क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस में फ्लोक्सेड कैसेट एलीलिक एक्सचेंज मुटाजेनेसिस द्वारा मार्करलेस जीन विलोपन
Summary
यहां वर्णित फ्लोर्सेड कैसेट एलीलिक एक्सचेंज म्यूटाजेनेसिस, फ्लेम का उपयोग करके क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस में लक्षित, मार्करलेस जीन विलोपन के लिए एक विधि है।
Abstract
क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस एक अनिवार्य इंट्रासेलुलर रोगजनक है जिसे आनुवंशिक रूप से हेरफेर करना ऐतिहासिक रूप से मुश्किल रहा है। सी ट्रेकोमेटिस बनाने और एक विशेषाधिकार प्राप्त इंट्रासेलुलर आला बनाए रखने के लिए उपयोग करने वाले तंत्र को स्पष्ट करने में निश्चित प्रगति आनुवंशिक उपकरणों की कमी के कारण सीमित रही है। सौभाग्य से, हाल ही में आनुवंशिक हेरफेर तकनीकों में कई नए अग्रिम हुए हैं। इनमें से फ्लोरेसेंस-रिपोर्ट एलीलिक एक्सचेंज म्यूटाजेनेसिस (FRAEM) का विकास है। यह विधि लक्षित जीन हटाने की अनुमति देती है जिसमें एक चयन कैसेट एन्कोडिंग एंटीबायोटिक प्रतिरोध और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के सम्मिलन के साथ मिलकर बनाया जाता है। डाउनस्ट्रीम जीन पर ध्रुवीय प्रभावों की क्षमता के कारण पॉलीसिट्रोनिक ऑपरॉन के भीतर जीन को लक्षित करते समय इस रणनीति पर निर्भरता जटिल हो सकती है। फ्लोक्सेड कैसेट एलीजेनेसिस (FLAEM), प्रोटोकॉल जिसके लिए यहां वर्णित है, कैसेट-प्रेरित ध्रुवीय प्रभावों को कम करने के लिए विकसित किया गया था। FLAEM एलीलिक एक्सचेंज द्वारा लक्षित हटाने के बाद चयन कैसेट को हटाने के लिए क्रे-लोक्सपी जीनोम संपादन का उपयोग करता है। परिणामस्वरूप उपभेदों में एक या एक से अधिक कोडिंग दृश्यों के मार्करलेस जीन विलोपन होते हैं। यह तकनीक जीन फ़ंक्शन के प्रत्यक्ष मूल्यांकन की सुविधा प्रदान करती है और सी ट्रेकोमेटिस में आनुवंशिक हेरफेर के लिए उपकरणों के प्रदर्शनों की सूची का विस्तार करती है।
Introduction
क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस बैक्टीरियल यौन संचारित रोग का प्रमुख कारण है और मानव स्वास्थ्य के लिए एक महत्वपूर्ण बोझ का प्रतिनिधित्व करता है। सी ट्रेकोमेटिस1से हर साल १००,०००,००० से अधिक लोग संक्रमित होते हैं । महिलाओं में लगभग ७०% संक्रमण हानिकारक प्रजनन स्वास्थ्य प्रभावों के बावजूद स्पर्शोन्मुख होते हैं, जैसे पेल्विक भड़काऊ रोग, एक्टोपिक गर्भावस्था, और/या प्रजनन । रोग सीली सीधे सी ट्रेकोमेटिस संक्रमण2द्वारा शुरू की गई इम्यूनोपैथोलॉजी से संबंधित है। एक प्रभावोत्पादक टीका अभी विकसित किया जाना है; इसलिए, बैक्टीरियल उग्रता कारकों और अन्य जीवाणु जीन उत्पादों के कार्य को समझना एक महत्वपूर्ण और अत्यावश्यक अनुसंधान प्रश्न है।
इंट्रासेलर बैक्टीरिया के रूप में, मेजबान सेल आक्रमण, इंट्रासेलर प्रतिकृति, संतान की रिहाई, और मेजबान इम्यूनोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं की चोरी महत्वपूर्ण प्रक्रियाएं हैं। सी ट्रेकोमेटिस इंट्रासेलर विकास के लिए एक परजीवी झिल्ली बाध्य vacuole बनाता है, एक समावेश कहा जाता है। समावेशन की स्थापना और कई अन्य महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं को एक प्रकार III स्राव प्रणाली (T3SS)3के माध्यम से प्रभावक प्रोटीन के स्राव द्वारा प्राप्त किया जाता है। सी ट्रेकोमेटिसकी आनुवंशिक असभ्यता के कारण इन स्रावित प्रभावकों के कार्यों को स्पष्ट करना कई वर्षों तक सीमित था। ई कोलाई केविपरीत, कई शास्त्रीय क्लोनिंग तकनीक क्लैमाइडियापर लागू नहीं होती हैं। कुछ प्रमुख सीमाओं में परिवर्तन दक्षता, सैब जैसे काउंटरइलेक्शन रिपोर्टर्स की कमी और प्लाज्मिड रखरखाव शामिल हैं। जबकि ई. कोलाई प्लाज्मिड को आम तौर पर प्रतिकृति और उचित चयनात्मक दबाव की उत्पत्ति के साथ अनिश्चित काल तक बनाए रखा जा सकता है, सी ट्रेकोमेटिस प्लाज्मिड ्स को रखरखाव के लिए अतिरिक्त आठ ओपन रीडिंग फ्रेम(पीजीपी1-8) की आवश्यकता होती है जो एल2 सेरोवर4के भीतर देशी पीएल2 प्लाज्मिड पर पाए जाते हैं।
हाल के वर्षों में कई आनुवंशिक उपकरण उत्पन्न हुए हैं जो क्लैमाइडिया के अद्वितीय जीव विज्ञान को समायोजित करते हैं, फिर भी अभी भी5,6,7सीमाएं हैं। एथिल मीथेनसल्फोनेट (ईएमएस) उपचार द्वारा रासायनिक म्यूटाजेनेसिस गलत उत्परिवर्तन शुरू कर सकता है, या (कम बार) न्यूक्लियोटाइड संक्रमण में परिणाम कर सकता है जो एक बकवास उत्परिवर्तन8को उपज देने के लिए समय से पहले स्टॉप कोडन शुरू कर सकता है। ट्रांसपोसन प्रविष्टि जीन व्यवधान के लिए कुशल है, लेकिन क्लैमाइडिया अनुसंधान में वर्तमान प्रौद्योगिकी श्रमसाध्य और समय लेने वाली9है। ईएमएस उपचार और ट्रांसपोसन म्यूटाजेनेसिस तकनीक दोनों यादृच्छिक उत्परिवर्तन उत्पन्न करते हैं और उत्परिवर्ती उपभेदों को अलग करने के लिए कठोर स्क्रीनिंग विधियों की आवश्यकता होती है। समूह द्वितीय इंट्रॉन (जैसे, टार्जेट्रॉन) के सम्मिलन द्वारा जीन को बाधित करने की एक विधि निर्देशित म्यूटाजेनेसिस की अनुमति देती है; हालांकि, इस विधि दक्षता से सीमित है, और प्रविष्टि साइट हमेशा ठीक से10भविष्यवाणी नहीं है .
फ्लोरेसेंस-रिपोर्ट एलीलिक एक्सचेंज म्यूटाजेनेसिस (FRAEM) एक रणनीति है जो एंटीबायोटिक प्रतिरोध और फ्लोरेसेंस रिपोर्टर11प्रदान करने वाले चयन कैसेट के सम्मिलन के साथ-साथ लक्षित जीन विलोपन के लिए उपयोग की जाती है। फिर भी, FRAEM डाउनस्ट्रीम जीन पर कैसेट-प्रेरित ध्रुवीय प्रभावों की क्षमता से जटिल है, खासकर पॉलीसिस्ट्रोनिक ऑपरॉन के भीतर जीन को लक्षित करते समय। फ्लक्सेड कैसेट एलीजेनेसिस (फ्लेम) एक उपन्यास आनुवंशिक दृष्टिकोण है जो पहले फ्राईएम चयन कैसेट12के साथ मनाए गए कैसेट-प्रेरित ध्रुवीय प्रभावों को कम करने के लिए विकसित किया गया है। FLAEM चयन कैसेट को हटाने और डाउनस्ट्रीम जीन की अभिव्यक्ति को बहाल करने के लिए क्रे-लोक्सपी जीनोम संपादन का उपयोग करता है। एंटीबायोटिक प्रतिरोध और हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) युक्त चयन कैसेट को पार्श्व लोक्सपी साइटों के साथ फिर से इंजीनियर किया जाता है। ये लोक्सप साइटें क्रे रिकॉम्बिनेज की उपस्थिति में फिर से गठबंधन कर सकती हैं और इसके परिणामस्वरूप जीनोम13से कैसेट का उत्सर्जन होसकता है। 12,14को हटाने के लिए TmeA को लक्षितकरते समय कैसेट प्रेरित ध्रुवीय प्रभावों को कम करने के लिए यह रणनीति दिखाई गई है ।
एफआरईएम और फ्लेम दोनों विधियां एक ही आत्महत्या वेक्टर, pSUmC 4.0 का उपयोग करती हैं, जिसे पीजीपी6 की प्रेरक अभिव्यक्ति के माध्यम से सशर्त रूप से बनाए रखा जा सकता है। पीजीपी6 की अभिव्यक्ति को पहले प्लाज्मिड रिटेंशन के लिए आवश्यक दिखाया गया है और इसलिए प्लाज्मिड रखरखाव11,15को नियंत्रित करने के लिए लीवरेज किया जाता है । जब सी ट्रेकोमेटिस को मीडिया में उगाया जाता है, तो पीजीपी6 अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए हाइड्रोस टेट्रासाइक्लिन (एटीसी) के साथ पूरक हो जाता है, वेक्टर बनाए रखा जाता है। एटीसी के अभाव में वेक्टर खो जाता है। चयन कैसेट के लिए जीन के एलीलिक एक्सचेंज के माध्यम से लक्षित जीन विलोपन प्राप्त किया जाता है। लक्षित जीन के सीधे ऊपर और डाउनस्ट्रीम 3 केबी क्षेत्र पुनर्संयोजन के लिए होमोलॉजी हथियार के रूप में काम करते हैं । इन हथियारों को pSUmC 4.0 वेक्टर में झुकाया जाता है जो चयन कैसेट को फ्लैंक करते हैं। सफल सी ट्रेकोमेटिस परिवर्तन और पुनर्संयोजन घटनाओं फ्लोरेसेंस रिपोर्टिंग के माध्यम से मनाया जाता है। चयन कैसेट के भीतर वेक्टर रीढ़ और जीएफपी पर एमचेरी की अभिव्यक्ति लाल और हरे फ्लोरोसेंट समावेशन उपज। एक बार एटीसी संस्कृति मीडिया से हटा दिया जाता है, हरे रंग के समावेशन आत्महत्या वेक्टर के नुकसान और जीवाणु जीनोम में चयन कैसेट के एकीकरण के साथ सफल पुनर्संयोजन घटनाओं का संकेत मिलता है ।
FLAEM एक क्रे recombinase-व्यक्त वेक्टर, pSU-Cre, नव निर्मित उत्परिवर्ती तनाव में बाद के परिवर्तन के माध्यम से FRAEM के एक विस्तार का प्रतिनिधित्व करता है । क्रे पुनर्संयोजन loxP साइटों और चयन कैसेट के एक्सिजन के बीच पुनर्संयोजन की सुविधा प्रदान करता है। फ्लोरेसेंस रिपोर्टिंग के माध्यम से पुनर्संयोजन घटनाओं को इंगित किया जाता है। PSU-Cre वेक्टर एमचेरीएनकोड; इस प्रकार, सफल परिवर्तन जीएफपी-व्यक्तसमावेशन के लिए लाल फ्लोरेसेंस के अलावा संकेत दिया जाता है। कैसेट के लिए चयनात्मक दबाव के अभाव में खेती के परिणामस्वरूप क्रे-मध्यस्थता वाले पुनर्संयोजन में लोक्सपी साइटों पर, और कैसेट की हानि लाल-केवल समावेशन द्वारा इंगित की जाती है। PSUmC-4.0 के साथ के रूप में, पीजीपी 6 की प्रेरक अभिव्यक्ति सशर्त पीएसयू-क्रे बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है। एक बार एटीसी और एंटीबायोटिक चयन को हटा दिया जाता है, प्लाज्मिड ठीक हो जाता है, और जिसके परिणामस्वरूप मार्करलेस विलोपन तनाव नॉनफ्लोरोसेंट होता है। यह विधि कैसेट-प्रेरित ध्रुवीय प्रभावों के मुद्दे को संबोधित करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां बताए गए प्रोटोकॉल में सी ट्रेकोमेटिस में मार्करलेस जीन विलोपन की पीढ़ी के लिए कहा गया है, जो अनावश्यक जीन ों को लक्षित हटाने की अनुमति देता है और कैसेट-प्रेरित ध्रुवीय प्रभावों को समाप्त करता ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, एनआईएड (अनुदान A1065530 और Al124649) से सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, केए फील्ड्स के लिए ।
Materials
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam–/dcm– Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
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