Summary
Viene presentato un metodo per l'analisi non mirata di metaboliti e lipidi di grano. Il protocollo include un metodo di estrazione dei metaboliti dell'acetonitricolo e la metodologia di cromatometria liquida-massa di fase invertita, con l'acquisizione in modalità di ionizzazione elettrospray positive e negative.
Abstract
Comprendere le interazioni tra geni, ambiente e gestione nella pratica agricola potrebbe consentire una previsione e una gestione più accurate della resa e della qualità dei prodotti. I dati della metabolomica forniscono una lettura di queste interazioni in un dato momento ed è informativo sullo stato biochimico di un organismo. Inoltre, singoli metaboliti o pannelli di metaboliti possono essere utilizzati come biomarcatori precisi per la resa e la previsione e la gestione della qualità. Si prevede che il metaboloma vegetale contenga migliaia di piccole molecole con proprietà fisicochimiche diverse che forniscono un'opportunità per una visione biochimica dei tratti fisiologici e della scoperta di biomarcatori. Per sfruttare questo, un obiettivo chiave per i ricercatori di metabolomica è quello di catturare la maggior parte della diversità fisica possibile all'interno di una singola analisi. Qui presentiamo un metodo di metabolomica non mirata basato sulla cromatomia-massa liquida per l'analisi del grano coltivato sul campo. Il metodo utilizza il responsabile del solvente del cromatografo liquido per introdurre una terza fase mobile e combina un tradizionale gradiente a fase invertita con un gradiente lipidico-amabile. La preparazione del grano, l'estrazione dei metaboliti, l'analisi strumentale e i flussi di lavoro di elaborazione dei dati sono descritti in dettaglio. Sono state osservate una buona precisione di massa e riproducibilità del segnale, e il metodo ha prodotto circa 500 caratteristiche biologicamente rilevanti per ogni modalità di ionizzazione. Inoltre, sono stati determinati segnali di metaboliti e di caratteristiche lipidiche significativamente diversi tra le varietà di frumento.
Introduction
Comprendere le interazioni tra geni, ambiente e pratiche di gestione in agricoltura potrebbe consentire una previsione e una gestione più accurate della resa e della qualità dei prodotti. I metaboliti delle piante sono influenzati da fattori quali il genoma, l'ambiente (clima, precipitazioni, ecc.), e in un ambiente agricolo, il modo in cui vengono gestite le colture (cioè l'applicazione di fertilizzanti, fungicidi ecc.). A differenza del genoma, il metaboloma è influenzato da tutti questi fattori e quindi i dati metabolomici forniscono un'impronta biochimica di queste interazioni in un determinato momento. Di solito ci sono uno dei due obiettivi per uno studio basato sulla metabolomica: in primo luogo, per ottenere una comprensione più profonda della biochimica dell'organismo e aiutare a spiegare il meccanismo di risposta alla perturbazione (stress abiotico o biotico) in relazione alla fisiologia; e in secondo luogo, associare i biomarcatori alla perturbazione in esame. In entrambi i casi, il risultato di avere queste conoscenze è una strategia di gestione più precisa per raggiungere l'obiettivo di migliorare le dimensioni e la qualità della resa.
Si prevede che il metaboloma vegetale contenga migliaia1 di piccole molecole con varie proprietà fisiochimiche. Attualmente, nessuna piattaforma metabolomica (prevalentemente spettrometria di massa e spettroscopia a risonanza magnetica nucleare) può catturare l'intero metaboloma in un'unica analisi. Lo sviluppo di tali tecniche (preparazione del campione, estrazione e analisi dei metaboliti), che forniscono il più grande copertura possibile del metaboloma all'interno di una singola corsa analitica, è un obiettivo chiave per i ricercatori di metabolomica. Precedenti analisi metabolomiche non mirate del grano di grano hanno combinato i dati provenienti da più separazioni cromatografiche e polarità di acquisizione e/o strumentazione per una maggiore copertura del metaboloma. Tuttavia, ciò ha richiesto la preparazione e l'acquisizione separata dei campioni per ogni modalità. Ad esempio, Beleggia et al.2 ha preparato un campione derivatato per l'analisi GC-MS degli analiti polari oltre all'analisi GC-MS degli analiti non polari. 3 ha utilizzato metodi GC e LC-MS per migliorare la copertura nelle loro analisi; tuttavia, questo approccio richiederebbe in genere preparazioni di campioni separati, come descritto in precedenza, nonché due piattaforme analitiche indipendenti. Precedenti analisi del grano di grano con GC-MS2,3,4 e LC-MS3,,5 piattaforme hanno prodotto 50 a 412 (55 identificati) caratteristiche per GC-MS, 409 per GC-MS combinato e LC-MS e diverse migliaia per un'analisi lipidomica LC-MS5. Combinando almeno due modalità in un'unica analisi, è possibile mantenere una copertura estesa del metaboloma, aumentando la ricchezza dell'interpretazione biologica e offrendo anche risparmi in termini di tempo e costi.
Per consentire l'efficiente separazione di un'ampia gamma di specie lipidiche mediante cromatografia in fase invertita, le moderne metodologie lipidomiche utilizzano comunemente un'alta percentuale di isopropanolo nel solvente elution6, fornendo l'asbilità alle classi lipidiche che altrimenti potrebbero essere irrisolte dalla cromatografia. Per un'efficiente separazione dei lipidi, la fase mobile iniziale è anche molto più alta nella composizione organica7 rispetto ai tipici metodi cromatografici a fase invertita, che considerano altre classi di molecole. L'alta composizione organica all'inizio del gradiente rende questi metodi meno adatti a molte altre classi di molecole. In particolare, la cromatografia liquida di fase invertita utilizza un gradiente di solvente binario, a partire da una composizione per lo più acquosa e aumentando nel contenuto organico con l'aumentare della forza di eluizione della cromatografia. A tal fine, abbiamo cercato di combinare i due approcci per ottenere la separazione delle classi lipidiche e non lipidiche dei metaboliti all'interno di una singola analisi.
Qui, presentiamo un metodo cromatografico che utilizza una terza fase mobile e consente una fase invertita tradizionale combinata e un metodo di cromatografia appropriata alla lipomica utilizzando una preparazione di un singolo campione e una colonna analitica. Abbiamo adottato molte delle misure di controllo della qualità e dei passaggi di filtraggio dei dati che sono stati precedentemente implementati in studi prevalentemente clinici sulla metabolomica. Questi approcci sono utili per determinare caratteristiche robuste con elevata riproducibilità tecnica e rilevanza biologica ed esclude quelle che non soddisfano questi criteri. Ad esempio, vengono descritte l'analisi ripetuta dell'esempio QC in pool8, la correzione QC9, il filtraggio dei dati9,10 e l'imputazione delle funzionalità mancanti11.
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Protocol
Questo metodo è appropriato per 30 campioni (circa 150 semi per campione). Qui sono state utilizzate tre repliche biologiche di dieci diverse varietà di grano coltivate sul campo.
1. Preparazione dei grani
- Recuperare i campioni (grani interi) da -80 .
NOTA: L'essiccazione del congelamento dei semi è raccomandata poco dopo il raccolto se i campioni vengono raccolti da più stagioni. Questo riduce al minimo eventuali cambiamenti nella concentrazione di metaboliti che possono verificarsi dopo diversi periodi di stoccaggio. Per fare questo, trasferire i semi in un tubo di centrifuga di plastica da 15 mL (circa 300 semi riempiranno il tubo) e coprire con un foglio di alluminio. Forare la lamina due-tre volte con un perno e congelare asciugare i grani interi durante la notte (circa 24 h). I campioni possono essere restituiti al congelatore -80 gradi centigradi in questa fase o la fase successiva può essere effettuata. - Macinare i semi utilizzando un frullatore di laboratorio per due piste ad alta modalità per 20 s.
NOTA: Il frullatore utilizzato per questo protocollo richiede un minimo di circa 150 semi per riempire il frullatore fino all'altezza della lama e dare un campione di grano macinato relativamente omogeneamente. - Rimuovere il frullatore dalla base e toccare il lato del frullatore per portare qualsiasi granulosità grossolanamente macinata sulla superficie del campione. Il materiale grosso può essere scartato o immagazzinato.
- Trasferire materiale finemente macinato in polvere dal frullatore a un tubo di microcentrifuga di plastica da 2 ml.
NOTA: Lavare il frullatore con acqua deionizzata e risciacquare con MeOH LC-MS-grade tra i campioni. Assicurarsi che il frullatore sia completamente asciutto prima di procedere al campione successivo. - Riportare i campioni di grano finemente macinato al congelatore o procedere alla fase successiva (estrazione dei metaboliti).
2. Preparazione del solvente di estrazione
NOTA: Preparare il solvente di estrazione nello stesso giorno in cui si eseguono le estrazioni.
- Preparare almeno 2 mL di 1 mg/mL di ogni standard. Utilizzare acetonitrile (ACN) per preparare 2-aminoanthracene, miconazolo e d6-acido transinnamico. Utilizzare acqua per preparare 13C6-sorbitol.
- Prendere 2 mL di ogni 1 mg/mL standard e aggiungere a un pallone volumetrico da 100 mL.
- Riempire il pallone volumetrico alla linea con acetonitrile. Assicurarsi che 100 mL di acetonitrile contenga 20 g/mL di ciascuno degli standard interni: 2-aminoantroracene, miconazolo, 13C6-sorbitolo, d6-transcinninmic acid.
3. Estrazione metabolita
- Pesare 200 mg di grana finemente macinata in un tubo di microcentrifuga da 2 mL.
- Aggiungere 500 l di solvente di estrazione a 200 mg di campione di grano finemente macinato.
- Mescolare utilizzando un omogeneizzatore per 2 corse di 20 s a 6.500 rpm.
- Centrifuga a 4 gradi centigradi per 5 min a 16.100 x g.
- Trasferire il supernatante in un tubo di plastica da 2 ml.
- Ripetere questa procedura dai passaggi da 3.1 a 3.5 due volte di più per ottenere un volume supernatante totale di circa 1,5 mL.
- Vortex per mescolare il supernatante.
- Trasferire un volume uguale (55 ) di ogni estratto in un tubo separato da 2 mL per fare un campione di estratto di grano in pool.
- Trasferire una aliquota di 50 ll dell'estratto in una fiala di vetro.
NOTA: Gli estratti possono essere congelati (-80 gradi centigradi) a questo punto o procedere al passaggio successivo e seguire l'analisi LC-MS.
4. Preparazione di soluzioni per l'analisi LC-MS
AVVISO: Per l'acido concentrato, aggiungere sempre l'acido all'acqua/solvente.
- Preparare una soluzione di stock di formato di ammoniaca da 50 ml di 1 M. Pesare 3,153 g di formato di ammonio e trasferirlo in un flacone volumetrico da 50 ml. Riempire il pallone volumetrico alla linea con LC-MS grado H2O.
- Preparare 1 L della fase mobile A composta da formato di ammonio da 10 mm, 0,1% di acido formic. Per farlo, aggiungere circa 500 mL di acqua di grado LC-MS a un pallone volumetrico da 1 L L. Aggiungere 10 mL di 1 M di cartoncino di ammonio e 1 mL di acido formico. Riempire il pallone volumetrico alla linea con LC-MS grado H2O. Trasferire in una bottiglia da 1 L e sonicare per 15 min a degas.
- Preparare 1 L di fase mobile B composto da 10 mM di formato di ammonio in 79:20:1 acetonitrile:isopropyl alcohol:water, 0.1% formic acid ratio. Aggiungere 200 mL di isopropanolo a un flacone volumetrico da 1 L. Aggiungere 10 mL di 1 M di cartoncino di ammonio e 1 mL di acido formico. Riempire il pallone volumetrico alla linea con acetonitrile. Trasferire a una bottiglia da 1 L e sonicare per 15 min a degas.
NOTA: Diluire il formato di ammonio da 1 M nell'alcool isopropile (IPA) prima di aggiungere l'ACN. Il formato ammonium è insolubile in CAN. - Preparare 1 L di fase mobile C costituito da 10 mM di ammonio formate nel rapporto di 89:10:1 isopropyl alcol:acetonitrile:acqua. A tale scopo, aggiungere circa 500 mL di isopropanolo, 10 mL di 1 M di cartoncino di ammonio e 100 mL di acetonitrile a una fiaschetta volumetrica da 1 L. Riempire la linea con isopropanolo. Trasferire a una bottiglia da 1 L e sonicare per 15 min a degas.
- Preparazione dei solventi per il lavaggio del sistema LC-MS
- Sostituire la soluzione di lavaggio a pompa con una soluzione fresca. Utilizzare 50% di metanolo, 10% di alcool isopropile o altro come raccomandato dal produttore.
- Preparare soluzioni di lavaggio dell'ago forti e deboli per lavare la fluidicità di iniezione prima e seguire l'iniezione del campione. Per il lavaggio forte, aggiungere volumi uguali di ACN e IPA. Per il lavaggio debole, preparare una soluzione di 10% ACN (che richiede circa 500 mL e 1 L di ciascuno dei lavaggi forti e deboli rispettivamente per questo protocollo e numero di campioni) in bottiglie separate.
- Impostare i volumi di lavaggio dell'ago rispettivamente su 600 e 1800 l per i lavaggi forti e deboli.
5. Preparazione di campioni per l'analisi LC-MS
- Secondo la procedura operativa standard dei produttori per la preparazione di 400 ng/SL l'enkephalin, pipetta 7,5 mL di acqua nella fiala leucina-enkephalin a 12 mL contenente 3 mg di leucina-enkephalina. Congelare a -80 gradi centigradi in 50 - l'aliquota.
- Preparare 100 mL del 5% di ACN contenente 200 ng/mL di leucina-enkephalin (50 - L di 400 ng/L leuto enkephalin). Preparare lo stesso giorno dell'analisi LC-MS.
- Aggiungete al 550-L del 5% di acetonitrile contenente la leucina-enkephalin standard di iniezione al campione di 50-L preparato al punto 3.
- Vortice per mescolare il campione preparato.
6. Configurazione LC-MS
NOTA: una descrizione dettagliata dell'impostazione dello strumento e del metodo di acquisizione è descritta nella guida per l'utente del produttore. Di seguito sono riportati una guida generale e i dettagli specifici di questo protocollo. I seguenti passaggi possono essere completati in qualsiasi momento prima di acquisire i dati.
- Aprire un profilo hardware LC-MS.
- Impostare il metodo cromatografico come descritto nella Tabella 1. Assicurarsi che il sistema LC sia dotato di un solvente quaternario per impostare questo gradiente.
NOTA: L'IPA è un solvente viscoso. Dovrebbe essere introdotto a bassa portata e un tempo di equilibratore sufficiente dovrebbe essere utilizzato prima di aumentare la composizione al 98,0%. Questi passaggi impediranno al sistema LC di sovrappressionere e arrestarsi. - Impostare i metodi di acquisizione dello spettrometro di massa per ciascuna delle modalità ToF-MS positive e negative sull'intervallo m/z 50-1.300.
NOTA: lo strumento utilizzato per il lavoro qui presentato richiede metodi positivi e negativi da calibrare ed eseguire singolarmente (cioè la commutazione polarità all'interno di un metodo non è possibile). - Se la colonna LC è nuova, condizionare la colonna in base alle raccomandazioni del produttore.
NOTA: i passaggi seguenti devono essere completati direttamente prima dell'acquisizione dei dati. - In un profilo hardware "solo MS", calibrare lo spettrometro di massa in base alle raccomandazioni del produttore. Completare questo passaggio prima di ogni modalità di acquisizione, assicurandosi che il sistema si sia stabilizzato in ciascuna modalità prima della calibrazione.
- Svuotare e lavare il sistema fluidico LC utilizzando solventi di grado LC-MS, compresi i solventi di fase mobile e lavaggio.
- Il sistema LC utilizzando le condizioni di partenza del metodo LC, assicurando che la pressione della colonna si sia stabilizzata.
- Iniettare il formate di sodio (0,5 mM nel 90% IPA) all'inizio della sequenza di campionamento (descritta di seguito) per controllare la calibrazione dello strumento.
- Impostare la tabella di sequenza dello strumento in modo che gli spazi vuoti di solventi e preparativi (estrazione) vengano analizzati per primi; seguito da campioni QC raggruppati (6-10) per il condizionamento del sistema; quindi l'elenco dei campioni randomizzati con campioni di Controllo qualità viene eseguito a intervalli regolari (ad esempio, ogni quinta iniezione) come repliche tecniche. Eseguire due campioni QC alla fine della sequenza.
NOTA: è utile includere la data e l'ordine di iniezione/acquisizione nel nome del file di esempio, nonché l'ID del campione. Ad esempio: AAAA MMDD_Injection number_Variety_Biological replica. Prima di premere per l'avvio, assicurarsi che la pressione della colonna LC sia stabile e che l'LC sia collegato allo SM.
7. Trattamento dei dati
NOTA: un flusso di lavoro di elaborazione dati generale è presentato nella Figura 1.
- Controllare la qualità dei dati (precisione di massa standard interna (calcolo di seguito) e riproducibilità del segnale) mentre la sequenza è in esecuzione. Per verificare la riproducibilità del segnale, dovrebbe essere sufficiente l'ispezione visiva degli spettri sovrapposti.
NOTA: Errore di massa (ppm) ( ((massa teorica – massa misurata) / massa teorica) x 106 - Generare una matrice di intensità di picco allineata contenente campioni x standard interni (allineati in base al tempo di conservazione e ai valori m/z).
- Aprire il software di elaborazione dati (vedere Tabella dei materiali). In Home > Aprifare clic su Dati. Passare alla posizione del file appropriata e aprire tutti i file di dati.
- In Home > Sequenza > Tipodi elaborazione selezionare Quantitazione dal menu a discesa.
- In Home > Metodo > Quanfare clic su Componenti di calibrazione. Compilare ogni campo utilizzando i dettagli forniti nella tabella 2. Fare clic su OK.
- Nel riquadro sinistro nelle colonne accanto ai file di dati, compilare il tipo di esempio facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla cella e selezionando Sconosciuto. Compilare il livello come n/a.
- In Home > Elaborazioneselezionare Sequenza. Scegliere un percorso in cui salvare la sequenza, quindi fare clic su Elabora.
- In Home > Risultatiselezionare Quan. Dal visualizzatore Quan, selezionare Esporta esecuzioni in analizzatore matrice.
- Dal visualizzatore risultati analizzatore di matrici, fare clic su Esporta in csv. Salvare il file come file di foglio di calcolo.
- Nel software per fogli di calcolo, calcolare la media, la deviazione standard e la deviazione standard relativa dell'intensità (area di picco) di ogni standard interno.
- Generare una matrice di intensità di picco allineata contenente campioni x caratteristiche non mirate (allineate in base al tempo di conservazione e ai valori m/z).
- Aprire il software di analisi di individuazione delle piccole molecole (vedere Tabella dei materiali)e selezionare File > Nuovo per creare un nuovo esperimento. Assegna un nome all'esperimento e scegli il percorso in cui salvare e archiviare i file dell'esperimento. Fare clic su Avanti.
- Selezionare il tipo di strumento utilizzato (spettrometro di massa ad alta risoluzione), il formato dati (profilo) e la polarità (positiva o negativa). Fare clic su Avanti. Seleziona tutti gli addotti disponibili nella libreria e modifica la libreria degli adduttoin in base alle esigenze. Fare clic su Crea esperimento. Verrà caricata una nuova pagina in cui il resto dell'elaborazione dei dati continuerà/si verificherà.
- Importare i file di dati. Selezionare il formato di file e quindi selezionare importa. Individuare il percorso dei dati e selezionare i file di dati da importare. L'avanzamento verrà visualizzato per ogni file nel pannello sinistro della pagina.
- Una volta importati i file di dati, selezionare Avvia elaborazione automatica. Scegliere un metodo per selezionare un riferimento di tracciato. Lasciare che il software valuti tutte le esecuzioni per l'idoneità, fornire un elenco di campioni adatti (ad esempio, campioni di QC) o scegliere il riferimento più adatto, ad esempio un campione QC a metà sequenza. Selezionare Sì, allinea automaticamente le mie esecuzioni > Avanti.
- Selezionare Avanti nella pagina di progettazione dell'esperimento (può essere impostata in un secondo momento).
- Selezionare Esegui selezione picco ( Set the Parameters) e quindi Imposta parametri. Nella scheda Limiti di selezione picco, selezionare Intensità ione assoluta e immettere 100. Selezionare Applica una larghezza di picco minima e immettere 0,01 min. Selezionare OK > Fine. Al termine dell'elaborazione, selezionare Chiudi.
NOTA: i limiti di selezione dei picchi possono essere ottimizzati per altri tipi di file di dati in base alle esigenze. - Nella parte inferiore destra dello schermo, selezionare Sezione completata. Esaminare le esecuzioni allineate e assicurarsi che ogni campione sia allineato al riferimento. I punteggi di allineamento sono stati >90% per i dati qui presentati. Selezionare Sezione completata.
- Nella pagina successiva, scegliere tra la progettazione dell'oggetto. Assegnare un nome al disegno. Selezionare Raggruppa le condutture manualmente e Crea progetto. Aggiungere la condizione, fare clic sulla Condizione 1 e assegnare un nome appropriato al gruppo. Fare clic su Sezione completata.
NOTA: Continuare ad aggiungere condizioni appropriate per utilizzare le statistiche all'interno del software. Dal momento che abbiamo usato il software solo per generare una matrice non mirata, abbiamo usato una singola condizione etichettata 'all'. - Nella pagina successiva selezionare Sezione completata. Non ri-fare picco raccolta.
- Esaminare la deconvoluzione e quindi fare clic su Sezione completata.
- Passare a File > Esporta misure composte. Deselezionare le proprietà non desiderate nell'output. Fare clic su OK. Scegliere un percorso in cui salvare il file CSV. Fare clic su Salva > Apri file > Apri cartella o Chiudi.
- Filtrare i dati utilizzando gli spazi vuoti di estrazione per rimuovere gli artefatti (software per fogli di calcolo).
- Per ogni funzione RT x m/z, in una nuova colonna, calcolare la risposta media negli spazi vuoti di estrazione.
- Per ogni funzione RT x m/z, calcolare la risposta media in tutti gli altri campioni (inclusi i campioni QC).
- Calcolare l'intensità di picco % degli spazi vuoti nei campioni (risposta media in bianco/media risposta nei campioni x 100).
- Ordinare la colonna di contributo percentuale dai valori più bassi a quelli più alti.
- Rimuovere le funzioni che hanno >5% di contributo intensità dagli spazi vuoti.
- Filtrare i valori mancanti e correggere i segnali di funzionalità ai segnali nei campioni QC in pool.
- Aprire il softwaredielaborazione dati ( Tabella dei materiali ). Fare clic sul pulsante Visualizza MatrixAnalyzer. Fare clic sul pulsante Apri file di dati.
- Passare alla posizione del file CSV contenente l'intensità di picco delle funzionalità RT x m/z per ogni campione (matrice non mirata). Selezionare Apri.
- Nella scheda Esempi di controllo qualità compilare ogni parametro in base alle esigenze. Per il set di dati descritto di seguito, utilizzare la categoria QC, la selezione di categorie, l'opzione categorie, le categorie, le categorie, le categorie, imputati, la soglia di copertura, 80, la scala che utilizza, non il ridimensionamento, deselezionare la trasformazione del log, correggere la spline con l'arrotondamento, l'arrotondamento di 0,25.
- In alto a destra nel pannello matrice, fate clic sul pulsante di riproduzione Correzione QC.
- Dopo che la correzione è stata eseguita in alto a destra nel pannello Matrice, fare clic su Salva risultati. Passare a un percorso appropriato e salvare il file dei risultati CSV.
- Filtrare i dati per rimuovere le funzionalità che hanno >20% RSD in Esempi di QC.
- Disporre i dati in modo che i campioni siano in righe e le caratteristiche siano in colonne.
- In una nuova colonna, calcolare l'intensità media di picco per i campioni di controllo di sistema.
- In una nuova colonna, calcolare la deviazione standard dell'intensità di picco per i campioni QC.
- Calcolare la deviazione standard relativa dell'intensità di picco per i campioni QC: (media QC deviazione standard/QC) x 100.
- Ordinare le funzionalità dal più basso al più alto %RSD e rimuovere le funzionalità che hanno un QC RSD > 20%.
- Filtrare i dati per rimuovere le funzionalità con rapportiQC /RSDdi campioneRSD bassi (ad esempio, <1).
- In una nuova colonna, calcolare l'intensità media di picco per i campioni.
- In una nuova colonna, calcolare la deviazione standard dell'intensità di picco per i campioni.
- Calcolare la deviazione standard relativa dell'intensità di picco dei campioni: (media campione deviazione standard/campione) x 100.
- In una nuova colonna, dividere i campioni RSD per il QC RSD.
- Ordinare i valori (RSDsample/RSDQC ratios) dal più alto al più basso e rimuovere le funzionalità con un rapporto <1.
- Impute valori mancanti (diversi metodi disponibili online).
- Formattare il foglio di calcolo in modo che gli esempi siano in righe e le caratteristiche siano in colonne. La prima colonna deve essere il nome del file samples. Creare una colonna aggiuntiva accanto ai nomi dei file e immettere i raggruppamenti di esempio. In questo caso, i campioni sono stati raggruppati per varietà.
- Salvare il foglio di calcolo come file CSV.
- Passare alla home page della pipeline analitica basata sul Web per la metabolomica ad alta velocità (vedere Tabella dei materiali) e fare clic su Fare clic qui per iniziare.
- Fare clic su Analisi statistiche. In Carica datiselezionare Tipo di dati: tabella di intensità di picco, Formato: esempi in righe (non accoppiate) e quindi Scegli file.
- Passare al file CSV, selezionare Apri e quindi Invia.
- Nella pagina successiva selezionare Stima valore mancante. Deselezionare il passaggio 1 (operazione eseguita in AnalyzerPro XD). Nel passaggio 2 scegliere un metodo per stimare i valori mancanti.
NOTA: Per i dati qui presentati - è stata selezionata la selezione 'stima valori mancanti' con 'KNN'. - In questa fase, la matrice di dati può essere scaricata (selezionare Scarica dal pannello sinistro della pagina web) o procedere all'esecuzione di ulteriori analisi statistiche.
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Representative Results
Il metaboloma vegetale è influenzato da una combinazione del suo genoma e ambiente, e inoltre in un ambiente agricolo, il regime di gestione delle colture. Dimostriamo che le differenze genetiche tra le varietà di frumento possono essere osservate a livello di metaboliti, qui, con oltre 500 composti misurati che mostrano concentrazioni significativamente diverse tra le varietà solo nel grano. Una buona precisione di massa (<10 ppm error) e la riproducibilità del segnale (<20% RSD) degli standard interni(Figura 2) sono state osservate per entrambe le modalità di ionizzazione negativa e positiva(tabella 3). La preparazione del campione descritta e l'analisi basata sulla spettrometria liquida-massa ha prodotto >900 caratteristiche deconvoluted in modalità ionizzazione negativa e caratteristiche deconvoluted in modalità ionizzazione positiva. Sono stati inclusi spazi vuoti preparatori (Figura 3) per determinare se i metodi di preparazione e analisi dei campioni hanno introdotto le caratteristiche dei manufatti, e quindi tutte le influenze non biologiche eliminate dalla matrice di dati. Si è scoperto che 421 segnali in modalità negativa e 835 segnali in modalità positiva avevano intensità del segnale uguali o superiori al 5% dell'intensità media del segnale nei campioni di grano. Queste funzionalità sono state rimosse e dopo ulteriori passaggi di filtraggio dei dati (passaggio 7 e Figura 1), la modalità negativa ha restituito 483 caratteristiche e la modalità positiva ha restituito 523 caratteristiche, formando lo snapshot metabolico. Il metodo è riuscito a rilevare le caratteristiche, che avevano intensità significativamente diverse tra le varietà di frumento (Figura 4) con caratteristiche significative >500 in entrambe le modalità di ionizzazione. In modalità ionizzazione negativa, la maggior parte delle caratteristiche significative erano nel gradiente di fase invertito e in modalità ionizzazione positiva, la maggior parte delle caratteristiche significative erano nel gradiente lipidico (Figura 4).
Figura 1: il flusso di lavoro utilizzato in questa analisi per il controllo, l'elaborazione e il filtro dei dati. La fase 1 viene condotta utilizzando il software di acquisizione/visualizzazione dei dati sullo strumento in modo da poter effettuare valutazioni "al volo". Ciò include il calcolo dell'errore di massa (ppm) degli standard interni e la sovrapposizione dei picchi standard interni per la valutazione visiva della riproducibilità dei dati. I passaggi 2-7 descrivono la procedura di elaborazione dei dati descritta nel protocollo, passaggio 7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: cromatogrammi ionici estratti. Cromatogrammi ionici estratti di 13C6-sorbitolo (blu scuro), leucina-enkephalin (rosa), d6-acido trans-cinnamico (arancione), 2-aminointhracene (verde) e miconazole (azzurro) standard interni in modalità di elettrosprayizzazione positiva (superiore) e negativa (in basso) elettrospraylizzazione (ESI). Vengono visualizzati i tempi e le intensità di ritenzione standard interni. ESI e ESI - Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: sovrapposizione totale di cromatogrammi ioionici (TIC) di spazi vuoti preparativi che mostrano acquisizioni in modalità negativa (rosa) e modalità positiva (blu). Viene mostrato uno standard interno, miconazolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: sovrapposizione totale di cromatogramma ioscio (TIC), che mostra le acquisizioni in modalità negativa (rosa) e positiva (blu) e il numero di feature significativamente diverse tra la varietà di grano nel gradiente cromatografico. In modalità negativa, il maggior numero di funzioni significative è stato trovato quando la composizione della fase B mobile era alta. In modalità positiva, il maggior numero di funzioni significative è stato trovato quando la composizione della fase C mobile era alta. Viene mostrato uno standard interno, miconazolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Segmento | Tempo | Portata | %A | %B | %C | Curva |
| (min) | (mL/min) | |||||
| 1 | Iniziale | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 2 | 1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 3 | 7 | 0.8 | 2 | 98 | 0 | 6 |
| 4 | 7.1 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 5 | 10 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 6 | 18 | 0.4 | 0 | 10 | 90 | 6 |
| 7 | 21 | 0.4 | 0 | 2 | 98 | 6 |
| 8 | 21.1 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 9 | 24 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 10 | 24.1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 11 | 25 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
Tabella 1: Programma cromatico liquido delle composizioni di fase mobile.
| Parametro | Standard interno | ||||
| 13 del sistema C6-sorbitolo | Leucina-enkephalin | d6-acido transinnamico | 2-amino-antraracene | Miconazole | |
| Quan m/z | 211.09 (187.09) | 556.28 (554.26) | 155.097 (153.08) | 194.1 | 414.99 |
| Tolleranza di massa (amu) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 | 0.01 |
| Tempo di conservazione | 1.2 | 4.6 | 5.1 | 6.5 | 7 |
| Intervallo di tempo di conservazione | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 | 0.1 |
| Tipo di rilevamento | Massima | Massima | Massima | Massima | Massima |
| Tipo di risposta | Zona | Zona | Zona | Zona | Zona |
| Soglia area | 10 | 10 (50) | 10 (50) | 10 | 10 |
| Soglia larghezza | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| Soglia altezza | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Rapporto segnale-rumore | 5 | 5 | 3 (5) | 5 | 5 |
| Lisciatura | 5 | 5 (3) | 5 (3) | 5 | 5 |
Tabella 2: Parametri di rilevamento dei picchi per gli standard interni nelle modalità di acquisizione positive (e negative).
| Precisione di massa (ppm) | %RSD prima della correzione QC | %RSD dopo la correzione QC | ||
| Modalità negativa | 13 del sistema C6-sorbitolo | 4.59 | 6.12 | 7.08 |
| D6- acido transinnamico | 7.94 | 3.93 | 5.99 | |
| Leucina-enkephalin | 0.91 | 1.8 | 1.96 | |
| Modalità positiva | 13 del sistema C6-sorbitolo | 5.65 | 14.1 | 15.3 |
| Leucina-enkephalin | 3 | 3.24 | 5 | |
| D6- acido transinnamico | 8.03 | 5.41 | 9.81 | |
| 2-aminoanthracene | 3.99 | 7.97 | 5.45 | |
| Miconazole | 1.8 | 3.01 | 5.72 | |
Tabella 3: Campione (nn 30) precisione di massa standard interna (ppm) e riproducibilità del segnale prima e dopo la correzione del QC espressa come deviazione standard relativa (%).
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Discussion
Qui, presentiamo un metodo metabolomico non mirato basato su LC-MS per l'analisi del grano. Il metodo combina quattro modalità di acquisizione (fase invertita e fase invertita lipida-amabili con ionizzazione positiva e negativa) in due modalità introducendo una terza fase mobile nel gradiente di fase invertito. L'approccio combinato ha prodotto circa 500 caratteristiche biologicamente rilevanti per polarità iosata con circa la metà di queste significativamente diverse in intensità tra le varietà di frumento. Cambiamenti significativi nella concentrazione di metaboliti nel grano di diverse varietà di grano indicano una biochimica alterata, che può essere collegata alla resistenza alle malattie, alla tolleranza allo stress e ad altri tratti fenotipici che sono importanti per la qualità e la resa del grano. Ad esempio, gli approcci metabolomici sono stati utilizzati per descrivere nuovi meccanismi di difesa12 e proporre il ruolo dei metaboliti nella tolleranza alla siccità13. Le future applicazioni di questo protocollo potrebbero essere in grado di collegare ulteriormente i profili biochimici di particolari varietà ai tratti genetici che sono auspicabili per determinati ambienti e pratiche di gestione. A sua volta, ciò consentirebbe la produzione di qualità e resa ottimali del grano per genotipi selezionati.
L'inclusione di standard interni è fondamentale per questo protocollo per consentire all'utente di determinare i cambiamenti nel segnale, i cambiamenti del tempo di conservazione e come indicatori di precisione di massa. I cambiamenti nel segnale possono indicare, ad esempio, l'estrazione sub ottimale, l'iniezione (compresi i blocchi del sistema fluido) o le prestazioni del rivelatore. I cambi di tempo di conservazione possono indicare scarse prestazioni della pompa, equilibratura del gradiente di fase mobile inappropriato o che la fase stazionaria della colonna LC si è deteriorata. Una scarsa precisione di massa può essere indicativa di una calibrazione alla deriva e che il sistema richiede una ri-calibrazione. In tutti i casi di cui sopra, il sistema deve essere arrestato e l'appropriato manutenzione/sostituzione dei pezzi eseguiti. Abbiamo incluso quattro standard nella soluzione di estrazione utilizzata per preparare il grano e uno standard nel campione finale aggiunto prima dell'iniezione. È stata prestata attenzione a garantire che gli standard fossero suscettibili a ogni modalità di ionizzazione e coprissero una serie di tempi di conservazione; tuttavia, riconosciamo che questa gamma di norme potrebbe essere migliorata con l'inclusione di uno standard lipidico etichettato. È stato dimostrato che il grano contiene centinaia di triacylglycerols (TAg)5, ognuno dei quali sarebbe un'aggiunta adatta a questo protocollo. Anche l'inclusione di spazi vuoti preparativi e campioni QC in pool8 sono passaggi critici in questo protocollo. Migliaia di caratteristiche ioniche vengono rilevate in metodi di spettrometria di massa non mirati ed è importante escludere quelle che sono presenti solo in campioni vuoti e anche quelle che non sono riproducibilmente rilevate (cioè, alta %RSD) durante l'analisi.
Anche se il metodo attuale consente di risparmiare tempo e risorse considerevoli, se non è disponibile un solvente quaternario, è possibile utilizzare metodi standard di fase invertita e lipidici per ottenere gli stessi risultati. Il volume di estrazione utilizzato in questo protocollo sarebbe sufficiente per l'analisi di modalità di acquisizione aggiuntive. Questo protocollo descrive un'estrazione acetonitrile. Anche se avrà successo, un solvente di estrazione alternativo, o una combinazione di solventi, fornirà una diversa copertura dei metaboliti, che a sua volta può fornire più caratteristiche e/o fornire una migliore (o minore) efficienza di estrazione di alcuni composti. Non abbiamo tentato di stabilire l'identità metabolita delle misurazioni statisticamente significative risolte in questo protocollo; tuttavia, sono disponibili banche dati spettrali di massa per metaboliti e lipidi vegetali e lo sviluppodi 5,14,15. Per identificare i metaboliti, oltre ai dati di scansione completi dovrebbero essere raccolti spettri di massa in tandem (MS/MS). Questi possono essere raccolti durante l'esecuzione iniziale utilizzando campioni raggruppati e un metodo MS/MS appropriato o su estratto riservato (memorizzato a -80 gradi centigradi) una volta che sono stati determinati i metaboliti di interesse. Abbiamo osservato grandi cambiamenti di composti di piega tra le varietà, quindi consigliamo di fare entrambe le e in seconda istanza, utilizzando una varietà nota per contenere un'alta concentrazione del composto di interesse per ottenere la più alta qualità dello spettro MS/MS.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano riconoscere il programma West Australian Premier Agriculture and Food Fellowship (Department of Jobs, Tourism, Science and Innovation, Government of Western Australia) e il Premier's Fellow, il professor Simon Cook (Centro per Agricoltura digitale, Università Curtin e Università di Murdoch). Le sperimentazioni sul campo e la raccolta di campioni di grano sono stati supportati dal programma Royalties for Regions dell'Australia Occidentale. Riconosciamo Grantley Stainer e Robert French per i loro contributi alle prove sul campo. La Bioplatforms Australia, finanziata da NCRIS, è riconosciuta per il finanziamento delle attrezzature.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
