Summary
Apresenta-se um método para a análise não direcionada de metabólitos e lipídios de grãos de trigo. O protocolo inclui um método de extração metabólica acetonitrila e metodologia de espectrometria de cromatografia líquida de fase invertida, com aquisição em modos positivos e negativos de ionização eletrospray.
Abstract
Compreender as interações entre genes, meio ambiente e gestão na prática agrícola poderia permitir uma previsão e gerenciamento mais precisos do rendimento e qualidade do produto. Os dados metabolômicos fornecem uma leitura dessas interações em um dado momento e são informativos do estado bioquímico de um organismo. Além disso, metabólitos individuais ou painéis de metabólitos podem ser usados como biomarcadores precisos para previsão e gerenciamento de rendimento e qualidade. Prevê-se que o metabolome da planta contenha milhares de pequenas moléculas com variadas propriedades físico-químicas que fornecem uma oportunidade para uma visão bioquímica sobre traços fisiológicos e descoberta de biomarcadores. Para explorar isso, um objetivo fundamental para os pesquisadores de metabolômica é capturar o máximo possível da diversidade físico-química em uma única análise. Aqui apresentamos um método de metabolômica de massa de cromatografia líquida à base de espectrometria para a análise de grãos de trigo cultivados em campo. O método usa o gerenciador de solventes quaternários cromatógrafo líquido para introduzir uma terceira fase móvel e combina um gradiente tradicional de fase invertida com um gradiente lipídico-passível. Preparação de grãos, extração metabólica, análise instrumental e fluxos de trabalho de processamento de dados são descritos em detalhes. Foi observada boa precisão de massa e reprodutibilidade de sinal, e o método produziu aproximadamente 500 características biologicamente relevantes por modo de ionização. Além disso, foram determinados sinais de características metabólicas e lipídicas significativamente diferentes entre as variedades de trigo.
Introduction
Compreender as interações entre genes, meio ambiente e práticas de manejo na agricultura poderia permitir uma previsão e gerenciamento mais precisos do rendimento e da qualidade do produto. Os metabólitos vegetais são influenciados por fatores como o genoma, o ambiente (clima, chuvas etc.), e em um ambiente agrícola, a forma como as culturas são gerenciadas (ou seja, aplicação de fertilizantes, fungicidas etc.). Ao contrário do genoma, o metabolome é influenciado por todos esses fatores e, portanto, os dados metabolômicos fornecem uma impressão digital bioquímica dessas interações em um determinado momento. Geralmente, há uma das duas metas para um estudo baseado em metabolômica: em primeiro lugar, obter uma compreensão mais profunda da bioquímica do organismo e ajudar a explicar o mecanismo de resposta à perturbação (estresse abiótico ou biótico) em relação à fisiologia; e, em segundo lugar, associar biomarcadores com a perturbação em estudo. Em ambos os casos, o resultado de ter esse conhecimento é uma estratégia de gestão mais precisa para alcançar o objetivo de melhorar o tamanho e a qualidade do rendimento.
Prevê-se que o metabolome da planta contenha milhares depequenas moléculas com variadas propriedades físico-químicas. Atualmente, nenhuma plataforma metabolômica (espectrometria de massa predominantemente e espectroscopia de ressonância magnética nuclear) pode capturar todo o metabolome em uma única análise. Desenvolver tais técnicas (preparação da amostra, extração e análise metabólica), que fornecem a maior cobertura possível do metabolome dentro de uma única corrida analítica, é um objetivo fundamental para os pesquisadores de metabolômica. Análises metabolômicas não direcionadas anteriores de grãos de trigo combinaram dados de múltiplas separações cromatográficas e polaridades de aquisição e/ou instrumentação para maior cobertura metabolome. No entanto, isso exigiu que as amostras fossem preparadas e adquiridas separadamente para cada modalidade. Por exemplo, Beleggia et al.2 prepararam uma amostra derivatizada para a análise de ánlytes polares gc-ms, além da análise gc-ms dos analytes não polares. Das et al.3 utilizaram métodos GC e LC-MS para melhorar a cobertura em suas análises; no entanto, essa abordagem exigiria geralmente preparações amostrais separadas como descrito acima, bem como duas plataformas analíticas independentes. Análises anteriores de grãos de trigo utilizando GC-MS3,5 2,,3,,4 e LC-MS 3 , 5 plataformas produziram 50 a 412 (55 identificados) recursos para GC-MS, 409 para GC-MS e LC-MS combinados e vários milhares para análise de lipidomia slc-MS5. Ao combinar pelo menos dois modos em uma única análise, a cobertura metabolome estendida pode ser mantida, aumentando a riqueza da interpretação biológica e, ao mesmo tempo, oferecendo economia tanto no tempo quanto no custo.
Para permitir a separação eficiente de uma ampla gama de espécies lipídicas por cromatografia de fase invertida, as metodologias de lipidomia modernas geralmente utilizam uma alta proporção de isopropanol no solvente de elução6, proporcionando amenidade às classes lipídicas que poderiam ser não resolvidas pela cromatografia. Para uma separação lipídica eficiente, a fase móvel inicial também é muito maior na composição orgânica7 do que os métodos cromatográficos de fase invertidos típicos, que consideram outras classes de moléculas. A alta composição orgânica no início do gradiente torna esses métodos menos adequados para muitas outras classes de moléculas. Mais notavelmente, a cromatografia líquida de fase invertida emprega um gradiente binário solvente, começando com uma composição principalmente aquosa e aumentando em conteúdo orgânico à medida que a força de eluição da cromatografia é aumentada. Para tanto, buscou-se combinar as duas abordagens para alcançar a separação das classes lipídicas e não lipídicas de metabólitos em uma única análise.
Aqui, apresentamos um método cromatográfico que utiliza uma terceira fase móvel e permite um método de cromatografia de fase reversa e lipidomics adequado à lipidomia usando uma única preparação de amostra e uma coluna analítica. Adotamos muitas das medidas de controle de qualidade e etapas de filtragem de dados que já foram implementadas em estudos de metabolômica predominantemente clínica. Essas abordagens são úteis na determinação de características robustas com alta reprodutibilidade técnica e relevância biológica e excluem aquelas que não atendem a esses critérios. Por exemplo, descrevemos a repetição da amostra de QC agrupada8, correção QC9, filtragem de dados9,,10 e imputação de recursos ausentes11.
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Protocol
Este método é apropriado para 30 amostras (aproximadamente 150 sementes por amostra). Três réplicas biológicas de dez variedades diferentes de trigo cultivados em campo foram usadas aqui.
1. Preparação de grãos
- Recuperar amostras (grãos integrais) de -80 °C de armazenamento.
NOTA: A secagem congelante das sementes é recomendada logo após a colheita se as amostras estiverem sendo coletadas em várias estações. Isso minimiza quaisquer alterações na concentração metabólica que possam ocorrer após períodos variados de armazenamento. Para isso, transfira as sementes para um tubo de centrífuga de plástico de 15 mL (aproximadamente 300 sementes encherão o tubo) e cubra com papel alumínio. Fure a folha duas ou três vezes usando um pino e congele seque os grãos inteiros durante a noite (aproximadamente 24 h). As amostras podem ser devolvidas ao congelador -80 °C nesta fase ou a próxima etapa pode ser realizada. - Moa as sementes usando um liquidificador de laboratório para duas corridas em modo alto por 20 s.
NOTA: O liquidificador utilizado para este protocolo requer um mínimo de aproximadamente 150 sementes para encher o liquidificador até a altura da lâmina e dar uma amostra de grãos relativamente homogêneamente moída. - Retire o liquidificador da base e bata na lateral do liquidificador para levar qualquer grão moído grosseiramente para a superfície da amostra. O material grosso pode ser descartado ou armazenado.
- Transfira o material moído finamente em pó do liquidificador para um tubo de microcentrífuga de plástico de 2 mL.
NOTA: Lave o liquidificador com água desionizada e enxágue com MeOH de grau LC-MS entre as amostras. Certifique-se de que o liquidificador está completamente seco antes de seguir para a próxima amostra. - Devolva amostras finamente moídas de grãos ao congelador ou prossiga para o próximo passo (extração metabólica).
2. Preparação do solvente de extração
NOTA: Prepare solvente de extração no mesmo dia da realização das extrações.
- Prepare pelo menos 2 mL de 1 mg/mL de cada padrão. Use acetonitrilo (ACN) para preparar 2-aminoantracene, miconazol e d6-ácido transcinnêmico. Use água para preparar 13C6-sorbitol.
- Pegue 2 mL de cada padrão de 1 mg/mL e adicione a um frasco volumétrica de 100 mL.
- Encha o frasco volumétrica na linha com acetonitrilo. Certifique-se de que 100 mL de acetonitrilo contenha 20 μg/mL de cada um dos padrões internos: 2-aminoanthracene, miconazol, 13C6-sorbitol, d6-ácido transcinnêmico.
3. Extração metabólica
- Pesar 200 mg de grão finamente moído em um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
- Adicione 500 μL de solvente de extração a 200 mg sinuoso de amostra de grãos finamente moídas.
- Misture usando um homogeneizador para 2 corridas de 20 s a 6.500 rpm.
- Centrífuga a 4 °C por 5 min a 16.100 x g.
- Transfira o sobrenadante para um tubo de plástico de 2 mL.
- Repita este procedimento das etapas 3.1 a 3.5 duas vezes mais para dar um volume sobrenadante total de aproximadamente 1,5 mL.
- Vórtice para misturar o supernadante.
- Transfira um volume igual (55 μL) de cada extrato para um tubo separado de 2 mL para fazer uma amostra de extrato de grão agrupado.
- Transfira uma alíquota de 50 μL do extrato para um frasco de vidro.
NOTA: Os extratos podem ser congelados (-80 °C) neste ponto ou seguir para o próximo passo e seguir para a análise lc-ms.
4. Preparação de soluções para análise de LC-MS
ATENÇÃO: Para o ácido concentrado, adicione sempre ácido à água/solvente.
- Prepare 50 mL de 1 M solução de estoque de formato de amônio. Pesar 3.153 g de formato de amônio e transferir para um frasco volumétrica de 50 mL. Encha o frasco volumétrica para a linha com LC-MS grau H2O.
- Prepare 1 L da fase Móvel A composta por 10 mM de formato de amônio, 0,1% de ácido fórmico. Para isso, adicione aproximadamente 500 mL de água de grau LC-MS a um frasco volumétrica de 1 L. Adicione 10 mL de 1 M de caldo de formato de amônio e 1 mL de ácido fórmico. Encha o frasco volumétrica para a linha com LC-MS grau H2O. Transfira para uma garrafa de 1 L e sônica por 15 min para degas.
- Preparar 1 L da fase Móvel B consistindo de 10 mM de formato de amônio em 79:20:1 acetonitrile:álcool isopropílico:água, 0,1% razão de ácido fórmico. Adicione 200 mL de isopropanol a um frasco volumétrica de 1 L. Adicione 10 mL de 1 M de caldo de formato de amônio e 1 mL de ácido fórmico. Encha o frasco volumétrica na linha com acetonitrilo. Transfira para uma garrafa de 1 L e sônica por 15 min para degas.
NOTA: Diluir o formato de amônio de 1 M no álcool isopropílico (IPA) antes de adicionar a ACN. O formato de amônio é insolúvel em CAN. - Preparar 1 L da fase Móvel C consistindo de 10 mM de formatação de amônio na proporção de 89:10:1 álcool isopropílico:acetonitrilo:água. Para isso, adicione aproximadamente 500 mL de isopropanol, 10 mL de 1 M de amônio e 100 mL de acetonitrilo a um frasco volumétrica de 1 L. Preencha a linha com isopropanol. Transfira para uma garrafa de 1 L e sônica por 15 min para degas.
- Preparação de solventes de lavagem do sistema LC-MS
- Substitua a solução de lavagem da cabeça da bomba por uma solução nova. Use 50% de metanol, 10% de álcool isopropílico ou outro, conforme recomendado pelo fabricante.
- Prepare soluções fortes e fracas de lavagem da agulha para lavar os fluidos de injeção antes e depois da injeção da amostra. Para a lavagem forte, adicione volumes iguais de ACN e IPA. Para a lavagem fraca, prepare uma solução de 10% de ACN (exigindo aproximadamente 500 mL e 1 L de cada uma das laveiras fortes e fracas, respectivamente, para este protocolo e número de amostras) em garrafas separadas.
- Ajuste os volumes de lavagem da agulha para 600 μL e 1800 μL para as lavantes fortes e fracas, respectivamente.
5. Preparação de amostras para análise de LC-MS
- De acordo com o procedimento operacional padrão dos fabricantes para a preparação de enkephalin a leucina de 400 ng/μL, pipeta 7,5 mL de água no frasco de leucina-enkephalin a 12 mL contendo 3 mg de leucina-enkephalin. Congele a -80 °C em alíquotas de 50 μL.
- Preparar 100 mL de 5% de ACN contendo 200 ng/mL de leucina-enkephalin (50 μL de 400 ng/μL de leucina enkephalin). Prepare-se no mesmo dia da análise lc-MS.
- Adicione 950 μL de 5% de acetonitrila contendo a injeção padrão de leucina-enkephalin a alíquota de amostra de 50 μL preparada a partir do passo 3.
- Vórtice para misturar a amostra preparada.
6. Configuração LC-MS
NOTA: Uma descrição detalhada da configuração do método de aquisição e de instrumentos está descrita no guia do usuário do fabricante. Um guia geral e os detalhes específicos deste protocolo são descritos abaixo. As seguintes etapas podem ser concluídas a qualquer momento antes da aquisição dos dados.
- Abra um perfil de hardware LC-MS.
- Configure o método cromatográfico conforme descrito na Tabela 1. Certifique-se de que o sistema LC está equipado com um gerenciador de solventes quaternários para configurar este gradiente.
NOTA: IpA é um solvente viscoso. Deve ser introduzido a uma taxa de fluxo baixa e um tempo de equilíbrio suficiente deve ser usado antes de aumentar a composição para 98,0%. Estas etapas evitarão que o sistema LC seja sobrecarregado e pare. - Configure os métodos de aquisição de espectrômetros de massa para cada um dos modos ToF-MS positivos e negativos sobre a faixa m/z 50-1.300.
NOTA: O instrumento utilizado para o trabalho aqui apresentado requer métodos positivos e negativos para serem calibrados e executados individualmente (ou seja, a troca de polaridade dentro de um método não é possível). - Se a coluna LC for nova, condicione a coluna de acordo com a recomendação do fabricante.
NOTA: As seguintes etapas devem ser concluídas diretamente antes da aquisição dos dados. - Em um perfil de hardware 'somente MS', calibre o espectrômetro de massa de acordo com as recomendações do fabricante. Complete esta etapa antes de cada modo de aquisição, garantindo que o sistema tenha estabilizado em cada modalidade antes da calibração.
- Expurgar e lavar o sistema fluido LC usando solventes de grau LC-MS, incluindo solventes de fase móvel e lavagem.
- Equilibre o sistema LC utilizando as condições de partida do método LC, garantindo que a pressão da coluna tenha estabilizado.
- Injete formatado de sódio (0,5 mM em 90% IPA) no início da seqüência amostral (descrito abaixo) para verificar a calibração do instrumento.
- Configurar a tabela de seqüência de instrumentos para que os espaços em branco preparatórios e (extração) de solventes sejam analisados primeiro; seguido por amostras de QC agrupadas (6-10) para condicionamento do sistema; em seguida, a lista de amostras aleatórias com amostras de QC são executadas em intervalos regulares (por exemplo, a cada quinta injeção) como réplicas técnicas. Execute duas amostras QC no final da seqüência.
NOTA: É útil incluir a data e a ordem de injeção/aquisição no nome do arquivo da amostra, bem como o ID da amostra. Por exemplo: YyyY MMDD_Injection number_Variety_Biological replicar. Antes de pressionar o início, certifique-se de que a pressão da coluna LC está estável e que a LC está conectada ao MS.
7. Processamento de dados
NOTA: Um fluxo de trabalho geral de processamento de dados é apresentado na Figura 1.
- Verifique a qualidade dos dados (precisão de massa padrão interna (cálculo abaixo) e reprodutibilidade do sinal) enquanto a seqüência estiver em execução. Para verificar a reprodutibilidade do sinal, a inspeção visual dos espectros sobrepostos deve ser suficiente.
NOTA: Erro de massa (ppm) = ((Massa teórica – massa medida) / massa teórica) x 106 - Gerar uma matriz de intensidade de pico alinhada contendo amostras x padrões internos (alinhados pelo tempo de retenção e valores m/z).
- Abra o software de processamento de dados (ver Tabela de Materiais). Em Home > Open,clique em Data. Navegue até o local de arquivo apropriado e abra todos os arquivos de dados.
- Em Home > Sequence > Tipo de processamento, selecione Quantitação no menu suspenso.
- Em Home > Method > Quan,clique em Calibração Components. Preencha cada campo usando os detalhes fornecidos na Tabela 2. Clique em OK.
- No painel esquerdo nas colunas ao lado dos arquivos de dados, preencha o tipo de amostra clicando com o botão direito na célula e selecionando Desconhecido. Preencha o nível como n/a.
- Em Home > Processamento,selecione Seqüência. Escolha um local para salvar a seqüência e clique em Processar.
- Em Home > Resultados,selecione Quan. Do visualizador Quan, selecione Exportar executa para analisador de matriz.
- Do visualizador de resultados do analisador de matriz, clique em Exportar para csv. Salve o arquivo como um arquivo de planilha.
- No software de planilha, calcule a média, desvio padrão e desvio padrão relativo da intensidade (área de pico) de cada padrão interno.
- Gerar uma matriz de intensidade de pico alinhada contendo amostras x recursos não direcionados (alinhados pelo tempo de retenção e valores de m/z).
- Abra o software de análise de descoberta de pequenas moléculas (ver Tabela de Materiais) e selecione File > Novo para criar um novo experimento. Nomeie o experimento e escolha o local para salvar e armazenar arquivos de experimentos. Clique em Next.
- Selecione o tipo de instrumento utilizado (espectrômetro de massa de alta resolução), o formato dos dados (perfil) e a polaridade (positiva ou negativa). Clique em Next. Selecione todos os adutos disponíveis na biblioteca e edite a biblioteca de adutos conforme necessário. Clique em Criar experimentos. Uma nova página será carregada onde o resto do processamento de dados continuará/ocorrerá.
- Importar arquivos de dados. Selecione o formato do arquivo e selecione a importação. Navegue até a localização dos dados e selecione os arquivos de dados a serem importados. O progresso será mostrado para cada arquivo no painel esquerdo da página.
- Uma vez que os arquivos de dados sejam importados, selecione Iniciar o processamento automático. Escolha um método para selecionar uma referência de alinhamento. Deixe que o software avalie todas as corridas para adequação, dê uma lista de amostras adequadas (ou seja, amostras de QC) ou escolha a referência mais adequada, ou seja, uma amostra de QC de seqüência média. Selecione Sim, alinhe automaticamente minhas corridas > Next.
- Selecione Next na página de design do experimento (isso pode ser configurado mais tarde).
- Selecione Executar a escolha de pico e, em seguida, definir parâmetros. Na guia Limites de captação de pico, selecione Intensidade de Íon Absoluto e digite 100. Selecione aplicar uma largura mínima de pico e digite 0,01 min. Selecione OK > Acabamento. Quando o processamento estiver concluído, selecione Fechar.
NOTA: Os limites de seleção de pico podem ser otimizados para outros tipos de arquivos de dados, conforme necessário. - No canto inferior direito da tela, selecione Seção Completa. Revise as corridas alinhadas e certifique-se de que cada amostra esteja alinhada à referência. Os escores de alinhamento foram de >90% para os dados aqui apresentados. Selecionar seção completa.
- Na página seguinte, selecione entre o design do assunto. Diga o nome do projeto. Selecione Grupo que executa manualmente e crie design. Adicione condição, clique em Condição 1 e nomeie o grupo apropriadamente. Clique em Seção Completa.
NOTA: Continue a adicionar condições conforme apropriado para usar estatísticas dentro do software. Como só usamos o software para gerar uma matriz não direcionada, usamos uma única condição rotulada como "tudo". - Na página seguinte, selecione Seção Completa. Não refaça a colheita de pico.
- Revise a desconvolução e clique em Seção Completa.
- Vá para File > Export Compound Measurements. Desmarque todas as propriedades não desejadas na saída. Clique em OK. Escolha um local para salvar o arquivo .csv. Clique em Salvar > Abrir arquivo > Abrir pasta ou fechar.
- Filtre os dados usando os espaços em branco de extração para remover artefatos (software de planilha).
- Para cada recurso RT x m/z, em uma nova coluna, calcule a resposta média em espaços em branco de extração.
- Para cada recurso RT x m/z, calcule a resposta média em todas as outras amostras (incluindo amostras de QC).
- Calcular a intensidade de pico % dos espaços em branco nas amostras (resposta média em branco/resposta média nas amostras x 100).
- Classifique a coluna de contribuição percentual dos valores mais baixos para os mais altos.
- Remova características que tenham >5% de contribuição de intensidade de espaços em branco.
- Filtre os valores ausentes e corrija os sinais de recurso para sinais em amostras de QC agrupadas.
- Abra o software de processamento de dados(Tabela de Materiais). Clique no botão Exibir MatrixAnalyzer. Clique no botão Abrir arquivo de dados.
- Navegue até o local do arquivo .csv contendo a intensidade máxima dos recursos RT x m/z para cada amostra (matriz não direcionada). Selecione Abrir.
- Na guia amostras QC, preencha cada parâmetro conforme necessário. Para o conjunto de dados descrito aqui, use categoria QC=QC, ignore categorias=empty, impute type=none, coverage threshold=80, scale using=no scaling, uncheck log transform, correct using=smoothing spline, smoothing=0.25.
- No canto superior direito do painel matriz, clique no botão de reprodução correção QC.
- Depois que a correção for realizada no canto superior direito do painel matriz, clique em Salvar resultados. Navegue até um local apropriado e salve o arquivo de resultados .csv.
- Filtre os dados para remover recursos que tenham >20% RSD em amostras de QC.
- Organize os dados para que as amostras estejam em linhas e os recursos estejam em colunas.
- Em uma nova coluna, calcule a intensidade média de pico para amostras de QC.
- Em uma nova coluna, calcule o desvio padrão da intensidade de pico para amostras de QC.
- Calcular o desvio padrão relativo da intensidade de pico para amostras de QC: (desvio padrão QC/média QC) x 100.
- Classifique os recursos do mais baixo para o mais alto %RSD e remova recursos que tenham um QC RSD >20%.
- Filtrar os dados para remover recursos com baixas proporçõesde amostraRSD /RSDQC (por exemplo, <1).
- Em uma nova coluna, calcule a intensidade média de pico das amostras.
- Em uma nova coluna, calcule o desvio padrão da intensidade de pico para amostras.
- Calcular o desvio padrão relativo da intensidade de pico das amostras: (desvio padrão da amostra/média da amostra) x 100.
- Em uma nova coluna, divida as amostras RSD pelo QC RSD.
- Classifique os valores(proporçõesRSD sample /RSDQC) do mais alto para o mais baixo e remova os recursos com uma razão <1.
- Impute valores ausentes (vários métodos disponíveis on-line).
- Formatar a planilha para que as amostras estejam em linhas e recursos estejam em colunas. A primeira coluna deve ser o nome do arquivo das amostras. Crie uma coluna adicional ao lado dos nomes dos arquivos e digite os agrupamentos de amostras. Neste caso, as amostras foram agrupadas por variedade.
- Salve a planilha como um arquivo .csv.
- Acesse a página inicial do pipeline analítico baseado na Web para metabolômica de alto desempenho (ver Tabela de Materiais) e clique em Aqui para iniciar.
- Clique em Análise Estatística. Em Upload Your Data, selecione Tipo de dados: tabela de intensidade máxima, Formato: Amostras em linhas (sem emparelhamento) e, em seguida, Escolha Arquivo.
- Navegue até o arquivo .csv, selecione Abrir e, em seguida, selecione Enviar.
- Na página seguinte, selecione Estimativa de Valor Perdido. Desmarcar a etapa 1 (isso foi realizado no AnalyzerPro XD). Na etapa 2, escolha um método para estimar valores faltantes.
NOTA: Para os dados aqui apresentados - foi selecionado 'estimar valores faltantes' com 'KNN'. - Nesta fase, a matriz de dados pode ser baixada (selecione Download no painel esquerdo da página web) ou proceder à realização de novas análises estatísticas.
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Representative Results
O metabolome vegetal é influenciado por uma combinação de seu genoma e ambiente, e adicionalmente em um ambiente agrícola, o regime de manejo de culturas. Demonstramos que as diferenças genéticas entre as variedades de trigo podem ser observadas no nível metabólito, aqui, com mais de 500 compostos medidos mostrando concentrações significativamente diferentes entre as variedades apenas no grão. Boa precisão de massa (<10 ppm erro) e reprodutibilidade de sinal (<20% RSD) das normas internas(Figura 2) foram observadas para os modos de ionização negativa e positiva(Tabela 3). A preparação da amostra descrita e a análise baseada em espectrometria de massa de cromatografia líquida produziram recursos desconvoluted de >900 no modo de ionização negativa e recursos desconvoluted >1300 no modo de ionização positiva. Foram incluídos espaços em branco preparatórios(Figura 3)para determinar se os métodos de preparação e análise da amostra introduziram características de artefato e, portanto, todas as influências não biológicas eliminadas da matriz de dados. Verificou-se que 421 sinais no modo negativo e 835 sinais no modo positivo tinham intensidades de sinal iguais ou superiores a 5% da intensidade média do sinal em amostras de grãos. Esses recursos foram removidos e após novas etapas de filtragem de dados (etapa 7 e Figura 1),o modo negativo retornou 483 recursos e o modo positivo retornou 523 recursos, formando o instantâneo metabólico. O método foi bem sucedido na detecção de características, que tinham intensidades significativamente diferentes entre as variedades de trigo (Figura 4) com características significativas em ambos os modos de ionização. No modo de ionização negativa, a maioria das características significativas foram no gradiente de fase invertida e no modo de ionização positiva, a maioria das características significativas foram no gradiente lipídico(Figura 4).
Figura 1: O fluxo de trabalho utilizado nesta análise para verificação, processamento e filtragem de dados. A etapa 1 é conduzida usando o software de aquisição/visualização de dados no instrumento para que as avaliações "on-the-fly" possam ser realizadas. Isso inclui o cálculo do erro de massa (ppm) das normas internas e a sobreposição de picos padrão internos para avaliação visual da reprodutibilidade dos dados. As etapas 2-7 descrevem o procedimento de processamento de dados descrito no protocolo, etapa 7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cromatogramas de íons extraídos. Cromatogramas de íons extraídos de 13C6-sorbitol (azul escuro), leucina-enkephalin (rosa), d6-ácido trans-cinâmico (laranja), 2-aminoanthracene (verde) e miconazol (azul claro) nos modos positivo (superior) e negativo (inferior) de ionização eletrospray (ESI). Os tempos e intensidades de retenção padrão internos são mostrados. ESI + e ESI - Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Sobreposição total de cromatograma de íons (TIC) de espaços em branco preparatórios mostrando aquisições de modo negativo (rosa) e modo positivo (azul). Um padrão interno, miconazol, é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Sobreposição total de cromatograma de íons (TIC), mostrando aquisições de modo negativo (rosa) e modo positivo (azul) e número de características significativamente diferentes entre a variedade de trigo através do gradiente cromatográfico. No modo negativo, o maior número de características significativas foi encontrado quando a composição da fase B móvel era alta. No modo positivo, o maior número de características significativas foi encontrado quando a composição da fase C móvel era alta. Um padrão interno, miconazol, é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Segmento | Tempo | Vazão | %A | %B | %C | Curva |
| (min) | (mL/min) | |||||
| 1 | Inicial | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 2 | 1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 3 | 7 | 0.8 | 2 | 98 | 0 | 6 |
| 4 | 7.1 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 5 | 10 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 6 | 18 | 0.4 | 0 | 10 | 90 | 6 |
| 7 | 21 | 0.4 | 0 | 2 | 98 | 6 |
| 8 | 21.1 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 9 | 24 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 10 | 24.1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 11 | 25 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
Tabela 1: Programa cronometrado de cromatografia líquida de composições de fase móvel.
| Parâmetro | Padrão interno | ||||
| 13 C6-sorbitol | Leucina-enkefina | d6-ácido transcinâmico | 2-amino-anthracene | Miconazol | |
| Quan m/z | 211.09 (187.09) | 556.28 (554.26) | 155.097 (153.08) | 194.1 | 414.99 |
| Tolerância em massa (amu) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 | 0.01 |
| Tempo de retenção | 1.2 | 4.6 | 5.1 | 6.5 | 7 |
| Janela de tempo de retenção | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 | 0.1 |
| Tipo de detecção | Maior | Maior | Maior | Maior | Maior |
| Tipo de resposta | Área | Área | Área | Área | Área |
| Limiar de área | 10 | 10 (50) | 10 (50) | 10 | 10 |
| Limiar de largura | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| Limiar de altura | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Relação sinal-ruído | 5 | 5 | 3 (5) | 5 | 5 |
| Suavização | 5 | 5 (3) | 5 (3) | 5 | 5 |
Tabela 2: Parâmetros de detecção de pico para padrões internos nos modos de aquisição positivo (e negativo).
| Precisão de massa (ppm) | %RSD antes da correção do QC | %RSD após correção de QC | ||
| Modo negativo | 13 C6-sorbitol | 4.59 | 6.12 | 7.08 |
| D6-ácido transcinâmico | 7.94 | 3.93 | 5.99 | |
| Leucina-enkefina | 0.91 | 1.8 | 1.96 | |
| Modo positivo | 13 C6-sorbitol | 5.65 | 14.1 | 15.3 |
| Leucina-enkefina | 3 | 3.24 | 5 | |
| D6-ácido transcinâmico | 8.03 | 5.41 | 9.81 | |
| 2-aminoanthracene | 3.99 | 7.97 | 5.45 | |
| Miconazol | 1.8 | 3.01 | 5.72 | |
Tabela 3: Amostra (n=30) precisão de massa padrão interna (ppm) e reprodutibilidade de sinal antes e depois da correção do QC expressa em desvio padrão relativo (%).
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Discussion
Aqui, apresentamos um método de metabolômica não direcionado à base de LC-MS para a análise de grãos de trigo. O método combina quatro modos de aquisição (fase invertida e fase invertida com ionização positiva e negativa) em dois modos, introduzindo uma terceira fase móvel no gradiente de fase invertida. A abordagem combinada produziu aproximadamente 500 características biologicamente relevantes por polaridade de íons, com cerca de metade dessas significativamente diferentes em intensidade entre as variedades de trigo. Mudanças significativas na concentração metabólica no grão de diferentes variedades de trigo indicam bioquímica alterada, que pode estar ligada à resistência à doença, tolerância ao estresse e outros traços ofotípicos importantes para a qualidade e rendimento dos grãos. Por exemplo, abordagens metabolômicas têm sido utilizadas para descrever novos mecanismos de defesa12 e propor o papel dos metabólitos na tolerância à seca13. Aplicações futuras deste protocolo podem ser capazes de vincular perfis bioquímicos de determinadas variedades a características genéticas que são desejáveis para determinados ambientes e práticas de manejo. Por sua vez, isso permitiria a produção de qualidade e rendimento de grãos ideais para genótipos selecionados.
A inclusão de normas internas é fundamental para este protocolo para permitir que o usuário determine mudanças no sinal, mudanças de tempo de retenção e como indicadores de precisão de massa. Alterações no sinal podem indicar, por exemplo, extração sub ideal, injeção (incluindo bloqueios do sistema fluido) ou desempenho do detector. Mudanças de tempo de retenção podem indicar mau desempenho da bomba, equilíbrio inadequado do gradiente da fase móvel ou que a fase estacionária da coluna LC se deteriorou. A baixa precisão de massa pode ser indicativa de uma calibração à deriva e que o sistema requer recalibração. Em todos os casos acima, o sistema deve ser interrompido e a manutenção/substituição adequada das peças realizadas. Incluímos quatro padrões na solução de extração utilizada para preparar grãos e um padrão na amostra final adicionada antes da injeção. Foi tomado cuidado para garantir que as normas fossem favoráveis a cada modo de ionização e cobrissem uma série de tempos de retenção; no entanto, reconhecemos que essa matriz de normas poderia ser melhorada com a inclusão de um padrão lipídico rotulado. Foi demonstrado que o grão de trigo contém centenas de tríaglicelos (TAGs)5, qualquer um dos quais seria uma adição adequada a este protocolo. A inclusão de espaços em branco preparatórios e amostras de QC agrupadas8 também são etapas críticas neste protocolo. Milhares de características de íons são detectadas em métodos de espectrometria de massa não direcionados e é importante excluir aqueles que estão presentes apenas em amostras em branco e também aqueles que não são detectados reprodutivelmente (ou seja, %RSD elevado) ao longo da análise.
Embora o método atual economize tempo e recursos consideráveis, se um gerente de solvente quaternário não estiver disponível, métodos padrão invertidos e lipídicos podem ser usados para alcançar os mesmos resultados. O volume de extração utilizado neste protocolo seria suficiente para a análise de modos adicionais de aquisição. Este protocolo descreve uma extração de acetonitrilo. Embora bem-sucedido, um solvente de extração alternativo, ou combinação de solventes, fornecerá uma cobertura metabólica diferente, que por sua vez pode fornecer mais recursos e/ou dar melhor (ou uma menor) eficiência de extração de alguns compostos. Não tentamos estabelecer a identidade metabólica das medidas estatisticamente significativas resolvidas neste protocolo; no entanto, as bases de dados espectrais de massa para metabólitos e lipídios vegetais estão disponíveis e desenvolvendo5,14,15. Para identificar os metabólitos, os espectros de massa tandem (MS/MS) precisariam ser coletados, além dos dados completos de varredura. Estes podem ser coletados durante a execução inicial usando amostras agrupadas e um método ms/ms apropriado ou em extrato reservado (armazenado a -80 °C) uma vez que os metabólitos de interesse tenham sido determinados. Observamos grandes mudanças dobradas de compostos entre as variedades, por isso recomendamos fazer ambos e na segunda instância, utilizando uma variedade conhecida por conter uma alta concentração do composto de interesse para obter o espectro MS/MS de maior qualidade.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer o programa de Bolsas de Agricultura e Alimentação do Primeiro-Ministro da Austrália Ocidental (Departamento de Empregos, Turismo, Ciência e Inovação, Governo da Austrália Ocidental) e o Primeiro-Ministro, professor Simon Cook (Centro para Agricultura Digital, Universidade de Curtin e Universidade Murdoch). Os ensaios de campo e a coleta de amostras de grãos foram apoiados pelo governo do programa Royalties for Regions da Austrália Ocidental. Reconhecemos Grantley Stainer e Robert French por suas contribuições para testes de campo. As Bioplataformas da Austrália, financiadas pelo NCRIS, são reconhecidas pelo financiamento de equipamentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
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