).
- Экран для штамма мутантов с использованием количественного в реальном времени ПЦР, западного blotting, и весь геном ДНК секвенирования, как ранее описано12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод удаления бесмаркеров генов c. trachomatis с использованием FLAEM зависит от тщательного клонирования и методов трансформации. Успешная аллеливая рекомбинация является важным первым шагом и требует идентификации и вставки гомологических рук в вектор клонирования pSUmC-4.0 (Рисунок 1). Важным вторым шагом для удаления без маркеров гена является удаление флуоресценции репортера и антибиотиков выбор кассеты Cre-lox редактирования генома, представлены на рисунке 2. Векторы, используемые для выполнения каждого из этих шагов, аннотированы на рисунке 3. На рисунке 4 показано схематическое представление стратегии трансформации для создания необезличного мутанта удаления при запуске с дикого типа C. trachomatis.
Репрезентативные данные показаны на рисунке 5 и рисунке 6,в которых tmeA предназначен для удаления генов. Штамм удаления C. trachomatis tmeA генерируется с помощью FRAEM, а штамм C. trachomatis tmeA-lx генерируется с помощью FLAEM. Оба штамма мутанта содержат удаление локуса tmeA; однако, tmeA-lx не содержит кассету выбора, о чем свидетельствует отсутствие ДНК gfp, показанной на рисунке 5. Штамм мутантов tmeA снизил экспрессию tmeB,показанный на рисунке 6 мРНК и уровнями белка. Когда FLAEM используется для создания штамма мутантов tmeA-lx, рисунок 6 показывает, что выражение tmeB восстанавливается.
Рисунок 1: Схематическое представление для определения 5' и 3' гомологических оружий от геномной ДНК и ПЦР скрининга для их вставки в pSUmC-4.0. (A) Ген, предназначенный для удаления из генома C. trachomatis представлен голубой стрелкой. 3 кб регионов, определенных в качестве 5' и 3'гомологических оружия для аллеливой рекомбинации в скобках в фиолетовый и красный, соответственно. (B, C) Введение 5' и 3' гомологических оружия в pSUmC-4.0 определяется пЦР скрининга. Участки фермента ограничения Sall и Sbfl показаны фланговым и есть аада (черная стрелка) и кассета выбора gfp (зеленая стрелка), которая окружена участками локса (желтые квадраты) на векторе pSUmC-4.0. (B) Нет вставки определяется 1 кБ ПЦР продукт, когда 5' скрининг грунтовки (фиолетовый стрелка головы) используются для PcR усилить через сайт Sall, или 3' скрининг грунтовки (красные стрелки головы) используются для усиления через сайт SbfI. (C) Успешная вставка определяется 3 kb ПЦР продуктов при тех же условиях. 5' и 3' гомология оружия представлены фиолетовый и красный скобки, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схематическое представление Cre-lox опосредоченной рекомбинации, чтобы удалить кассету выбора gfp-aadA. В присутствии cre recombinase, локс-сайты (желтый) рекомбинируются, что приводит к иссечению gfp-aadA выбор кассеты (зеленые и черные квадраты). В результате локус показан, содержащий один оставшийся локсP шрам последовательности. Вверх по течению (США) и вниз по течению (DS) области отображаются серым цветом. Эта цифра была изменена с Keb et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Генетическая организация pSUmC-4.0 и пГУ-CRE. Для управляемого поддержания векторов в C. trachomatis, pgp6 разработан ниже по течению тетрациклина-индуцируемого промотора. Остальные гены pgp находятся ниже по течению их родных хламидийных промоутеров, и mCherry constitutly выражен на обоих векторах. (A) pSUmC-4.0 содержит кассету, кодирующую, составляющую, выраженную aadA и gfp гены для антибиотиков и флуоресценции возможности отбора, соответственно. ЛоксФ сайтов для Cre опосредоченной рекомбинации, а также ограничения ферментсайтов для вставки гена конкретных гомологических рук фланга выбора кассеты. (B) pSU-CRE содержит аналогичную основу для pSUmC-4.0; тем не менее, вместо рекомбинации кассеты, blaM и cre constitutively выражены для селективности антибиотиков и поколения рекомбиназы CRE, соответственно. Эти цифры были изменены из Кеб и др.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Схематическое представление стратегии трансформации FLAEM, используемой для создания мутанта для удаления без маркеров. Общий метод FLAEM представлен здесь, где дикий тип C. trachomatis последовательно преобразуется и последовательно проходит для создания неточного удаления мутанта. Шаги трансформации представлены добавлением небольших стрел, а потеря генетических элементов – вычитанием мелких стрел. C. trachomatis промежуточные (круги) представлены с чувствительностью к антибиотикам (пенициллин-устойчивые или пенициллилин чувствительных PenGr или PenGs; спектромицин-резистентный или спектромицин чувствительный s Specr или Specs)и флуоресценции-отчетности качества (зеленый g fp, красный Под приведены схемические представления генного локуса на каждом шагу. Эта цифра была изменена с Keb et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: FRAEM и FLAEM используются для генерации генов tmeA. (A) FRAEM был использован для генерации tmeA, и FLAEM был использован для генерации tmeA-lx. Относительные номера копий ДНК tmeA и вниз по течению tmeB; gfp, содержащиеся на кассете выбора pSUmC-4.0; и cre, содержащиеся на pSU-CRE вектор все показаны. Клетки Маккой, инфицированные равными единицами включения WT, L2 tmeAили L2RiftmeA-lx C. trachomatis, были собраны при 24 hpi, а ДНК была извлечена для qPCR. Относительные номера копий оценивались путем нормализации сигнала к хламидидии 16sRNA. ND - ни один не обнаружен. (B) Секвенированный локус tmeAB от L2RiftmeA-lx показан с одной оставшейся последовательностью шрамов loxP (подчеркнуто). Фланговые области ДНК показаны синим цветом, стартовые кодоны показаны зеленым цветом, а кодон остановки TmeA показан красным цветом. Также изображен неканонический стартовый кодон для TmeB. Эти цифры были изменены из Кеб и др.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Иссечение кассеты выбора с помощью FLAEM восстанавливает экспрессию tmeB при таргетинге tmeA и не нарушает нистого гена. (A) Относительный уровень мРНК C. trachomatis tmeA и tmeB мутант штаммов. Наличие стенограмм ниже по течению tmeA было определено обратной транскриптазой (RT) количественной ПЦР. Область, непосредственно ниже по течению от tmeA/B operon кодирует ct696. Всего РНК была изолирована на 24 hpi из клеток Маккой инфицированных в МВД 1 с WT, L2 tmeA, L2 tmeB, или L2RiftmeA-lx. Стенограммы для tmeA, tmeBи ct696 были обнаружены qRT-PCR. Сигналы представлены после нормализации rpoD. ND - ни один не обнаружен. (B) Западная поместье для присутствия TmeA и TmeB в C. trachomatis мутант штаммов. Равное количество цельно-культурного материала из 24 культур hpi, зараженных равными единицами включения WT, L2 tmeA, L2RiftmeA-lx, или L2RiftmeA-lx ptmeA были исследованы в иммуноблотах для TmeA и TmeB. Hsp60 использовался в качестве контроля нагрузки, а белки были визуализированы хемилюминесценцией. Рисунок был изменен из Кеб и др.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь для генерации маркеров удаления генов в C. trachomatis FLAEM позволяет целенаправленное удаление несущественных генов и устраняет кассетные полярные эффекты. Протокол опирается на тщательную конструкцию 5' и 3' гомологии оружия вставлены в pSUmC 4.0 вектор самоубийства, эффективное преобразование C. trachomatis, и тщательный скрининг изолированных штаммов мутантов. Успешная инженерия генома с помощью этого метода приводит к бактериям, которые не являются флуоресцентными и содержат одну последовательность рубцов loxP в месте целевого удаления генов. Кроме того, этот метод может быть адаптирован для последовательного ориентации генов в рамках того же штамма C. trachomatis.
Тщательный дизайн 5' и 3' гомологии оружия и вставки в вектор самоубийства является первым и наиболее важным шагом процесса клонирования. Было установлено, что 3 кБ гомологические оружия обеспечивают наиболее эффективную аллеливую рекомбинацию. В то время как вставка этих рук генерирует вектор, который является большим, а иногда и трудно работать, было меньше успеха с более короткими руками, с 2 кб, представляющих собой минимум для успеха. Использование сайтов с ограничением Sall и Sbfl обеспечивает удобную одношаговую реакцию строительства при выполнении сборки ДНК.
Другие методы клонирования, такие как вставка ПЦР, также были эффективными в вставке гомологических рукояток, но они вводят большую возможность ошибок на основе ПЦР. Интересно, что было отмечено, что клонирование 5 ' руку является сравнительно более эффективным, чем 3 ' руку. При возникновении проблемы рекомендуется разделить сборку ДНК на две реакции и поэтапно построить вектор. Затем рекомендуется переварить вектор позвоночника с SbfI, вставить 3 ' руку, а затем переварить вектор с Sall и вставить 5 ' руку во второй реакции сборки ДНК.
При усилении фрагментов ПЦР для гомологического оружия рекомендуется также использовать свежеочищенную геномную ДНК C. trachomatis, которая ранее не была заморожена. Это ограничивает возможность стрижки ДНК и повышает эффективность генерации больших ампликонов. Если усиливая рукоятки homology от другого вектора, то очищенный продукт PCR будет нужно быть энзимом ограничения DpnI обработанным перед продолжать к сборке дна для уменьшения колоний предпосылки во время преобразования e. coli.
Трансформация является еще одним важным шагом этого протокола, в котором могут возникнуть проблемы. Если преобразование с pSUmC 4.0 является успешным, зеленые и красные включения должны быть видны путем прохождения #3; однако, это может занять еще несколько проходов, прежде чем трансформанты обогатятся. Как и другие подходы мутагенеза, этот метод ограничивается таргетинг несущественных генов, но преобразование все еще должно быть легко достигнуто. Долгосрочное прохождение трансформаторов при отсутствии аллельного обмена, о чем свидетельствует сохранение красной флуоресценции, может свидетельствовать о том, что удаление целевого гена является смертельным событием.
Поскольку переносные векторы преобразования для C. trachomatis содержат то же происхождение репликации, что и родной pL2, это не редкость для родной плазмиды, чтобы быть вылечены после нескольких (Зтт;5) проходов. Гены pgp на векторах pSUmC находятся в другом порядке по сравнению с родным pL2; таким образом, ПЦР может быть использован для обнаружения присутствия pL2 в изолированном штамме путем усиления области, охватывающей pgp7-pgp8. Если родная плазмида теряется при окончательном удалении мутанта, его необходимо будет вновь ввести перед проведением исследований в области развития. Боковая передача генов (LGT) может быть использована для повторного введения плазмиды pL219.
Во многих случаях, раннее удаление мутантов с выделением кассеты по-прежнему содержат pL2 плазмиды. Мы использовали эти штаммы для LGT с успехом, чтобы вновь pL2 и избежать ремонта удаленного гена. LGT также может быть использован в качестве вторичного метода для преобразования при внедрении pSU-Cre. В некоторых случаях LGT был более эффективным, чем классическая трансформация CaCl2. В тех случаях, когда LGT используется для введения pSU-Cre, важно начать с C. trachomatis, которые выражают аллель rpoB, который предоставляет сопротивление рифампина до аллельный обмен и вставки spectinomycin выбор кассеты12,19. Начиная с рифампина устойчивых бактерий позволяет выбор после совместной культуры.
FLAEM позволяет обратно-генетические подходы с целевым удалением целых последовательностей кодирования, по сравнению с другими генетическими методами, которые полагаются на случайный мутагенез или вставки нуклеотидных последовательностей для достижения нарушения генов. FLAEM по существу является продолжением FRAEM, так как он позволяет удалить кассету выбора и устраняет ранее наблюдаемые кассеты индуцированных полярных эффектов. Этот метод также создает возможность для создания нескольких генов удаления в одном штамме C. trachomatis.
Несколько мутаций могут быть генерируются с помощью двух различных механизмов. В первом, FLAEM может быть использован для создания маркеров мутации гена и последовательно используется для целевой другой ген в том же штамме. Первый мутант удаления может быть преобразован с pSUmC 4.0 вектор, содержащий гомологии оружия, характерного для вторичного гена интереса. В этом случае протокол должен повторяться так же, как первое удаление и повторять несколько раз, чтобы целевой генов последовательно. Во втором механизме, маркербезный мутант удаления изолированы после FLAEM могут быть совместно инфицированы с удалением мутант, который по-прежнему содержит выбор кассеты. Через LGT, второе удаление приобретается и может быть выбрано для. При использовании этого подхода дополнительные мутации ограничиваются количеством уникальных съемных кассет, оставшихся в геноме. Обычно используемые антибиотики, используемые в качестве селективного давления во время трансформации ограничены для C. trachomatis, но они включают пенициллин, хлорамфеникол, и спектромицин. Удаление кассеты выбора путем редактирования генома Cre-loxP уменьшает необходимость использования нескольких антибиотиков для селективного давления. Удалять несколько последовательностей генов одновременно полезно при изучении белков с сопутствующими функциями или биологических процессов, которые могут иметь несколько ключевых игроков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Службы общественного здравоохранения от Национального института здравоохранения, NIAID (гранты A1065530 и Al124649), к.А. Филдс.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam-/dcm- Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
References
- World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).
- Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
- Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
- Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239 (2009).
- Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
- Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
- Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
- LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343 (2019).
- Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989 (2013).
- Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817 (2016).
- Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).
- Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
- McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640 (2017).
- Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
- Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
- Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142 (2013).
- Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).
