Summary
小麦粒代謝物および脂質の非標的分析法を紹介する。このプロトコルは、アセトニトリル代謝産物抽出法と逆相液体クロマトグラフィー質量分析法法を含み、正および負のエレクトロスプレーイオン化モードでの取得を伴う。
Abstract
遺伝子間の相互作用、農業における環境と管理を理解することで、製品収量と品質をより正確に予測し、管理することができます。メタボロミクスデータは、特定の時点でこれらの相互作用の読み取りを提供し、生物の生化学的状態を有益にします。さらに、個々の代謝産物または代謝産物のパネルは、収量および品質予測および管理のための正確なバイオマーカーとして使用することができる。植物のメタボロムは、生理学的特徴とバイオマーカー発見に生化学的洞察の機会を提供する様々な物理化学的特性を有する何千もの小分子を含むことが予測される。これを利用するために、メタボロミクス研究者にとって重要な目的は、単一の分析で可能な限り多くの物理化学的多様性を捉えるためです。ここでは、フィールド成長小麦の分析のための液体クロマトグラフィー質量分析ベースの未標的メタボロミクス法を提示する。この方法は、液体クロマトグラフ四級溶媒マネージャーを使用して第3移動相を導入し、従来の逆相勾配と脂質を受け入れ可能な勾配と組み合わせたものです。穀物調製、代謝物抽出、器械分析およびデータ処理ワークフローについて詳細に説明する。質量精度と信号再現性が良好で、この方法はイオン化モードごとに約500の生物学的関連特徴を生み出した。また、小麦品種間の代謝産物および脂質特徴シグナルが有意に異なって決定された。
Introduction
農業における遺伝子、環境、管理慣行の相互作用を理解することで、製品の収量と品質をより正確に予測し、管理することができます。植物代謝物は、ゲノム、環境(気候、降雨など)などの要因の影響を受け、農業環境では作物の管理方法(肥料の適用、殺菌剤など)が影響を受けます。ゲノムとは異なり、メタボロームはこれらの要因の影響を受けるため、メタボロミクスデータは特定の時点でこれらの相互作用の生化学的指紋を提供する。メタボロミクスベースの研究には通常、生物の生化学の深い理解を達成し、生理学に関連して摂動(非生物的または生物的ストレス)への応答メカニズムを説明するのを助けるという2つの目標のうちの1つがあります。そして第二に、バイオマーカーを研究中の摂動と関連付ける。どちらの場合も、この知識を持つことの結果は、歩留まりのサイズと品質を向上させるという目標を達成するためのより正確な管理戦略です。
植物のメタボロムは、様々な物理化学的特性を有する数千1個の小分子を含むと予測されている。現在、メタボロミクスプラットフォーム(主に質量分析と核磁気共鳴分光法)は、単一の分析でメタボローム全体を捕捉することはできません。メタボロミクス研究者にとって、メタボロムの可能な範囲を可能な限り多く提供するこのような技術(サンプル調製、代謝産物抽出および分析)の開発は、メタボロミクス研究者にとって重要な目的です。小麦粒の以前のターゲットを持っていないメタボロミクス分析は、複数のクロマトグラフィー分離と取得極性および/またはインストゥルメンテーションからのデータを組み合わせて、より大きなメタボロームカバレッジを実現しました。しかし、これは、各モダリティのために別々に調製し、取得するサンプルを必要としました。例えば、ベレグギアら2は、非極性分析体のGC-MS分析に加えて、極性分析体のGC-MS分析のための誘導体化サンプルを調製した。Dasら 3は、分析のカバレッジを改善するために GC-と LC-MS の両方の方法を使用しました;ただし、この方法では、一般に、上記のサンプル準備と 2 つの独立した分析プラットフォームが必要になります。GC-MS5 2、3、43および4LC-MS3を用いた小麦穀物の以前の分析は、GC-MSの50〜412(同定された55)機能、GC-MSおよびLC-MSを組み合わせた409、LC-MS脂質分析5のための数千の機能をもたらした。2少なくとも2つのモードを1つの分析に組み合わせることで、拡張されたメタボロームカバレッジを維持することができ、生物学的解釈の豊かさを高める一方で、時間とコストの両方で節約を提供します。
逆相クロマトグラフィーによる広範な脂質種の効率的な分離を可能にするために、現代のリピドミクス方法論は、溶出溶媒6中のイソプロパノールの高い割合を一般的に使用し、クロマトグラフィーによって解決されない可能性のある脂質クラスに無変性を提供する。効率的な脂質分離のために、開始移動相はまた、分子の他のクラスを考慮する典型的な逆相クロマトグラフィー法よりも有機組成物7においてはるかに高い。勾配の開始時の高い有機組成物は、これらの方法を分子の他の多くのクラスにあまり適さない。最も顕著なのは、逆相液体クロマトグラフィーは、二分溶媒勾配を採用し、クロマトグラフィーの溶出強度が増加するにつれて、ほとんど水性組成から始まり、有機含有量が増加する。この目的のために、我々は、単一の分析内で代謝産物の脂質と非脂質クラスの両方の分離を達成するために、2つのアプローチを組み合わせることを目指した。
ここでは、第3移動相を用いたクロマトグラフィー法を紹介し、単一サンプル調製物と1つの分析カラムを用いた従来の逆転相とリピドミクスに適したクロマトグラフィー法を組み合わせることを可能にする。我々は、これまで主に臨床メタボロミクス研究で実施された品質管理措置およびデータフィルタリングステップの多くを採用してきました。これらのアプローチは、高い技術的再現性と生物学的関連性を持つ堅牢な特徴を決定するのに有用であり、これらの基準を満たしていないものを除外します。例えば、我々は、プールされたQCサンプル8、QC補正9、データフィルタリング9、10の10反復分析と欠損特徴11の偽装について説明する。9
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Protocol
この方法は、30サンプル(サンプルあたり約150シード)に適しています。ここでは、10種類の畑で栽培された小麦品種の3つの生物学的複製が使用されました。
1. 穀物の調製
- サンプル(全粒粉)を-80°Cの貯蔵から取り出す。
注:サンプルが複数の季節から収集されている場合は、収穫後すぐに種子の凍結乾燥をお勧めします。これは、保存期間の変化の後に発生する代謝産物濃度の変化を最小限に抑えます。これを行うには、15 mLプラスチック遠心管(約300種の種子がチューブを充填します)に種子を移し、アルミホイルで覆います。ピンを使用してホイルを2〜3回突き刺し、一晩(約24時間)全粒穀物を凍結乾燥させます。サンプルは、この段階で-80°Cの冷凍庫に戻すか、次の工程を行うことができる。 - 20 sのハイモードで2回実行するための実験室ブレンダーを使用して種子を粉砕します。
注:このプロトコルに使用されるブレンダーは、ブレンダーをブレードの高さに充填し、比較的均質な粉砕粒サンプルを与えるために約150シードを必要とします。 - ベースからブレンダーを取り出し、ブレンダーの側面をタップして、粗い粉砕された穀物をサンプルの表面に持ち込みます。粗い材料は廃棄するか、または保存することができます。
- ブレンダーから2 mLプラスチックマイクロ遠心チューブに粉末状の細かく粉砕した材料を移します。
注:ブレンダーを脱イオン水で洗い、サンプル間のLC-MSグレードのMeOHで洗い流します。次のサンプルに進む前に、ブレンダーが完全に乾燥していることを確認してください。 - 粒状サンプルを細かく挽いて冷凍庫に戻すか、次のステップ(代謝物抽出)に進みます。
2. 抽出溶媒の調製
注:抽出を行うのと同じ日に抽出溶媒を準備してください。
- 各規格の1mg/mLの少なくとも2 mLを準備してください。アセトニトリル(ACN)を使用して、2-アミノアントラセン、ミコナゾールおよびd6-トランスシンミン酸を調製する。水を使って13C6-ソルビトールを調製する。
- 各1 mg/mL 標準の 2 mL を取り、100 mL の体積フラスコに加えます。
- ボリュームフラスコをアセトニトリルでラインに充填します。アセトニトリルの100 mLに20μg/mLの内部標準が含まれていることを確認してください:2-アミノアントラセン、ミコナゾール、13C6-ソルビトール、d6-トランスシンミン酸。
3. 代謝物抽出
- 2mLマイクロ遠心分離チューブに細かく粉砕された穀物の200mgの重量を量る。
- 500 μLの抽出溶媒を200mgの細かく粉砕した穀物サンプルに加えます。
- 6,500 rpmで20sの2ランのためのホモジナイザーを使用して混合します。
- 遠心分離機を4°Cで5分間16,100×gで5分間。
- 上清を2mLプラスチックチューブに移します。
- ステップ 3.1 から 3.5 までこの手順を繰り返して、合計上清容積を約 1.5 mL にします。
- 渦は上清を混ぜる。
- 各抽出物の等容量(55 μL)を別の2 mLチューブに移し、プールされた穀物抽出サンプルを作ります。
- 抽出物の50 μLアリコートをガラスバイアルに移します。
注: この時点で抽出物を凍結(-80°C)するか、次のステップに進み、LC-MS分析に従うことができます。
4. LC-MS分析のためのソリューションの準備
注意:濃縮酸の場合は、常に水/溶媒に酸を加えます。
- 1 M アンモニウム・フォーマットのストック溶液を 50 mL用意します。3.153gのアンモニウム・ギ酸を量り、50mLの体積フラスコに移す。LC-MSグレードH2Oでラインに容積フラスコを充填します。
- 10 mM アンモニウム・ギ酸からなる移動相Aの1L、0.1%のギ酸を調製する。これを行うには、LC-MSグレード水の約500 mLを1 Lの体積フラスコに加えます。1 Mアンモニウムのフィッレストック10mLと1mLのギ酸を加えます。LC-MSグレードH2O.でラインにボリュームフラスコを充填し、1 Lボトルに移し、15分間超音波処理して脱ガスします。
- 10 mM アンモニウム・フォーマットからなる 1L の移動相 B を 79:20:1 アセトニトリル:イソプロピルアルコール:水、0.1% ギ酸比で調製します。1 L体積フラスコに200mLのイソプロパノールを加えます。1 Mアンモニウムのフィッレストック10mLと1mLのギ酸を加えます。アセトニトリルでラインに容積フラスコを充填します。1 Lボトルに移し、15分間ドガに超音波処理します。
注:ACNを追加する前に、1 Mアンモニウムフォーマットをイソプロピルアルコール(IPA)に希釈してください。アンモニウムのフォーマットはCANに不溶性である。 - 89:10:1イソプロピルアルコール:アセトニトリル:水の比率で10 mMアンモニウム定酸からなる移動相Cの1 Lを準備します。これを行うには、イソプロパノールの約500 mL、1 Mアンモニウムのシギメストックの10 mL、1Lの体積フラスコにアセトニトリルの100 mLを加えます。イソプロパノールでラインに記入します。1 Lボトルに移し、15分間ドガに超音波処理します。
- LC-MSシステム洗浄溶剤の調製
- ポンプヘッド洗浄液を新鮮な溶液に交換してください。メーカーが推奨する50%メタノール、10%イソプロピルアルコール、またはその他を使用してください。
- サンプル注入の前および後の注入の液体を洗浄するための強く、弱い針洗浄の解決を準備する。強い洗浄のために、ACNおよびIPAの等しい量を加える。弱い洗浄のために、10%のACN(このプロトコルとサンプルの数のためにそれぞれ強い洗浄と弱い洗浄のそれぞれ約500 mLと1 Lを必要とする)の溶液を別々のボトルに準備します。
- 強い洗浄と弱い洗浄の場合は、針洗浄量を600 μLと1800 μLに設定します。
5. LC-MS分析用サンプルの調製
- 400 ng/μLロイシンエンケファリンの調製のための製造業者の標準的な操作手順に従って、ピペット7.5 mLの水はロイシンエンケファリンの3mgを含む12 mLロイシンエンケファリンバイアルに入った。50 μL アリコートで-80 °Cで凍結します。
- 200 ng/mLロイシンエンケファリン(50μL400ng/μLロイシンエンケファリン)を含む5%ACNの100 mLを調製してください。LC-MS 分析と同じ日に準備します。
- ステップ3から調製した50μLサンプルアリコートに、注射標準ロイシン・エンケファリンを含むアセトニトリル5%の950μLを加えます。
- ボルテックスは、調製したサンプルを混合する。
6. LC-MS セットアップ
メモ:機器と取得方法の設定の詳細については、製造元のユーザーガイドに記載されています。このプロトコルに固有の一般的なガイドと詳細を以下に示します。次の手順は、データを取得する前にいつでも完了できます。
- LC-MS ハードウェア プロファイルを開きます。
- 表 1に示すように、クロマトグラフィー方式を設定します。LC システムに、この勾配を設定するための第四級溶媒マネージャが装備されていることを確認します。
注: IPA は粘性溶媒です。これは、低流量で導入する必要があり、組成を98.0%に増やす前に十分な平衡時間を使用する必要があります。これらの手順により、LC システムの過加圧や停止を防ぐことができます。 - m/z範囲50~1,300の正と負のToF-MSモードのそれぞれについて、質量分析計の取得方法を設定します。
注:ここで紹介する作業に使用される機器は、正と負の方法を個別に校正して実行する必要があります(すなわち、メソッド内の極性の切り替えは不可能です)。 - LC 列が新しい場合は、製造元の推奨に従って列に条件を設定します。
注: 次の手順は、データ取得の直前に完了する必要があります。 - 「MSのみ」のハードウェアプロファイルで、メーカーの推奨に従って質量分析計を較正します。各取得モードの前にこの手順を完了し、キャリブレーション前にシステムが各指定されたモダリティで安定していることを確認します。
- 移動相および洗浄溶媒を含むLC-MSグレードの溶媒を使用してLC流体システムをパージし、洗浄します。
- LC方式の開始条件を使用してLCシステムを平衡化し、カラム圧が安定していることを確認します。
- サンプルシーケンスの最初(下記の説明)に、インフィラリ(90%IPAの0.5 mM)を注入し、機器のキャリブレーションを確認します。
- 溶剤と準備 (抽出) ブランクが最初に分析されるように、計器シーケンステーブルを設定します。システム・コンディショニング用のプールされた QC サンプル (6-10) が続きます。その後、QCサンプルを含む無作為化サンプルリストは、技術的な反復として一定の間隔(例えば、5回の注入ごと)で実行されます。シーケンスの最後に 2 つの QC サンプルを実行します。
注: サンプルのファイル名とサンプル ID に日付と射出/取得順序を含めるのが役立ちます。例えば、YYYY MMDD_Injectionnumber_Variety_Biological複製します。開始ボタンを押す前に、LC カラムの圧力が安定していること、および LC が MS に接続されていることを確認します。
7. データ処理
注 : 一般的なデータ処理ワークフローを図 1に示します。
- シーケンスの実行中にデータ品質(内部標準質量精度(下記の計算)と信号再現性)を確認します。信号の再現性を確認するには、オーバーレイスペクトルの目視検査で十分です。
メモ: 質量誤差(ppm)=(理論質量 - 測定質量)/理論質量) x 106 - サンプル x 内部標準を含む整列ピーク強度マトリックスを生成します(保持時間とm/z値によって整列)。
- データ処理ソフトウェアを開きます (資料一覧を参照)。[ホーム] > [開く] で、[データ] をクリックします。適切なファイルの場所に移動し、すべてのデータ ファイルを開きます。
- [ホーム]-[シーケンス]-[処理タイプ]で、ドロップダウンメニューから[数量]を選択します。
- [ホーム]-[メソッド]-[Quan]で、[キャリブレーションコンポーネント] をクリックします。表 2に示す詳細を使用して各フィールドに入力します。[OK] をクリックします。
- データ ファイルの横にある列の左側のパネルで、セルを右クリックし、[不明] を選択してサンプルタイプを入力します。レベルをn/aと入力します。
- [ホーム]-[処理] で、[シーケンス] を選択します。シーケンスを保存する場所を選択し、[プロセス] をクリックします。
- [ホーム] > [結果] で、[クアン] を選択します。Quanビューアで、[実行をマトリックス アナライザにエクスポート] を選択します。
- マトリックス アナライザーの結果ビューアで、[csv にエクスポート] をクリックします。ファイルをスプレッドシート ファイルとして保存します。
- スプレッドシートソフトウェアでは、各内部標準の強度(ピーク面積)の平均、標準偏差、相対標準偏差を計算します。
- サンプル x 非ターゲット フィーチャを含む整列ピーク強度マトリックスを生成します(保持時間とm/z値によって整列)。
- 小分子発見解析ソフトウェアを開き(材料表を参照)、ファイル/新規を選択して新しい実験を作成します。実験に名前を付け、実験ファイルを保存して保存する場所を選択します。[次へ] をクリックします。
- 使用する機器の種類(高分解能質量分析計)、データ形式(プロファイル)、極性(正または負)を選択します。[次へ] をクリックします。ライブラリで利用できるすべてのアドダクトを選択し、必要に応じてアドダクト ライブラリを編集します。[実験の作成] をクリックします。新しいページが読み込まれ、残りのデータ処理が続行/発生します。
- データ ファイルをインポートします。ファイル形式を選択し、インポートを選択します。データの場所を参照し、インポートするデータ ファイルを選択します。進行状況は、ページの左側のパネルに各ファイルに表示されます。
- データ ファイルをインポートしたら、[自動処理の開始] を選択します。線形参照を選択する方法を選択します。ソフトウェアが適合性のためにすべての実行を評価するか、適切なサンプル(すなわち、QCサンプル)のリストを与えるか、または最も適した基準、すなわち中シーケンスQCサンプルを選択する。[はい、自動的に実行を配置する]-[次へ] を選択します。
- 実験の設計ページで [次へ] を選択します (これは後で設定できます)。
- [ピーク ピッキングの実行] を選択し、[パラメータの設定]を選択します。[ピークピッキング制限] タブで、[絶対イオン強度] を選択し、「100」と入力します。[最小ピーク幅を適用する] を選択し、「0.01 分」と入力します。処理が完了したら、[閉じる] を選択します。
注: ピーク選択制限は、必要に応じて他のデータ ファイルタイプに合わせて最適化できます。 - 画面右下の [セクションの完了] を選択します。整列された実行を確認し、各サンプルが参照に揃えられていることを確認します。ここに示したデータのアライメント スコアは 90%でした。[セクションの完了 ] を選択します。
- 次のページで、テーマのデザインを選択します。デザインに名前を付けます。[手動で実行をグループ化する]および [設計の作成]を選択します。条件を追加し、条件 1をクリックして、グループに適切な名前を付けます。[セクションの完了 ]をクリックします。
注: ソフトウェア内で統計情報を使用するには、必要に応じて条件を追加し続けます。このソフトウェアを使用して非ターゲットマトリックスを生成しただけなので、「all」というラベルの付いた条件を1つ使用しました。 - 次のページで、[セクションの完了] を選択します。ピークピッキングをやり直さない。
- デコンボリューションを確認し、[セクションの完了] をクリックします。
- [ファイル] > [複合計測値のエクスポート]に移動します。出力で必要としないプロパティの選択を解除します。[OK] をクリックします。csv ファイルを保存する場所を選択します。[保存] > [ファイルを開く] > [フォルダを開く]または[閉じる] をクリックします。
- 抽出ブランクを使用してデータをフィルターし、アーティファクトを削除します (スプレッドシート・ソフトウェア)。
- RT x m/zフィーチャごとに、新しい列で、抽出ブランクの平均応答を計算します。
- RT x m/z機能ごとに、他のすべてのサンプル(QCサンプルを含む)の平均応答を計算します。
- サンプル内のブランクの % ピーク強度を計算します (サンプル x 100 のブランク/平均応答の平均応答)。
- パーセント寄与度列を最低値から最高値に並べ替えます。
- 空白から > 5% の強度貢献度を持つフィーチャーを削除します。
- 欠落値をフィルターし、プールされた QC サンプル内のシグナルに対する機能信号を修正します。
- データ処理ソフトウェアを開きます (資料一覧)。[マトリックスアナライザーの表示] ボタンをクリックします。[データ ファイルを開く]ボタンをクリックします。
- 各サンプル (対象なしマトリックス) の RT x m/z フィーチャのピーク強度を含む .csv ファイルの場所に移動します。[開く] を選択します。
- [QC サンプル] タブで、必要に応じて各パラメーターに入力します。ここで説明するデータ・セットの場合、QC カテゴリー=QC を使用し、カテゴリーを無視する=空、インプルート・タイプ=なし、カバレッジしきい値=80、スケールを使用する=スケーリングなし、ログ変換のチェックを外し、使用する=平滑化スプライン、平滑化=0.25 を使用します。
- マトリックスパネルの右上にある再生ボタンQC 補正をクリックします。
- マトリックス パネルの右上で修正を行った後、[結果の保存] をクリックします。適切な場所に移動し、.csv 結果ファイルを保存します。
- QC サンプルに >20% RSD を持つフィーチャーを削除するためにデータをフィルターします。
- サンプルが行に配置され、フィーチャが列に表示されるようにデータを配置します。
- 新しい列で、QC サンプルの平均ピーク強度を計算します。
- 新しい列で、QC サンプルのピーク強度の標準偏差を計算します。
- QCサンプルのピーク強度の相対標準偏差を計算します:(QC標準偏差/QC平均)x 100。
- 機能を最下位から最上位の %RSD に並べ替え、QC RSD >20% を持つ機能を削除します。
- RSDサンプル/RSDQC比が低いフィーチャを削除するためにデータをフィルター処理します (例: <1)。
- 新しい列で、サンプルの平均ピーク強度を計算します。
- 新しい列で、サンプルのピーク強度の標準偏差を計算します。
- サンプルのピーク強度の相対標準偏差を計算します:(サンプル標準偏差/サンプル平均)x 100。
- 新しい列で、サンプル RSD を QC RSD で除算します。
- 値 (RSDサンプル/RSDQC比) を最高から最低に並べ替え、比率が 1 のフィーチャを削除します。
- 欠損値を含む (オンラインで利用可能ないくつかの方法)。
- サンプルが行に、フィーチャが列に表示されるようにスプレッドシートを書式設定します。最初の列はサンプルファイル名である必要があります。ファイル名の横に追加の列を作成し、サンプルのグループを入力します。この場合、サンプルは、多様性によってグループ化された。
- スプレッドシートを .csv ファイルとして保存します。
- 高スループットのメタボロミクスの Web ベースの分析パイプラインのホームページに移動し (「資料表」を参照) をクリックし、[ここをクリックして開始] をクリックします。
- [統計分析] をクリックします。[データのアップロード] で、[データタイプ: ピーク強度テーブル]、[フォーマット: 行内のサンプル (ペアなし)] を選択し、[ファイル] を選択します。
- csv ファイルに移動し、[開く] を選択して 、[送信] を選択します。
- 次のページで、[欠損値の推定] を選択します。ステップ 1 のチェックを外します (これはアナライザープロ XD で実行されました)。手順 2 で、欠損値を推定する方法を選択します。
注: ここに示すデータの場合 - 'KNN' で 「欠損値を推定する」が選択されました。 - この段階で、データマトリックスをダウンロードするか(ウェブページの左側のパネルからダウンロードを選択)、またはさらに統計分析を実行することができます。
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Representative Results
植物のメタボロメは、そのゲノムと環境の組み合わせ、さらに農業環境、作物管理体制の影響を受けます。我々は、小麦品種間の遺伝的差異が代謝産物レベルで観察され得、ここでは、500以上の測定化合物が穀物単独の品種間で有意に異なる濃度を示すことを実証する。良好な質量精度(<10 ppm誤差)および内部標準の信号再現性(<20%RSD)は、Figure 2負と正のイオン化モードの両方について観察された(表3)。記載されたサンプル調製および液体クロマトグラフィー質量分析ベースの解析により、負イオン化モードで900畳み込んだ特徴と、正のイオン化モードでの>1300デコンボルト特徴が得られた。サンプル調製法および分析方法がアーティファクト特徴を導入したかどうかを判断するために、調製ブランク(図3)を含め、したがって、データマトリックスから排除されたすべての非生物学的影響を決定した。負モードでは421個、正モードでは835個の信号が、粒状サンプルの平均信号強度の5%以上の信号強度を持つことがわかった。これらの特徴を除去し、さらなるデータフィルタリングステップ(ステップ7および図1)の後に、ネガティブモードは483の特徴を返し、陽性モードは523の特徴を返し、代謝スナップショットを形成した。この方法は、小麦の品種間で有意に異なる強度を有する特徴の検出に成功しました (図 4) 両方のイオン化モードで 500 の重要な特徴を有します。陰イオン化モードでは、重要な特徴の大部分は逆相勾配で、正イオン化モードでは、重要な特徴の大部分は脂質勾配にあった(図4)。
図 1: データのチェック、処理、およびフィルター処理にこの分析で使用されるワークフロー。ステップ1は、計測器のデータ取得/表示ソフトウェアを使用して行われ、「オンザフライ」評価を行うことができます。これには、内部標準の質量誤差(ppm)の計算と、データ再現性の視覚的評価のための内部標準ピークのオーバーレイが含まれます。ステップ 2 から 7 では、プロトコルの手順 7 で概説されているデータ処理手順について説明します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:抽出したイオンクロマトグラム抽出されたイオンクロマトグラムは13C6-ソルビトール(ダークブルー)、ロイシンエンケファリン(ピンク)、d-6-トランスシンナミン酸(オレンジ)、2-アミノアントラセン(緑色)、ミコナゾール(水色)の正(上)および陰性(下)のエレクトロスプレーイオン化(ESI)モードで内部標準。6内部標準の保持時間と強度が表示されます。ESI + および ESI -この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:負のモード(ピンク)と正のモード(青)の獲得を示す準備ブランクの総イオンクロマトグラム(TIC)オーバーレイ。一つの内部標準、ミコナゾールが示されている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:総イオンクロマトグラム(TIC)オーバーレイ、陰性モード(ピンク)と正モード(青)の取得と、クロマトグラフィー勾配全体の小麦品種間で有意に異なる特徴の数を示す。ネガティブモードでは、移動相B組成が高い場合に最も多くの重要な特徴が見つかりました。正のモードでは、移動相C組成が高い場合に最も多くの重要な特徴が見つかりました。一つの内部標準、ミコナゾールが示されている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| セグメント | 時間 | 流量 | %A | %B | %c | 曲線 |
| (分) | (mL/分) | |||||
| 1 | 初期 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 2 | 1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 3 | 7 | 0.8 | 2 | 98 | 0 | 6 |
| 4 | 7.1 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 5 | 10 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 6 | 18 | 0.4 | 0 | 10 | 90 | 6 |
| 7 | 21 | 0.4 | 0 | 2 | 98 | 6 |
| 8 | 21.1 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 9 | 24 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 10 | 24.1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 11 | 25 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
表1:移動相組成物の液体クロマトグラフィー時動計画。
| パラメーター | 内部標準 | ||||
| 13C6-ソルビトール | ロイシン・エンケファリン | d6-トランスシナミン酸 | 2-アミノアントラシン | ミコナゾール | |
| クアン m/z | 211.09 (187.09) | 556.28 (554.26) | 155.097 (153.08) | 194.1 | 414.99 |
| 質量公差 (アミュ) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 | 0.01 |
| 保持期間 | 1.2 | 4.6 | 5.1 | 6.5 | 7 |
| 保存期間 | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 | 0.1 |
| 検出タイプ | 最高 | 最高 | 最高 | 最高 | 最高 |
| 応答タイプ | 領域 | 領域 | 領域 | 領域 | 領域 |
| エリアしきい値 | 10 | 10 (50) | 10 (50) | 10 | 10 |
| 幅のしきい値 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| 高さのしきい値 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 信号対雑音比 | 5 | 5 | 3 (5) | 5 | 5 |
| スムージング | 5 | 5 (3) | 5 (3) | 5 | 5 |
表 2: 正(および負の)取得モードにおける内部標準のピーク検出パラメータ。
| 質量精度(ppm) | %RSD QC 修正前 | %RSD QC 修正後 | ||
| ネガティブモード | 13C6-ソルビトール | 4.59 | 6.12 | 7.08 |
| D6-トランスシナミン酸 | 7.94 | 3.93 | 5.99 | |
| ロイシン・エンケファリン | 0.91 | 1.8 | 1.96 | |
| ポジティブモード | 13C6-ソルビトール | 5.65 | 14.1 | 15.3 |
| ロイシン・エンケファリン | 3 | 3.24 | 5 | |
| D6-トランスシナミン酸 | 8.03 | 5.41 | 9.81 | |
| 2-アミノアントラセネ | 3.99 | 7.97 | 5.45 | |
| ミコナゾール | 1.8 | 3.01 | 5.72 | |
表3:サンプル(n=30)内部標準質量精度(ppm)およびシグナル再現性 QC補正前後の相対標準偏差(%)。
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Discussion
ここでは、小麦の分析のためのLC-MSベースの非標的メタボロミクス法を紹介する。この方法は、逆相勾配に第3移動相を導入することにより、4つの取得モード(逆相および脂質アメ有効逆相と正イオン化と正負イオン化を伴う)を2つのモードに組み合わせたものです。組み合わせアプローチは、イオン極性あたり約500の生物学的関連特徴を生み出し、その約半分は小麦品種間の強度が有意に異なった。異なる小麦品種の穀物中の代謝産物濃度の有意な変化は、変化した生化学を示し、これは穀物の品質および収量にとって重要な疾患耐性、ストレス耐性および他の表向きの形質に関連している可能性がある。例えば、メタボロミクスのアプローチは、新たな防御機構12を記述し、干ばつ許容度13における代謝産物の役割を提案するために用いられてきた。このプロトコルの将来の応用は、特定の環境および管理の実践のために望ましい遺伝的形質に特定の品種の生化学的プロファイルをさらにリンクすることができるかもしれない。これにより、選択した遺伝子型に最適な粒度と収率が得られます。
内部標準を含めることは、ユーザーが信号の変化、保持時間のシフト、質量精度の指標として決定できるようにするために、このプロトコルにとって重要です。信号の変化は、例えば、最適な抽出、注入(流体系閉塞を含む)、または検出器性能を示す。保持時間のずれは、ポンプ性能の低下、不適切な移動相勾配平衡、またはLCカラム定常相が悪化していることを示す。質量精度が低いと、キャリブレーションがドリフトし、システムに再キャリブレーションが必要であることを示すことができます。上記のいずれの場合も、システムを停止し、部品の適切なメンテナンス/交換を行う必要があります。我々は、注入前に添加された最終サンプルに穀物を調製するために使用される抽出溶液に4つの標準と標準を含めた。各イオン化モードに対して標準が適していることを確認し、保持時間の範囲をカバーするように注意が払われました。しかし、我々は、この基準配列が標識された脂質標準を含めることによって改善される可能性があることを認める。小麦粒には何百ものトリアシルグリセロール(TAG)5が含まれていることが5示されており、いずれもこのプロトコルに適した添加物となるであろう。このプロトコルでは、準備ブランクとプールされた QC サンプル8も含めることが重要なステップです。何千ものイオン特徴が非標的質量分析法で検出され、ブランクサンプルにのみ存在する、また、再現的に検出されないもの(すなわち、高い%RSD)を分析中に除外することが重要です。
現在の方法では、かなりの時間とリソースを節約できますが、第四級溶媒マネージャが利用できない場合、標準の逆相と脂質法を使用して同じ結果を得ることができます。このプロトコルで使用される抽出量は、追加の取得モードの分析に十分です。このプロトコルはアセトニトリル抽出について説明する。成功している間、代替抽出溶媒、または溶媒の組み合わせは、順番により多くの特徴を提供し、いくつかの化合物のより良い(またはより少ない)抽出効率を与える可能性があり、異なる代謝物のカバレッジを提供します。我々は、このプロトコルで解決された統計的に有意な測定値の代謝物のアイデンティティを確立しようとしていない。しかし、植物代謝物および脂質の質量スペクトルデータベースが利用可能であり5、5、14、1514,15を開発している。代謝物を特定するには、完全なスキャン データに加えて、タンデム質量スペクトル (MS/MS) を収集する必要があります。これらは、最初の実行時に、プールされたサンプルと適切なMS/MS法を使用して、または目的の代謝物が決定された後に予約された抽出物(-80 °Cで保存)に収集することができます。我々は、品種間の化合物の大きな折り畳みの変化を観察したので、我々は、最高品質のMS / MSスペクトルを得るために関心のある化合物の高濃度を含むことが知られている様々な品種を使用して、両方と第二の例の両方を行うことをお勧めします。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、西オーストラリア州首相の農業・食糧フェローシップ・プログラム(西オーストラリア州政府の雇用・観光・科学・イノベーション省)とサイモン・クック教授(センター)を認めたい。デジタル農業、カーティン大学、マードック大学)。フィールドトライアルと穀物サンプルコレクションは、西オーストラリア州の地域ロイヤリティプログラムの政府によって支援されました。グラントリー・ステイナーとロバート・フレンチがフィールドトライアルに貢献したのを認めます。NCRISが出資するバイオプラットフォームオーストラリアは、機器の資金調達で認められています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
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