Markørløs gensletting av Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis i Chlamydia trachomatis
Summary
Beskrevet her er en metode for målrettet, markørløs gensletting i Chlamydia trachomatis ved hjelp av floxed kassett allelic exchange mutagenesis, FLAEM.
Abstract
Klamydia trachomatis er et obligatorisk intracellulært patogen som har vært historisk vanskelig å genetisk manipulere. Definitiv fremgang i å belyse mekanismene som C. trachomatis bruker til å skape og opprettholde en privilegert intracellulær nisje har vært begrenset på grunn av mangel på genetiske verktøy. Heldigvis har det nylig vært flere nye fremskritt i genetiske manipulasjonsteknikker. Blant disse er utviklingen av fluorescensrapportert allelic exchange mutagenesis (FRAEM). Denne metoden tillater målrettet gensletting kombinert med innsetting av en utvalgskassett koding antibiotikaresistens og grønt fluorescerende protein (GFP). Avhengighet av denne strategien kan være komplisert når du målretter mot gener innen polycistronic operons på grunn av potensialet for polareffekter på nedstrøms gener. Floxed kassett allelic utveksling mutagenesis (FLAEM), protokollen som er beskrevet her, ble utviklet for å lindre kassett-indusert polareffekter. FLAEM benytter Cre-loxP genomredigering for å fjerne valgkassetten etter målrettet sletting ved allelic exchange. De resulterende stammene inneholder markørløse genslettinger av en eller flere kodesekvenser. Denne teknikken forenkler direkte vurdering av genfunksjon og utvider repertoaret av verktøy for genetisk manipulasjon i C. trachomatis.
Introduction
Klamydia trachomatis er den ledende årsaken til bakteriell seksuelt overførbar sykdom og representerer en betydelig byrde for menneskers helse. Over 100 millioner mennesker er smittet hvert år med C. trachomatis1. Omtrent 70% av infeksjonene hos kvinner er asymptomatiske til tross for skadelige reproduktive helseeffekter, som bekkeninflammatorisk sykdom, ektopisk graviditet, og / eller infertilitet. Sykdomsoppfølgeren er direkte relatert til immunpatologi initiert av C. trachomatis infeksjon2. En effektiv vaksine er ennå ikke utviklet; Derfor er det viktig å forstå funksjonen til bakterielle virulensfaktorer og andre bakterielle genprodukter.
Som intracellulære bakterier er vertscelleinvasjon, intracellulær replikering, frigjøring av avkom og unndragelse av vertsimmunologiske responser kritiske prosesser. C. trachomatis danner en parasitophorous membran bundet vacuole, kalt en inkludering, for intracellulær utvikling. Etablering av inkludering og mange andre kritiske prosesser oppnås ved sekresjon av effektorproteiner via et type III sekresjonssystem (T3SS)3. Belyse funksjonene til disse utskillede effektene var begrenset i mange år på grunn av den genetiske intractability av C. trachomatis. I motsetning til E. coli, mange klassiske kloning teknikker gjelder ikke for Klamydia. Noen få store begrensninger innebærer transformasjoneffektivitet, mangel på motvalgsreportere som sacB og plasmid vedlikehold. Mens E. coli plasmids vanligvis kan opprettholdes på ubestemt tid med en opprinnelse av replikering og passende selektivt trykk, C. trachomatis plasmids krever ytterligere åtte åpne leserammer(pgp1-8) for vedlikehold som finnes på den opprinnelige pL2 plasmid i L2 serovar4.
I de senere årene har det vært flere genetiske verktøy generert som imøtekomme Chlamydia unike biologi, men det er fortsatt begrensninger5,6,7. Kjemisk mutagenesis ved etylmetansulfonat (EMS) behandling kan introdusere feilfølelse mutasjoner, eller (sjeldnere) kan resultere i nukleotid overganger innføre en for tidlig stopp codon å gi en tull mutasjon8. Transposon innsetting er effektiv for genforstyrrelser, men dagens teknologi i Klamydia forskning er arbeidskrevende og tidkrevende9. Både EMS-behandling og transposon mutagenesis teknikker genererer tilfeldige mutasjoner og krever strenge screeningmetoder for å isolere muterte stammer. En metode for å forstyrre gener ved innsetting av gruppe II introner (f.eks. TargeTron) gir mulighet for rettet mutogenese; Denne metoden er imidlertid begrenset av effektivitet, og innsettingsstedet er ikke alltid riktig spådd10.
Fluorescensrapportert allelic exchange mutagenesis (FRAEM) er en strategi som brukes for målrettet gensletting kombinert med innsetting av en utvalgskassett som gir antibiotikaresistens og en fluorescensreporter11. Likevel er FRAEM komplisert av potensialet i kassettinduserte polareffekter på nedstrøms gener, spesielt når man målretter mot gener innen polycistronic operons. Floxed kassett allelic utveksling mutagenesis (FLAEM) er en ny genetisk tilnærming utviklet for å lindre kassett-indusert polareffekter tidligere observert med FRAEM valgkassett12. FLAEM benytter Cre-loxP genomredigering for å fjerne utvalgskassetten og gjenopprette uttrykk for nedstrøms gener. Valgkassetten som inneholder antibiotikaresistens og grønt fluorescerende protein (GFP) er ombygd med flankerende loxP-steder. Disse loxP-områdene kan kombineres i nærvær av Cre recombinase og resultere i utskjæring av kassetten fra genomet13. Denne strategien har vist seg å lindre kassett indusert polareffekter når målretting tmeA for sletting12,14.
Både FRAEM- og FLAEM-metoder bruker samme selvmordsvektor, pSUmC 4.0, som betinget kan opprettholdes gjennom udukanbar uttrykk for pgp6. Uttrykk for pgp6 har tidligere vist seg å være nødvendig for plasmid oppbevaring og er derfor utnyttet til å kontrollere plasmid vedlikehold11,15. Når C. trachomatis dyrkes i media supplert med anhydrotisk tetracyklin (aTc) for å indusere pgp6-uttrykk, opprettholdes vektoren. I fravær av aTc går vektoren tapt. Målrettet gensletting oppnås gjennom allelic utveksling av genet for valgkassetten. De 3 kb regionene direkte oppstrøms og nedstrøms av det målrettede genet tjene som homology armer for rekombinasjon. Disse armene er klonet inn i pSUmC 4.0 vektorflankering av valgkassetten. Vellykket C. trachomatis transformasjon og rekombinasjon hendelser observeres gjennom fluorescens rapportering. Uttrykk for mCherry på vektorryggraden og gfpien innenfor utvalgskassetten gir røde og grønne fluorescerende inneslutninger. Når ATc er fjernet fra kulturmedier, indikerer inkluderte grønne inneslutninger vellykkede rekombinasjonshendelser med tap av selvmordsvektoren og integreringen av valgkassetten i bakteriegenomet.
FLAEM representerer en forlengelse av FRAEM via påfølgende transformasjon av en Cre recombinase-expressing vektor, pSU-Cre, inn i den nyopprettede mutant stammen. Cre recombinase forenkler rekombinasjon mellom loxP-områder og utskjæring av valgkassetten. Rekombinasjonshendelser indikeres via fluorescensrapportering. Den pSU-Cre vektorkoder mCherry; Dermed er vellykket transformasjon indikert ved tillegg av rød fluorescens til gfp-uttrykke inneslutninger. Dyrking i fravær av selektivt trykk for kassetten resulterer i Cre-mediert rekombinasjon på loxP-stedene, og tap av kassetten indikeres av kun rød inneslutninger. Som med pSUmC-4.0 brukes inducible uttrykk for pgp6 til betinget vedlikehold av pSU-Cre. Når aTc og antibiotikavalg er fjernet, er plasmiden kurert, og den resulterende markørløse slettingsstammen er ikke fluorescerende. Denne metoden løser spørsmålet om kassettinduserte polareffekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen som er beskrevet her for generering av markørløse genslettinger i C. trachomatis fra FLAEM tillater målrettet sletting av ikke-essensielle gener og eliminerer kassettinduserte polareffekter. Protokollen er avhengig av forsiktig utforming av 5′ og 3′ homology armer satt inn i pSUmC 4.0 selvmord vektor, effektiv transformasjon av C. trachomatis, og forsiktig screening av isolerte mutant stammer. Vellykket genomteknikk via denne metoden resulterer i bakterier som ikke er fluorescerende og in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Public Health Service tilskudd fra National Institute of Health, NIAID (tilskudd A1065530 og Al124649), til K.A. Fields.
Materials
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam–/dcm– Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
References
- World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, 207-208 (2012).
- Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
- Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
- Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239 (2009).
- Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
- Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
- Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
- LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343 (2019).
- Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989 (2013).
- Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817 (2016).
- Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).
- Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
- McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640 (2017).
- Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
- Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
- Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142 (2013).
- Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).
