Markerless Gene Sletning af Floxed Kassette Allelic Exchange Mutagenesis i Klamydia trachomatis
Summary
Beskrevet her er en metode til målrettet, markørløs gensletning i Klamydia trachomatis ved hjælp af floxed kassette allelic udveksling mutagenese, FLAEM.
Abstract
Klamydia trachomatis er en forpligte intracellulær patogen, der har været historisk vanskeligt at genmanipulere. De endelige fremskridt med hensyn til at belyse de mekanismer, som C. trachomatis bruger til at skabe og opretholde en privilegeret intracellulær niche, har været begrænsede på grund af mangel på genetiske værktøjer. Heldigvis har der for nylig været flere nye fremskridt inden for genetiske manipulationteknikker. Blandt disse er udviklingen af fluorescensrapporterede allelic udveksling mutagenese (FRAEM). Denne metode giver mulighed for målrettet gensletning kombineret med indsættelse af en udvælgelsekassette kodning antibiotikaresistens og grøn fluorescerende protein (GFP). Afhængighed af denne strategi kan være kompliceret, når de målretter mod gener inden for polycistroniske operoner på grund af potentialet i polære virkninger på downstream-gener. Floxed kassette allelic udveksling mutagenese (FLAEM), protokollen for hvilken er beskrevet her, blev udviklet til at lindre kassette-induceret polareffekter. FLAEM udnytter Cre-loxP genom redigering for at fjerne udvælgelsen kassette efter målrettet sletning ved allelic udveksling. De resulterende stammer indeholder markørløse gensletninger af en eller flere kodningssekvenser. Denne teknik letter direkte vurdering af genfunktion og udvider repertoiret af værktøjer til genetisk manipulation i C. trachomatis.
Introduction
Klamydia trachomatis er den hyppigste årsag til bakteriel seksuelt overførte sygdomme og udgør en betydelig byrde for menneskers sundhed. Over 100 millioner mennesker er smittet hvert år med C. trachomatis1. Ca. 70% af infektioner hos kvinder er asymptomatisk på trods af skadelige reproduktive sundhedsmæssige virkninger, såsom underlivsbetændelse, graviditet uden for livmoderen, og/ eller infertilitet. Sygdomsequela er direkte relateret til immunpatologi initieret af C. trachomatis infektion2. En effektiv vaccine er endnu ikke udviklet; Derfor er forståelse af funktionen af bakterielle virulens faktorer og andre bakterielle genprodukter et vigtigt og presserende forskningsspørgsmål.
Som intracellulære bakterier, vært celle invasion, intracellulære replikation, frigivelse af afkom, og unddragelse af vært immunologiske reaktioner er kritiske processer. C. trachomatis danner en parasitophorous membran bundet vacuole, kaldes en optagelse, for intracellulære udvikling. Etablering af inklusion og mange andre kritiske processer opnås ved udskillelse af effektorproteiner via et type III-sekreionssystem (T3SS)3. Det var i mange år begrænset at belyse disse udskillede effektorers funktioner på grund af C. trachomatis’genetiske uhåndterlighed. I modsætning til E. coligælder mange klassiske kloningsteknikker ikke for Klamydia. Et par store begrænsninger indebærer transformation effektivitet, mangel på kontravalg journalister såsom sacB, og plasmid vedligeholdelse. Mens E. coli plasmider generelt kan holdes på ubestemt tid med en oprindelse af replikation og passende selektivt tryk, C. trachomatis plasmids kræver yderligere otte åbne læserammer(pgp1-8) for vedligeholdelse, der findes på den indfødte pL2 plasmid i L2 serovar4.
I de seneste år har der været flere genetiske værktøjer genereret, der rummer Klamydia unikke biologi, men der er stadig begrænsninger5,6,7. Kemisk mutagenese ved ethyl metanulfonat (EMS) behandling kan indføre missense mutationer, eller (mindre hyppigt) kan resultere i nukleotid overgange indføre en for tidlig stop codon til at give en nonsens mutation8. Transposon indsættelse er effektiv til genforstyrrelser, men den nuværende teknologi i Klamydia forskning er besværlig og tidskrævende9. Både EMS behandling og transposon mutagenesis teknikker generere tilfældige mutationer og kræver strenge screening metoder til at isolere mutant stammer. En metode til at forstyrre gener ved indsættelse af gruppe II introner (f.eks TargeTron) giver mulighed for rettet mutagenesis; Denne metode er dog begrænset af effektivitet, og indsætningsstedet er ikke altid korrekt forudsagt10.
Fluorescensrapporterede allelic udveksling mutagenese (FRAEM) er en strategi, der anvendes til målrettet gensletning kombineret med indsættelse af en udvælgelse kassette giver antibiotikaresistens og en fluorescens reporter11. Men FRAEM kompliceres af potentialet i kassette-induceret polareffekter på downstream gener, især når de målretter gener inden for polycistronic operons. Floxed kassette allelic udveksling mutagenese (FLAEM) er en ny genetisk tilgang udviklet til at lindre kassette-induceret polære virkninger tidligere observeret med FRAEM udvælgelse kassette12. FLAEM udnytter Cre-loxP genom redigering for at fjerne udvælgelsen kassette og genoprette udtryk for downstream gener. Den udvælgelse kassette, der indeholder antibiotikaresistens og grønne fluorescerende protein (GFP) er reengineered med flankerende loxP sites. Disse loxP steder kan rekombinere i overværelse af Cre rekombinase og resultere i excision af kassetten fra genomet13. Denne strategi har vist sig at afhjælpe kassetteinducerede polære effekter , når tmeA målrettes med henblik på sletning12,14.
Både FRAEM og FLAEM metoder udnytte den samme selvmord vektor, pSUmC 4,0, som kan konditioneres gennem utilgængelige udtryk for pgp6. Udtryk for pgp6 har tidligere vist sig at være nødvendigt for plasmid fastholdelse og er derfor gearet til at kontrollere plasmid vedligeholdelse11,15. Når C. trachomatis dyrkes i medier suppleret med vandfri tetracyklin (aTc) for at fremkalde pgp6 udtryk, vektoren opretholdes. I mangel af aTc, er vektoren tabt. Målrettet gensletning opnås gennem allelic udveksling af genet til udvælgelsekassetten. De 3 kb regioner direkte opstrøms og nedstrøms for det målrettede gen tjene som homology arme til rekombination. Disse arme er klonet ind i pSUmC 4.0 vektor flankerende udvælgelsekassetten. Vellykket C. trachomatis transformation og rekombination begivenheder observeres gennem fluorescens rapportering. Udtryk for mCherry på vektoren rygrad og gfp i udvælgelsen kassette udbytte rød og grøn fluorescerende indeslutninger. Når aTc er fjernet fra kulturmedier, green-only indeslutninger indikerer en vellykket rekombination begivenheder med tabet af selvmord vektor og integration af udvælgelsen kassette i bakteriel genom.
FLAEM repræsenterer en forlængelse af FRAEM gennem efterfølgende omdannelse af en Cre rekombinase-udtrykkende vektor, pSU-Cre, i den nyoprettede mutant stamme. Cre rekombinase letter rekombination mellem loxP steder og excision af udvælgelsen kassette. Rekombinationshændelser er angivet via fluorescensrapportering. PSU-Cre vektor koder mCherry; Således er en vellykket transformation angivet ved tilsætning af rød fluorescens til gfp-udtrykkeindeslutninger. Dyrkning i mangel af selektivt tryk på kassetten resulterer i en sammenkættet rekombination på loxP-stederne, og tab af kassetten angives med ikke-omfattende indeslutninger. Som med pSUmC-4.0, utilgængelig udtryk for pgp6 bruges til betinget at opretholde pSU-Cre. Når aTc og antibiotika udvælgelse er fjernet, plasmid er helbredt, og den resulterende markørløs sletning stamme er nonfluorescerende. Denne metode omhandler spørgsmålet om kassette-induceret polareffekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her for generering af markørløs gensletninger i C. trachomatis af FLAEM giver mulighed for målrettet sletning af uvæsentlige gener og eliminerer kassette-induceret polareffekter. Protokollen bygger på omhyggelig udformning af 5 ‘ og 3 ‘homology arme indsat i pSUmC 4.0 selvmord vektor, effektiv transformation af C. trachomatis, og omhyggelig screening af isolerede mutant stammer. Vellykket genom teknik via denne metode resulterer i bakterier, der er nonfluorescerende og indehol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Public Health Service tilskud fra National Institute of Health, NIAID (tilskud A1065530 og Al124649), til KA Fields.
Materials
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam–/dcm– Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
References
- World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, 207-208 (2012).
- Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
- Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
- Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239 (2009).
- Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
- Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
- Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
- LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343 (2019).
- Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989 (2013).
- Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817 (2016).
- Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).
- Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
- McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640 (2017).
- Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
- Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
- Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142 (2013).
- Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).
