Summary
Eine Methode zur ungezielten Analyse von Weizenkornmetaboliten und Lipiden wird vorgestellt. Das Protokoll umfasst eine Acetonit-Metabolit-Extraktionsmethode und eine umgekehrte Phase-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Methodik mit Erfassung in positiven und negativen Elektrospray-Ionisationsmodi.
Abstract
Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Genen, der Umwelt und dem Management in der landwirtschaftlichen Praxis könnte eine genauere Vorhersage und Verwaltung von Produktertrag und -qualität ermöglichen. Metabolomics-Daten liefern ein Auslesen dieser Wechselwirkungen zu einem bestimmten Zeitpunkt und sind informativ über den biochemischen Status eines Organismus. Darüber hinaus können einzelne Metaboliten oder Metaboliten-Panels als präzise Biomarker für ertrags- und Qualitätsvorhersage und -management verwendet werden. Das pflanzliche Metabolom wird voraussichtlich Tausende von kleinen Molekülen mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften enthalten, die eine Chance für einen biochemischen Einblick in physiologische Eigenschaften und Biomarker-Entdeckung bieten. Um dies zu nutzen, besteht ein zentrales Ziel für Die Forscher der Metabolomik darin, so viel wie möglich von der physikalisch-chemischen Vielfalt in einer einzigen Analyse zu erfassen. Hier stellen wir eine flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie-basierte ungezielte Metabolomik-Methode zur Analyse von Feldweizenkorn vor. Das Verfahren nutzt den quaternären Lösungsmittelmanager des Flüssigchromatographen, um eine dritte mobile Phase einzuführen und kombiniert einen traditionellen umgedrehten Phasengradienten mit einem lipidfreundlichen Gradienten. Getreideaufbereitung, Metabolitenextraktion, instrumentelle Analyse und Datenverarbeitungs-Workflows werden ausführlich beschrieben. Es wurden eine gute Massengenauigkeit und Signalreproduzierbarkeit beobachtet, und die Methode ergab etwa 500 biologisch relevante Merkmale pro Ionisationsmodus. Darüber hinaus wurden signifikant unterschiedliche Metaboliten- und Lipid-Feature-Signale zwischen Weizensorten bestimmt.
Introduction
Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Genen, Umwelt und Managementpraktiken in der Landwirtschaft könnte eine genauere Vorhersage und Verwaltung von Produktertrag und -qualität ermöglichen. Pflanzenmetaboliten werden durch Faktoren wie Genom, Umwelt (Klima, Niederschlag usw.) und in einer landwirtschaftlichen Umgebung beeinflusst, wie Pflanzen bewirtschaftet werden (d. h. Die Anwendung von Düngemitteln, Fungizid usw.). Im Gegensatz zum Genom wird das Metabolom durch all diese Faktoren beeinflusst und daher liefern Metabolomik-Daten einen biochemischen Fingerabdruck dieser Wechselwirkungen zu einem bestimmten Zeitpunkt. Es gibt in der Regel eines von zwei Zielen für eine Metabolomik-basierte Studie: erstens, um ein tieferes Verständnis der Biochemie des Organismus zu erreichen und helfen, den Mechanismus der Reaktion auf Störungen (abiotischen oder biotischen Stress) in Bezug auf die Physiologie zu erklären; und zweitens, Biomarker mit der untersuchten Störung in Verbindung zu bringen. In beiden Fällen ist das Ergebnis dieses Wissens eine präzisere Managementstrategie, um das Ziel einer verbesserten Ertragsgröße und -qualität zu erreichen.
Das Pflanzenmetabolom wird voraussichtlich Tausende von1 kleinen Molekülen mit verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften enthalten. Derzeit können keine Metabolomik-Plattformen (vorwiegend Massenspektrometrie und Kernspinresonanzspektroskopie) das gesamte Metabolom in einer einzigen Analyse erfassen. Die Entwicklung solcher Techniken (Probenvorbereitung, Metabolitenextraktion und -analyse), die eine möglichst große Abdeckung des Metaboloms innerhalb eines einzigen analytischen Laufs bieten, ist ein zentrales Ziel für Forscher der Metabolomik. Frühere ungezielte Metabolomik-Analysen von Weizengetreide haben Daten aus mehreren chromatographischen Trennungen und Erfassungspolaritäten und/oder Instrumenten für eine größere Metabolomabdeckung kombiniert. Dies erforderte jedoch, dass Proben für jede Modalität einzeln vorbereitet und erworben wurden. So erstellten Beleggia et al.2. 2 zusätzlich zur GC-MS-Analyse der unpolaren Analyten eine derivatisierte Probe für die GC-MS-Analyse von Polaranalyten. Das et al.3 verwendete sowohl GC- als auch LC-MS-Methoden, um die Abdeckung in ihren Analysen zu verbessern; Dieser Ansatz würde jedoch in der Regel getrennte Probenvorbereitungen wie oben beschrieben sowie zwei unabhängige Analyseplattformen erfordern. Frühere Analysen von Weizengetreide mit GC-MS2,3,4 und LC-MS3,5 Plattformen haben 50 bis 412 (55 identifizierte) Funktionen für GC-MS, 409 für kombinierte GC-MS und LC-MS und mehrere tausend für eine LC-MS Lipidomik-Analyse5ergeben. Durch die Kombination von mindestens zwei Modi in einer einzigen Analyse kann eine erweiterte Metabolomabdeckung aufrechterhalten werden, wodurch der Reichtum der biologischen Interpretation erhöht wird und gleichzeitig Zeit- und Kosteneinsparungen erzielt werden.
Um eine effiziente Trennung einer Vielzahl von Lipidarten durch umgekehrte Phasenchromatographie zu ermöglichen, verwenden moderne Lipidomik-Methoden häufig einen hohen Anteil an Isopropanol im Elutionslösungsmittel6, um Lipidklassen, die sonst durch die Chromatographie ungelöst sein könnten, eine Aenbarkeit zu bieten. Für eine effiziente Lipidtrennung ist die startende mobile Phase auch in der organischen Zusammensetzung7 viel höher als die typischen chromatographischen Methoden der umgekehrten Phase, die andere Klassen von Molekülen berücksichtigen. Die hohe organische Zusammensetzung zu Beginn des Gradienten macht diese Methoden weniger geeignet für viele andere Klassen von Molekülen. Vor allem die umgekehrte Phasenflüssigkeitschromatographie verwendet einen binären Lösungsmittelgradienten, beginnend mit einer meist wässrigen Zusammensetzung und einer Erhöhung des organischen Gehalts, da die Elutionsfestigkeit der Chromatographie erhöht wird. Zu diesem Zweck haben wir versucht, die beiden Ansätze zu kombinieren, um die Trennung von Lipid- und Nicht-Lipid-Klassen von Metaboliten in einer einzigen Analyse zu erreichen.
Hier stellen wir eine chromatographische Methode vor, die eine dritte mobile Phase verwendet und eine kombinierte traditionelle umgekehrte Phase und lipidomics-geeignete Chromatographiemethode mit einer einzigen Probenvorbereitung und einer analytischen Spalte ermöglicht. Wir haben viele der Qualitätskontrollmaßnahmen und Datenfilterschritte übernommen, die bisher in überwiegend klinischen Metabolomik-Studien umgesetzt wurden. Diese Ansätze sind nützlich, um robuste Merkmale mit hoher technischer Reproduzierbarkeit und biologischer Relevanz zu bestimmen, und schließen diejenigen aus, die diese Kriterien nicht erfüllen. Zum Beispiel beschreiben wir die Wiederholungsanalyse der gepoolten QC-Probe8, QC-Korrektur9, Datenfilterung9,10 und Imputation fehlender Features11.
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Protocol
Diese Methode eignet sich für 30 Proben (ca. 150 Samen pro Probe). Hier wurden drei biologische Nachbildungen von zehn verschiedenen Weizensorten verwendet.
1. Herstellung von Körnern
- Abrufen von Proben (Ganze Körner) aus -80 °C Lagerung.
HINWEIS: Die Gefriertrocknung von Samen wird kurz nach der Ernte empfohlen, wenn Proben aus mehreren Jahreszeiten entnommen werden. Dadurch werden Änderungen der Metabolitenkonzentration minimiert, die nach unterschiedlichen Lagerzeiten auftreten können. Dazu samen auf ein 15 ml Kunststoffzentrifugenrohr (ca. 300 Samen füllen das Rohr) übertragen und mit Aluminiumfolie abdecken. Die Folie zwei-dreimal mit einem Stift durchstechen und die ganzen Körner über Nacht (ca. 24 h) trocknen. Proben können in dieser Phase entweder an den -80 °C-Gefrierschrank zurückgegeben werden oder der nächste Schritt kann durchgeführt werden. - Schleifen Sie die Samen mit einem Labormixer für zwei Durchläufe im High-Modus für 20 s.
HINWEIS: Der für dieses Protokoll verwendete Mixer benötigt mindestens 150 Samen, um den Mixer bis zur Klingenhöhe zu füllen und eine relativ homogen gemahlene Kornprobe zu geben. - Entfernen Sie den Mixer von der Basis und tippen Sie auf die Seite des Mixers, um grobe geschliffene Körner an die Oberfläche der Probe zu bringen. Grobes Material kann entsorgt oder gelagert werden.
- Pulverähnliches fein gemahlenes Material aus dem Mixer auf ein 2 ml Kunststoff-Mikrozentrifugenrohr übertragen.
HINWEIS: Waschen Sie den Mixer mit entionisiertem Wasser und spülen Sie ihn mit DEM LC-MS-Grade MeOH zwischen den Proben. Stellen Sie sicher, dass der Mixer vollständig trocken ist, bevor Sie mit der nächsten Probe fortfahren. - Geben Sie fein gemahlene Getreideproben in den Gefrierschrank zurück oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort (Metabolitenextraktion).
2. Herstellung von Extraktionslösungsmittel
HINWEIS: Bereiten Sie Extraktionslösungsmittel am selben Tag wie die Durchführung der Extraktionen vor.
- Bereiten Sie mindestens 2 ml von 1 mg/ml jeder Norm vor. Verwenden Sie Acetonitril (ACN), um 2-Aminoanthracen,6Miconazol und d 6-Transcinnamsäure vorzubereiten. Verwenden Sie Wasser, um 13C6-Sorbitol vorzubereiten.
- Nehmen Sie 2 ml von jedem 1 mg/ml Standard und fügen Sie zu einem 100 ml Volumetruhe.
- Füllen Sie den Volumetkolben bis zur Linie mit Acetonitril. Stellen Sie sicher, dass 100 ml Acetonitril 20 g/ml jeder internen Norm enthält: 2-Aminoanthracen, Miconazol, 13C6-Sorbitol, d66-Transcinnamsäure.
3. Metabolitenextraktion
- Wiegen Sie 200 mg fein gemahlenes Korn in ein 2 ml Mikrozentrifugenrohr.
- Fügen Sie 500 l Extraktionslösungsmittel zu 200 mg fein gemahlener Getreideprobe hinzu.
- Mischen Sie mit einem Homogenisator für 2 Auflagen von 20 s bei 6.500 Rpm.
- Zentrifuge bei 4 °C für 5 min bei 16.100 x g.
- Übertragen Sie den Überstand auf ein 2 ml Kunststoffrohr.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang von den Schritten 3.1 bis 3.5 zweimal, um ein Gesamtüberstandvolumen von ca. 1,5 ml zu erhalten.
- Wirbel, um den Überstand zu mischen.
- Übertragen Sie ein gleiches Volumen (55 l) jedes Extrakts in ein separates 2 ml-Rohr, um eine gepoolte Kornextraktprobe zu bilden.
- Übertragen Sie einen 50 L Aliquot des Extrakts in eine Glasdurchstechflasche.
HINWEIS: Extrakte können an dieser Stelle eingefroren werden (-80 °C) oder mit dem nächsten Schritt fortfahren und der LC-MS-Analyse folgen.
4. Vorbereitung von Lösungen für die LC-MS-Analyse
VORSICHT: Für konzentrierte Säure immer Säure zu Wasser/Lösungsmittel hinzufügen.
- Bereiten Sie 50 ml von 1 M Ammonium Formate Lagerlösung. Wiegen Sie 3,153 g Ammoniumformat und übertragen Sie ihn in einen 50 ml Volumetkolben. Füllen Sie volumetrischen Kolben mit LC-MS GradH2O.
- Bereiten Sie 1 L der mobilen Phase A bestehend aus 10 mM Ammoniumformat, 0,1% Ameisensäure vor. Dazu fügen Sie ca. 500 ml WASSER der LC-MS-Klasse zu einem 1 L-Volumenkolben hinzu. 10 ml 1 M Ammoniumformatbestand und 1 ml Ameisensäure hinzufügen. Volumetrischen Kolben mit LC-MS GradH2O. In eine 1 L-Flasche geben und 15 min zum Entgasen beschallen.
- Bereiten Sie 1 L der mobilen Phase B bestehend aus 10 mM Ammoniumformat in 79:20:1 Acetonitril: Isopropylalkohol: Wasser, 0,1% Ameisensäureverhältnis vor. Fügen Sie 200 ml Isopropanol zu einem 1 L Volumetkolben hinzu. 10 ml 1 M Ammoniumformatbestand und 1 ml Ameisensäure hinzufügen. Füllen Sie den Volumetkolben bis zur Linie mit Acetonitril. In eine 1 L-Flasche geben und 15 min beschallen, um zu entgasen.
HINWEIS: Verdünnen Sie das 1 M Ammoniumformat in den Isopropylalkohol (IPA), bevor Sie das ACN hinzufügen. Ammoniumformat ist in CAN unlöslich. - Bereiten Sie 1 L der mobilen Phase C bestehend aus 10 mM Ammoniumformat im Verhältnis 89:10:1 Isopropylalkohol:Acetonitrile:Wasser vor. Dazu ca. 500 ml Isopropanol, 10 ml 1 M Ammoniumformatbestand und 100 ml Acetonitril zu einem 1 L Volumetkolben hinzufügen. Füllen Sie die Linie mit Isopropanol. In eine 1 L-Flasche geben und 15 min beschallen, um zu entgasen.
- Herstellung von LC-MS-Systemwaschlösungsmitteln
- Ersetzen Sie die Pumpenkopf-Waschlösung durch eine frische Lösung. Verwenden Sie 50% Methanol, 10% Isopropylalkohol oder andere, wie vom Hersteller empfohlen.
- Bereiten Sie starke und schwache Nadelwaschlösungen zum Waschen der Injektionsflüssigkeiten vor und nach der Probeninjektion vor. Für die starke Wäsche, fügen Sie gleiche Mengen an ACN und IPA. Für die schwache Wäsche eine Lösung von 10% ACN (die ca. 500 ml und 1 L jeder der starken und schwachen Waschungen für dieses Protokoll und die Anzahl der Proben) in separaten Flaschen vorbereiten.
- Stellen Sie die Nadelwaschvolumen für die starken bzw. schwachen Waschungen auf 600 l bzw. 1800 l ein.
5. Vorbereitung von Proben für die LC-MS-Analyse
- Gemäß den Herstellern Standard-Betriebsverfahren für die Herstellung von 400 ng /l Leucin Enkephalin, Pipette 7,5 ml Wasser in die 12 ml Leucin-Enkephalin-Durchstechflasche mit 3 mg Leucin-Enkephalin. Bei -80 °C in 50 L Aliquots einfrieren.
- Bereiten Sie 100 ml 5% ACN mit 200 ng/ml Leucin-Enkephalin (50 l von 400 ng/l Leucin Enkephalin) vor. Bereiten Sie sich am selben Tag wie die LC-MS-Analyse vor.
- Fügen Sie der 50-L-Probe aliquot, die aus Schritt 3 hergestellt wurde, 950 l 5% Acetonitril mit dem Injektionsstandard Leucin-Enkephalin hinzu.
- Wirbel, um die vorbereitete Probe zu mischen.
6. LC-MS-Setup
HINWEIS: Eine detaillierte Beschreibung der Einrichtung von Instrumenten und Erfassungsmethoden finden Sie im Benutzerhandbuch des Herstellers. Ein allgemeiner Leitfaden und die Einzelheiten zu diesem Protokoll sind unten aufgeführt. Die folgenden Schritte können jederzeit vor dem Erfassen der Daten ausgeführt werden.
- Öffnen Sie ein LC-MS-Hardwareprofil.
- Richten Sie die chromatographische Methode wie in Tabelle 1beschrieben ein. Stellen Sie sicher, dass das LC-System mit einem quaternären Lösungsmittelmanager ausgestattet ist, um diesen Gradienten einzurichten.
HINWEIS: IPA ist ein viskoses Lösungsmittel. Es sollte mit einer niedrigen Durchflussrate eingeführt werden, und es sollte eine ausreichende Ausgleichszeit verwendet werden, bevor die Zusammensetzung auf 98,0 % erhöht wird. Durch diese Schritte wird verhindert, dass das LC-System überdruckt und angehalten wird. - Richten Sie die Massenspektrometererfassungsmethoden für jeden positiven und negativen ToF-MS-Modus über den m/z-Bereich 50-1.300 ein.
ANMERKUNG: Das hier vorgestellte Instrument erfordert, dass positive und negative Methoden kalibriert und einzeln ausgeführt werden (d. h. Polaritätswechsel innerhalb einer Methode ist nicht möglich). - Wenn die LC-Spalte neu ist, konditionieren Sie die Spalte entsprechend der Empfehlung des Herstellers.
HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten direkt vor der Datenerfassung abgeschlossen werden. - Kalibrieren Sie in einem "nur MS"-Hardwareprofil das Massenspektrometer gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Führen Sie diesen Schritt vor jedem Erfassungsmodus aus, um sicherzustellen, dass sich das System vor der Kalibrierung in jeder bestimmten Modalität stabilisiert hat.
- Reinigen und spülen Sie das LC-Fluidiksystem mit LC-MS-Lösungsmitteln, einschließlich mobiler Phasen- und Waschlösungsmittel.
- Gleichgewichten Sie das LC-System unter Verwendung der Startbedingungen der LC-Methode, um sicherzustellen, dass sich der Säulendruck stabilisiert hat.
- Natriumformat (0,5 mM in 90% IPA) zu Beginn der Probensequenz (siehe unten) injizieren, um die Gerätekalibrierung zu überprüfen.
- Richten Sie die Instrumentensequenztabelle so ein, dass lösemittelhaltige und präparative (Extraktions-)Rohlinge zuerst analysiert werden; gefolgt von gepoolten QC-Proben (6-10) für die Systemkonditionierung; dann läuft die randomisierte Stichprobenliste mit QC-Proben in regelmäßigen Abständen (z.B. jede fünfte Injektion) als technische Replikationen. Führen Sie zwei QC-Beispiele am Ende der Sequenz aus.
HINWEIS: Es ist hilfreich, das Datum und die Injektions-/Erfassungsreihenfolge in den Beispieldateinamen sowie die Beispiel-ID aufzunehmen. Beispiel: YYYY MMDD_Injection number_Variety_Biological replizieren. Stellen Sie vor dem Drücken des Starts sicher, dass der LC-Säulendruck stabil ist und dass der LC mit dem MS verbunden ist.
7. Datenverarbeitung
HINWEIS: Abbildung 1ist ein allgemeiner Datenverarbeitungsworkflow dargestellt.
- Überprüfen Sie die Datenqualität (interne Standardmassengenauigkeit (Berechnung unten) und Signalreproduzierbarkeit), während die Sequenz läuft. Zur Überprüfung der Signalreproduzierbarkeit sollte eine Sichtprüfung von überlagerten Spektren ausreichen.
ANMERKUNG: Massenfehler (ppm) = ((Theoretische Masse – gemessene Masse) / theoretische Masse) x 106 - Generieren Sie eine ausgerichtete Peak-Intensity-Matrix mit Samples x internen Standards (ausgerichtet nach Aufbewahrungszeit und m/z-Werten).
- Öffnen Sie die Datenverarbeitungssoftware (siehe Tabelle der Materialien). Klicken Sie unter Startseite > Öffnenauf Daten. Navigieren Sie zum entsprechenden Dateispeicherort, und öffnen Sie alle Datendateien.
- Wählen Sie unter Startseite > Sequenz > Verarbeitungstyp Quantitation aus dem Dropdown-Menü aus.
- Klicken Sie unter Startseite > Methode > Quanauf Kalibrierungskomponenten. Füllen Sie jedes Feld mit den in Tabelle 2angegebenen Details aus. Klicken Sie auf OK.
- Füllen Sie im linken Bereich in den Spalten neben den Datendateien den Beispieltyp aus, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Zelle klicken und Unbekanntauswählen. Füllen Sie die Ebene als n/aaus.
- Wählen Sie unter Startseite > Verarbeitungdie Option Sequenzaus. Wählen Sie einen Speicherort aus, um die Sequenz zu speichern, und klicken Sie dann auf Verarbeiten.
- Wählen Sie unter Startseite > Ergebnisse Quanaus. Wählen Sie im Quan-Viewer Exportläufe in den Matrixanalysatoraus.
- Klicken Sie im Matrix-Analyzer-Ergebnisbetrachter auf Exportieren nach csv. Speichern Sie die Datei als Tabellenkalkulationsdatei.
- Berechnen Sie in der Tabellenkalkulationssoftware den Durchschnitt, die Standardabweichung und die relative Standardabweichung der Intensität (Spitzenfläche) jedes internen Standards.
- Generieren Sie eine ausgerichtete Peak-Intensity-Matrix mit Samples x ungezielten Features (ausgerichtet nach Aufbewahrungszeit und m/z-Werten).
- Öffnen Sie die Software zur Analyse der Analyse kleiner Moleküle (siehe Tabelle der Materialien), und wählen Sie Datei > Neu aus, um ein neues Experiment zu erstellen. Benennen Sie das Experiment, und wählen Sie den Speicherort zum Speichern und Speichern von Experimentdateien aus. Klicken Sie auf Weiter.
- Wählen Sie den Typ des verwendeten Instruments (hochauflösendes Massenspektrometer), das Datenformat (Profil) und die Polarität (positiv oder negativ) aus. Klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie alle in der Bibliothek verfügbaren Addukte aus, und bearbeiten Sie die Adduktionsbibliothek nach Bedarf. Klicken Sie auf Experiment erstellen. Eine neue Seite wird geladen, auf der der Rest der Datenverarbeitung fortgesetzt wird.
- Importieren von Datendateien. Wählen Sie das Dateiformat aus, und wählen Sie dann Import aus. Navigieren Sie zum Speicherort der Daten, und wählen Sie die zu importierenden Datendateien aus. Der Fortschritt wird für jede Datei im linken Bereich der Seite angezeigt.
- Nachdem Datendateien importiert wurden, wählen Sie Automatische Verarbeitung startenaus. Wählen Sie eine Methode zum Auswählen einer Ausrichtungsreferenz aus. Lassen Sie die Software entweder alle Runs auf Ihre Eignung bewerten, geben Sie eine Liste geeigneter Samples (d. h. QC-Beispiele) oder wählen Sie die referenzamte, d.h. eine QC-Probe in der Mitte. Wählen Sie Ja, richten Sie meine Ausführungen automatisch aus > Weiter.
- Wählen Sie Weiter auf der Versuchsentwurfsseite (dies kann später eingerichtet werden).
- Wählen Sie Peak Picking durchführen aus, und legen Sie dann Parameter fest. Wählen Sie unter der Registerkarte "Spitzenauswahllimits" absolute Ionenintensität aus, und geben Sie 100ein. Wählen Sie eine minimale Spitzenbreite anwenden und geben Sie 0.01 min ein. Wählen Sie OK > Fertigstellen . Wenn die Verarbeitung abgeschlossen ist, wählen Sie Schließenaus.
HINWEIS: Peak Picking Limits können bei Bedarf für andere Datendateitypen optimiert werden. - Wählen Sie unten rechts auf dem Bildschirm Abschnitt Abgeschlossenaus. Überprüfen Sie ausgerichtete Ausführungen, und stellen Sie sicher, dass jedes Beispiel an der Referenz ausgerichtet ist. Die Ausrichtungswerte betrugen >90% für die hier vorgestellten Daten. Wählen Sie Abschnitt Abgeschlossenaus .
- Wählen Sie auf der nächsten Seite zwischen dem Betreffentwurf aus. Benennen Sie das Design. Wählen Sie Die Ausführung manuell gruppieren aus, und erstellen Sie Entwurf. Bedingung hinzufügen, auf Bedingung 1 klicken und die Gruppe entsprechend benennen. Klicken Sie auf Abschnitt Abgeschlossen.
HINWEIS: Fügen Sie weiterhin Bedingungen hinzu, die geeignet sind, Statistiken innerhalb der Software zu verwenden. Da wir die Software nur verwendet haben, um eine ungezielte Matrix zu generieren, haben wir eine einzelne Bedingung mit der Bezeichnung "alle" verwendet. - Wählen Sie auf der nächsten Seite Abschnitt Abgeschlossenaus. Wiederholen Sie die Spitzenauswahl nicht.
- Überprüfen Sie die Dekonvolution, und klicken Sie dann auf Abschnitt Abgeschlossen.
- Gehen Sie zu Datei > Zusammengesetzte Messungen exportieren. Deaktivieren Sie alle Eigenschaften, die in der Ausgabe nicht gewünscht werden. Klicken Sie auf OK. Wählen Sie einen Speicherort aus, um die CSV-Datei zu speichern. Klicken Sie auf Speichern > Datei öffnen > Ordner öffnen oder Schließen.
- Filtern Sie die Daten mithilfe der Extraktionsrohlinge, um Artefakte (Spreadsheet-Software) zu entfernen.
- Berechnen Sie für jedes RT x m/z-Feature in einer neuen Spalte die durchschnittliche Antwortvariablen in Extraktionsrohlingen.
- Berechnen Sie für jedes RT x m/z-Feature die durchschnittliche Antwortinin in allen anderen Stichproben (einschließlich QC-Samples).
- Berechnen Sie die % Spitzenintensität von Rohlingen in Stichproben (durchschnittliche Antwort in Leer/Durchschnitt-Antwort in Stichproben x 100).
- Sortieren Sie die Prozentuale Beitragsspalte von den niedrigsten auf die höchsten Werte.
- Entfernen Sie Features, die >5% Intensitätsbeitrag aus Leerzeichen haben.
- Filtern Sie fehlende Werte und korrigieren Sie die Funktionssignale auf Signale in gepoolten QC-Samples.
- Öffnen Sie die Datenverarbeitungssoftware (Tabelle der Materialien). Klicken Sie auf die Schaltfläche MatrixAnalyzer anzeigen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Datendatei öffnen.
- Navigieren Sie zum Speicherort der Csv-Datei, der die Spitzenintensität von RT x m/z-Features für jedes Beispiel enthält (ungezielte Matrix). Wählen Sie Öffnen.
- Füllen Sie unter der Registerkarte QC-Beispiele jeden Parameter nach Bedarf aus. Verwenden Sie für den hier beschriebenen Datensatz QC category=QC, ignore categories=empty, impute type=none, coverage threshold=80, scale using=no scaling, uncheck log transform, correct using=smoothing spline, smoothing=0.25.
- Oben rechts im Matrix-Panel klicken Sie auf die Wiedergabeschaltfläche QC-Korrektur.
- Nachdem die Korrektur oben rechts im Matrixbedienfeld durchgeführt wurde, klicken Sie auf Ergebnisse speichern. Navigieren Sie zu einem geeigneten Speicherort, und speichern Sie die CSV-Ergebnisdatei.
- Filtern Sie die Daten, um Features zu entfernen, die >20% RSD in QC-Beispielen aufweisen.
- Ordnen Sie die Daten so an, dass sich Beispiele in Zeilen befinden und Features in Spalten.
- Berechnen Sie in einer neuen Spalte die durchschnittliche Spitzenintensität für QC-Samples.
- Berechnen Sie in einer neuen Spalte die Standardabweichung der Spitzenintensität für QC-Samples.
- Berechnen Sie die relative Standardabweichung der Spitzenintensität für QC-Proben: (QC-Standardabweichung/QC-Durchschnitt) x 100.
- Sortieren Sie die Features von der niedrigsten zur höchsten %RSD, und entfernen Sie Features mit einer QC-RSD >20%.
- Filtern Sie die Daten, umsampleFeatures mit niedrigen RSD-Beispiel-/RSD-QC-Verhältnissen (z. B. <1) zu entfernen.QC
- Berechnen Sie in einer neuen Spalte die durchschnittliche Spitzenintensität für Stichproben.
- Berechnen Sie in einer neuen Spalte die Standardabweichung der Spitzenintensität für Stichproben.
- Berechnen Sie die relative Standardabweichung der Spitzenintensität der Proben: (Probestandardabweichung/Probendurchschnitt) x 100.
- Teilen Sie in einer neuen Spalte die Samples RSD durch die QC-RSD.
- Sortieren Sie diesampleWerte (RSD-Beispiel/RSD-QC-Verhältnisse) von den höchsten zu den niedrigsten und entfernen Sie Features mit einem Verhältnis <1.QC
- Fehlende Werte imputieren (mehrere Online-Methoden verfügbar).
- Formatieren Sie die Kalkulationstabelle so, dass sich Beispiele in Zeilen befinden und Features in Spalten. Die erste Spalte sollte der Dateiname der Beispiele sein. Erstellen Sie eine zusätzliche Spalte neben den Dateinamen, und geben Sie die Beispielgruppierungen ein. In diesem Fall wurden die Proben nach Sorte gruppiert.
- Speichern Sie die Kalkulationstabelle als CSV-Datei.
- Gehen Sie auf die Homepage für die webbasierte analytische Pipeline für Hochdurchsatz-Metabolomik (siehe Tabelle der Materialien) und klicken Sie auf Klicken Sie hier, um zu starten.
- Klicken Sie auf Statistische Analyse. Wählen Sie unter Daten hochladenaus, wählen Sie Datentyp: Spitzenintensitätstabelle, Format: Samples in Zeilen (ungepaart) und wählen Sie dann Datei aus.
- Navigieren Sie zur .csv-Datei, wählen Sie Öffnen und dann Sendenaus.
- Wählen Sie auf der nächsten Seite die Option Schätzung des fehlenden Wertesaus. Deaktivieren Sie Schritt 1 (dies wurde in AnalyzerPro XD durchgeführt). Wählen Sie in Schritt 2 eine Methode aus, um fehlende Werte zu schätzen.
HINWEIS: Für die hier vorgestellten Daten wurde "fehlende Werte schätzen" mit 'KNN' ausgewählt. - In dieser Phase kann die Datenmatrix heruntergeladen werden (wählen Sie Download aus dem linken Bereich der Webseite) oder weitere statistische Analysen durchführen.
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Representative Results
Das Pflanzenmetabolom wird durch eine Kombination seines Genoms und seiner Umwelt beeinflusst, und zusätzlich in einer landwirtschaftlichen Umgebung, dem Pflanzenmanagementregime. Wir zeigen, dass hier genetische Unterschiede zwischen Weizensorten auf Metabolitenebene beobachtet werden können, wobei über 500 gemessene Verbindungen signifikant unterschiedliche Konzentrationen zwischen den Sorten allein im Getreide aufweisen. Eine gute Massengenauigkeit (<10 ppm-Fehler) und die Signalreproduzierbarkeit (<20% RSD) interner Standards (Abbildung 2) wurden sowohl für negative als auch für positive Ionisationsmodi beobachtet (Tabelle 3). Die beschriebene Probenvorbereitung und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-basierte Analyse ergab >900 dekonvolutierte Features im negativen Ionisationsmodus und >1300 dekonvolutierte Features im positiven Ionisationsmodus. Präparative Rohlinge (Abbildung 3) wurden einbezogen, um festzustellen, ob die Probenvorbereitungs- und Analysemethoden Artefaktmerkmale einführten und somit alle nicht-biologischen Einflüsse aus der Datenmatrix eliminiert wurden. Es wurde festgestellt, dass 421 Signale im negativen Modus und 835 Signale im positiven Modus Signalintensitäten hatten, die 5 % der durchschnittlichen Signalintensität in Kornproben entsprachen oder darüber lagen. Diese Funktionen wurden entfernt und nach weiteren Datenfilterschritten (Schritt 7 und Abbildung 1)gab der negative Modus 483 Features zurück und der positive Modus gab 523 Features zurück, die den metabolischen Schnappschuss bildeten. Die Methode war erfolgreich bei der Erkennung von Merkmalen, die signifikant unterschiedliche Intensitäten zwischen Weizensorten hatten (Abbildung 4) mit >500 signifikanten Merkmalen in beiden Ionisationsmodi. Im negativen Ionisationsmodus befanden sich die meisten signifikanten Merkmale im umgekehrten Phasenverlauf und im positiven Ionisationsmodus lagen die meisten signifikanten Merkmale im Lipidgradienten (Abbildung 4).
Abbildung 1: Der in dieser Analyse verwendete Workflow für die Datenüberprüfung, -verarbeitung und -filterung. Schritt 1 wird mit der Datenerfassungs-/Anzeigesoftware am Gerät durchgeführt, so dass "on-the-fly"-Bewertungen durchgeführt werden können. Dazu gehören die Berechnung des Massenfehlers (ppm) interner Standards und das Überlagern interner Standardspitzen für die visuelle Bewertung der Datenreproduzierbarkeit. In den Schritten 2-7 wird die im Protokoll, Schritt 7 beschriebene Datenverarbeitungsprozedur beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Extrahierte Ionenchromatogramme. Extrahierte Ionenchromatogramme von 13C6-Sorbitol (dunkelblau), Leucin-Enkephalin (rosa), d 6-Trans-Cinnamsäure (orange), 2-Aminoanthracen (grün) und Miconazol (hellblau) interne Standards in positiven (oben) und negativen (unten) Elektrospray-Ionisation (ESI) Modi.6 Die internen Standard-Retentionszeiten und -intensitäten werden angezeigt. ESI + und ESI - Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Gesamtüberlagerung des Ionenchromatogramms (TIC) von präparativen Rohlingen, die negative Modi (rosa) und positive Modi (blaue) Ankäufe anzeigen. Ein interner Standard, Miconazol, wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Gesamt-Ionenchromatogramm-Overlay (TIC), das negative Modi (rosa) und positive Modi (blaue) Erfassungen und die Anzahl der Merkmale zeigt, die sich zwischen der Weizensorte im chromatographischen Gradienten erheblich unterscheiden. Im negativen Modus wurde die größte Anzahl signifikanter Merkmale gefunden, wenn die mobile Phase-B-Zusammensetzung hoch war. Im positiven Modus wurde die größte Anzahl signifikanter Merkmale gefunden, wenn die mobile Phase-C-Zusammensetzung hoch war. Ein interner Standard, Miconazol, wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Segment | Zeit | Durchflussrate | %A | %B | %C | Kurve |
| (min) | (mL/min) | |||||
| 1 | Ersten | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 2 | 1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 3 | 7 | 0.8 | 2 | 98 | 0 | 6 |
| 4 | 7.1 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 5 | 10 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 6 | 18 | 0.4 | 0 | 10 | 90 | 6 |
| 7 | 21 | 0.4 | 0 | 2 | 98 | 6 |
| 8 | 21.1 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 9 | 24 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 10 | 24.1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 11 | 25 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
Tabelle 1: Flüssigchromatographie zeitgezeitiver Programm mobiler Phasenkompositionen.
| Parameter | Interner Standard | ||||
| 13 C6-sorbitol | Leucin-Enkephalin | d6-Transcinnamsäure | 2-Amino-Anthracen | Miconazol | |
| Quan m/z | 211.09 (187.09) | 556.28 (554.26) | 155.097 (153.08) | 194.1 | 414.99 |
| Massentoleranz (amu) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 | 0.01 |
| Aufbewahrungszeit | 1.2 | 4.6 | 5.1 | 6.5 | 7 |
| Aufbewahrungszeitfenster | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 | 0.1 |
| Erkennungstyp | Höchsten | Höchsten | Höchsten | Höchsten | Höchsten |
| Antworttyp | Bereich | Bereich | Bereich | Bereich | Bereich |
| Flächenschwelle | 10 | 10 (50) | 10 (50) | 10 | 10 |
| Breitenschwellenwert | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| Höhenschwelle | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Signal-Rausch-Verhältnis | 5 | 5 | 3 (5) | 5 | 5 |
| Glättung | 5 | 5 (3) | 5 (3) | 5 | 5 |
Tabelle 2: Spitzenerkennungsparameter für interne Standards im positiven (und negativen) Erfassungsmodus.
| Massengenauigkeit (ppm) | %RSD vor QC-Korrektur | %RSD nach QC-Korrektur | ||
| Negativer Modus | 13 C6-sorbitol | 4.59 | 6.12 | 7.08 |
| D6-Transcinnamsäure | 7.94 | 3.93 | 5.99 | |
| Leucin-Enkephalin | 0.91 | 1.8 | 1.96 | |
| Positiver Modus | 13 C6-sorbitol | 5.65 | 14.1 | 15.3 |
| Leucin-Enkephalin | 3 | 3.24 | 5 | |
| D6-Transcinnamsäure | 8.03 | 5.41 | 9.81 | |
| 2-Aminoanthracen | 3.99 | 7.97 | 5.45 | |
| Miconazol | 1.8 | 3.01 | 5.72 | |
Tabelle 3: Probe (n=30) interne Standardmassengenauigkeit (ppm) und Signalreproduzierbarkeit vor und nach QC-Korrektur ausgedrückt als relative Standardabweichung (%).
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Discussion
Hier stellen wir eine LC-MS-basierte ungezielte Metabolomik-Methode zur Analyse von Weizengetreide vor. Die Methode kombiniert vier Erfassungsmodi (umgekehrte Phase und lipid-amenable reversed phase mit positiver und negativer Ionisation) in zwei Modi, indem eine dritte mobile Phase in den umgekehrten Phasenverlauf eingeführt wird. Der kombinierte Ansatz ergab etwa 500 biologisch relevante Merkmale pro Ionenpolarität, wobei etwa die Hälfte dieser signifikant unterschiedlichen Intensitäten zwischen Weizensorten aufweist. Signifikante Veränderungen der Metabolitenkonzentration im Getreide verschiedener Weizensorten deuten auf eine veränderte Biochemie hin, die mit Krankheitsresistenz, Stresstoleranz und anderen phäkotypischen Merkmalen in Verbindung gebracht werden kann, die für die Kornqualität und den Ertrag wichtig sind. Zum Beispiel wurden Metabolomik-Ansätze verwendet, um neue Abwehrmechanismen12 zu beschreiben und die Rolle von Metaboliten bei der Dürretoleranz vorzuschlagen13. Künftige Anwendungen dieses Protokolls könnten in der Lage sein, biochemische Profile bestimmter Sorten weiter mit genetischen Merkmalen zu verknüpfen, die für bestimmte Umgebungen und Managementpraktiken wünschenswert sind. Dies wiederum würde die Produktion optimaler Kornqualität und Ausbeute für ausgewählte Genotypen ermöglichen.
Die Einbeziehung interner Standards ist für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung, damit der Benutzer Änderungen der Signal-, Aufbewahrungszeitverschiebungen und als Indikatoren für die Massengenauigkeit bestimmen kann. Signaländerungen können z. B. auf eine suboptimale Extraktion, Injektion (einschließlich fluidischer Systemblockaden) oder Detektorleistung hinweisen. Retentionszeitverschiebungen können auf eine schlechte Pumpenleistung, eine unangemessene Ausgleichedes des mobilen Phasengradienten oder auf eine Verschlechterung der stationären Phase der LC-Säule hindeuten. Eine schlechte Massengenauigkeit kann auf eine abgedriftete Kalibrierung hindeuten und dass das System neu kalibriert werden muss. In allen oben genannten Fällen sollte das System angehalten und die entsprechende Wartung/Ersatz der Teile durchgeführt werden. Wir haben vier Standards in die Extraktionslösung aufgenommen, die zur Herstellung von Getreide verwendet wird, und einen Standard in der endigen Probe, die vor der Injektion hinzugefügt wurde. Es wurde darauf geachtet, dass die Standards für jeden Ionisierungsmodus zugänglich sind und eine Reihe von Aufbewahrungszeiten abdeckten; Wir erkennen jedoch an, dass diese Standards durch die Aufnahme eines markierten Lipidstandards verbessert werden könnten. Es hat sich gezeigt, dass Weizengetreide Hunderte von Triacylglycerolen (TAGs)5enthält, von denen jedes eine geeignete Ergänzung zu diesem Protokoll wäre. Die Aufnahme von präparativen Rohlingen und gepoolten QC-Beispielen8 sind ebenfalls wichtige Schritte in diesem Protokoll. Tausende von Ionenmerkmalen werden in ungezielten Massenspektrometriemethoden nachgewiesen, und es ist wichtig, diejenigen auszuschließen, die nur in leeren Proben vorhanden sind, und auch solche, die während der gesamten Analyse nicht reproduzierbar nachgewiesen werden (d. h. hohe %RSD).
Obwohl die aktuelle Methode erhebliche Zeit und Ressourcen spart, kann, wenn kein quaternärer Lösungsmittelmanager nicht verfügbar ist, Standard-Umkehrphasen- und Lipidmethoden verwendet werden, um die gleichen Ergebnisse zu erzielen. Das in diesem Protokoll verwendete Extraktionsvolumen würde für die Analyse zusätzlicher Erfassungsmodi ausreichen. Dieses Protokoll beschreibt eine Acetonitrilextraktion. Während erfolgreich, ein alternatives Extraktionslösungsmittel, oder Kombination von Lösungsmitteln, wird eine andere Metabolitabdeckung bieten, die wiederum mehr Eigenschaften liefern und /oder eine bessere (oder eine geringere) Extraktionseffizienz einiger Verbindungen geben kann. Wir haben nicht versucht, die Metabolitenidentität der in diesem Protokoll gelösten statistisch signifikanten Messungen festzustellen; Jedoch, Massenspektraldatenbanken für pflanzliche Metaboliten und Lipide sind verfügbar und entwickeln5,14,15. Um die Metaboliten zu identifizieren, müssten Tandem-Massenspektren (MS/MS) zusätzlich zu vollständigen Scandaten gesammelt werden. Diese können während des ersten Laufs mit gepoolten Proben und einer geeigneten MS/MS-Methode oder auf reserviertem Extrakt (bei -80 °C gespeichert) gesammelt werden, sobald Metaboliten von Interesse bestimmt wurden. Wir beobachteten große Faltenveränderungen von Verbindungen zwischen Sorten, so dass wir empfehlen würden, sowohl und in der zweiten Instanz, mit einer Sorte bekannt, eine hohe Konzentration der Verbindung von Interesse enthalten, um die höchste Qualität MS / MS-Spektrum zu erhalten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren möchten das Landwirtschafts- und Ernährungsstipendium des West australian Premier (Department of Jobs, Tourism, Science and Innovation, Government of Western Australia) und den Premier es Fellow, Professor Simon Cook (Centre for Digitale Landwirtschaft, Curtin University und Murdoch University). Feldversuche und Getreideprobenentnahme wurden von der Regierung des Programms Royalties for Regions in Westaustralien unterstützt. Wir würdigen Grantley Stainer und Robert French für ihre Beiträge zu Feldversuchen. Die von NCRIS finanzierten Bioplattformen Australien sind für die Finanzierung von Ausrüstungen anerkannt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
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