Summary
Buğday tanemetabolitleri ve lipitlerinin hedeflenmemiş analizi için bir yöntem sunulmuştur. Protokol, pozitif ve negatif elektrosprey iyonizasyon modlarında edinim ile bir asetonnril metabolit çıkarma yöntemi ve ters faz sıvı kromatografi-kütle spektrometresi metodolojisi içerir.
Abstract
Tarım uygulamalarında genler, çevre ve yönetim arasındaki etkileşimlerin anlaşılması, ürün verimi ve kalitesinin daha doğru tahmin ve yönetimine olanak sağlayabilir. Metabolomik veriler, bu etkileşimlerin belirli bir anda okunmasını sağlar ve bir organizmanın biyokimyasal durumu hakkında bilgilendiricidir. Ayrıca, bireysel metabolitler veya metabolitlerin panelleri verim ve kalite tahmini ve yönetimi için hassas biyobelirteçler olarak kullanılabilir. Bitki metabolom fizyolojik özellikleri ve biyomarker keşif içine bir biyokimyasal anlayış için bir fırsat sağlamak çeşitli fizyokimyasal özelliklere sahip küçük moleküllerin binlerce içerdiği tahmin edilir. Bunu kullanmak için, metabolomik araştırmacılar için önemli bir amaç tek bir analiz içinde mümkün olduğunca çok fizikokimyasal çeşitliliğin yakalamaktır. Burada tarlada yetişen buğday tanesinin analizi için sıvı kromatografi-kütle spektrometresi tabanlı hedefsiz metabolomik bir yöntem salıyoruz. Yöntem üçüncü bir mobil faz tanıtmak için sıvı kromatografi quaternary solvent yöneticisi kullanır ve bir lipid-münakaşa gradyanı ile geleneksel ters faz gradyanı birleştirir. Tane hazırlama, metabolit ekstraksiyonu, enstrümantal analiz ve veri işleme iş akışları ayrıntılı olarak açıklanmıştır. İyi kütle doğruluğu ve sinyal tekrarlanabilirliği gözlendi ve yöntemiyonizasyon modu başına biyolojik olarak yaklaşık 500 özellik verdi. Ayrıca buğday çeşitleri arasında anlamlı olarak farklı metabolit ve lipid özelliği sinyalleri belirlendi.
Introduction
Tarımda genler, çevre ve yönetim uygulamaları arasındaki etkileşimlerin anlaşılması, ürün verimi ve kalitesinin daha doğru tahmin ve yönetimine olanak sağlayabilir. Bitki metabolitleri genom, çevre (iklim, yağış vb.) gibi faktörlerden ve tarım ortamında, bitkilerin yönetilme şeklinden (örneğin, gübre, mantar ilacı vb.) etkilenir. Genomun aksine, metabolom tüm bu faktörlerden etkilenir ve bu nedenle metabolomik veriler bu etkileşimlerin belirli bir zamanda biyokimyasal parmak izini sağlar. Metabolomik temelli bir çalışmanın iki amacından biri vardır: birincisi, organizmanın biyokimyasını daha iyi anlamak ve fizyolojiye göre tedirginlik (abiyotik veya biyotik stres) yanıt mekanizmasını açıklamaya yardımcı olmak; ve ikincisi, biyobelirteçleri çalışma altındaki tedirginlikle ilişkilendirmek. Her iki durumda da, bu bilgiye sahip olmanın sonucu, geliştirilmiş verim büyüklüğü ve kalitesi hedefine ulaşmak için daha hassas bir yönetim stratejisidir.
Bitki metabolom çeşitli fizyokimyasal özelliklere sahip küçük moleküllerin binlerce1 içerdiği tahmin edilir. Şu anda, hiçbir metabolomik platformlar (ağırlıklı olarak kütle spektrometresi ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi) tek bir analizde tüm metabolom yakalayabilir. Metabolomun tek bir analitik çalışma içinde mümkün olduğunca geniş bir kapsama alanı sağlayan bu tür tekniklerin (numune hazırlama, metabolit ekstraksiyonu ve analizi) geliştirilmesi, metabolomik araştırmacılar için önemli bir amaçtır. Buğday tanesinin önceki hedeflenmemiş metabolomik analizleri, birden fazla kromatografik ayrım ve edinim kutuplarından elde edilen verileri birleştirmiş ve/veya daha fazla metabolom kapsama alanı için enstrümantasyon almıştır. Ancak, bu örneklerin her modalite için ayrı ayrı hazırlanması ve elde edilmesi gerekmektedir. Örneğin, Beleggia ve ark.2 polar analitlerin GC-MS analizi için türev leştirilmiş bir örnek hazırladı. Das ve ark.3 analizlerinde kapsama alanını iyileştirmek için hem GC hem de LC-MS yöntemlerini kullanmaktadır; ancak, bu yaklaşım genellikle yukarıda açıklandığı gibi ayrı örnek hazırlıkları yanı sıra iki bağımsız analitik platformlar gerektirir. GC-MS2,3,3,4 ve LC-MS3kullanarakbuğday tanelerinin önceki analizleri,GC-MS için 50 ila 412 (55 tanımlı) özellik, kombine GC-MS ve LC-MS için 409 ve LC-MS lipidomik analizi için birkaç bin adet ilerler.5 Tek bir analiz de en az iki mod birleştirerek, genişletilmiş metabolom kapsama sağlanabilir, biyolojik yorumlama zenginliğini artırırken aynı zamanda hem zaman hem de maliyet tasarrufu sunan.
Tersine faz kromatografisi ile lipid türlerinin geniş bir yelpazede verimli ayrılmasına izin vermek için, modern lipidomics metodolojileri genellikle elüsülasyon solvent yüksek oranda izopropanol kullanın6, aksi takdirde kromatografi tarafından çözülmemiş olabilir lipid sınıfları için olanaklar sağlayan. Verimli bir lipid ayrıştırma için, başlangıç mobil faz da çok organik kompozisyondaha yüksektir 7 tipik ters faz kromatografik yöntemler, hangi moleküllerin diğer sınıfları dikkate. Degradenin başlangıcındaki yüksek organik bileşim, bu yöntemleri diğer moleküllerin sınıflarına daha az uygun hale getirir. En önemlisi, ters faz sıvı kromatografisi, çoğunlukla sulu bir bileşimle başlayan ve kromatografinin elüsyon mukavemeti arttıkça organik içerikte artan ikili bir çözücü degradesi kullanır. Bu amaçla, metabolitlerin hem lipid hem de lipid olmayan sınıflarının ayrılmasını tek bir analizde elde etmek için iki yaklaşımı birleştirmeye çalıştık.
Burada, üçüncü bir mobil faz kullanan ve tek bir örnek hazırlama ve bir analitik kolon kullanarak kombine geleneksel ters faz ve lipidomics-uygun kromatografi yöntemi sağlayan bir kromatografik yöntem salıyoruz. Daha önce ağırlıklı olarak klinik metabolomik çalışmalarda uygulanan kalite kontrol önlemleri ve veri filtreleme adımlarının çoğunu benimsedik. Bu yaklaşımlar, yüksek teknik tekrarlanabilirlik ve biyolojik önemi olan sağlam özellikleri belirlemede yararlıdır ve bu kriterleri karşılamayanları hariç tutar. Örneğin, havuzlu QC örnek8,QC düzeltme9,veri filtreleme9,10 ve eksik özellikleri nputasyon tekrar analizi açıklar11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu yöntem 30 numune (numune başına yaklaşık 150 tohum) için uygundur. Burada on farklı tarlada yetişen buğday çeşidinin üç biyolojik kopyaları kullanılmıştır.
1. Tahılların hazırlanması
- -80 °C depolamadan numune (tam taneler) alın.
NOT: Numuneler birden fazla mevsimden toplanıyorsa, tohumların hasattan kısa bir süre sonra dondurulması önerilir. Bu depolama değişen dönemlerden sonra oluşabilir metabolit konsantrasyonu herhangi bir değişiklik en aza indirir. Bunu yapmak için, 15 mL plastik santrifüj tüp (yaklaşık 300 tohum tüp dolduracak) ve alüminyum folyo ile kapsayacak tohum transferi. Bir iğne kullanarak folyo iki-üç kez delin ve bir gecede (yaklaşık 24 saat) tüm taneleri kuru dondurma. Numuneler bu aşamada -80 °C'lik dondurucuya geri döndürülebilir veya bir sonraki adım yapılabilir. - 20 s için yüksek modda iki çalışır için bir laboratuvar blender kullanarak tohumları grind.
NOT: Bu protokol için kullanılan blender bıçak yüksekliğine blender doldurmak ve nispeten homojen zemin tane örneği vermek için yaklaşık 150 tohum en az gerektirir. - Blender'ı tabandan çıkarın ve numunenin yüzeyine kaba öğütülmüş taneleri getirmek için blender'ın yan tarafına dokunun. Kaba malzeme atılabilir veya saklanabilir.
- Toz benzeri ince zemin malzemesini blender'dan 2 mL plastik mikrosantrifüj tüpe aktarın.
NOT: Blender'ı deiyonize su ile yıkayın ve numuneler arasında LC-MS sınıfı MeOH ile durulayın. Bir sonraki numuneye geçmeden önce blender'ın tamamen kuru olduğundan emin olun. - İnce öğütülmüş tahıl örneklerini dondurucuya geri döndürveya bir sonraki adıma (metabolit ekstraksiyonu) geçin.
2. Ekstraksiyon çözücühazırlanması
NOT: Ekstraksiyonları gerçekleştirirken aynı gün ekstraksiyon çözücüsi hazırlayın.
- Her standarttan en az 2 mL 1 mg/mL hazırlayın. 2-aminoantracen, mikonazol ve d6-transcinnamic asit hazırlamak için asetonitril (ACN) kullanın. 13C6-sorbitol hazırlamak için su kullanın.
- Her 1 mg/mL standarttan 2 mL alın ve 100 mL hacimsel şişeye ekleyin.
- Hacimsel şişeyi asetonitril ile çizgiye doldurun. 100 mL asetonitrilin her bir iç standarttan 20 μg/mL içerdiğinden emin olun: 2-aminoantracen, mikonazol, 13C6-sorbitol, d6-transsinnamik asit.
3. Metabolit çıkarma
- 2 mL mikrosantrifüj tüp içine ince öğütülmüş tahıl 200 mg tartın.
- 200 mg ince öğütülmüş tane numunesine 500 μL çıkarma çözücüsi ekleyin.
- 6.500 rpm 20 s 2 çalışır için bir homogenizer kullanarak karıştırın.
- Santrifüj 4 °C'de 5 dk 16.100 x g.
- Supernatant'ı 2 mL plastik tüpe aktarın.
- Yaklaşık 1,5 mL toplam supernatant hacim vermek için 3,1 ila 3,5 iki kez daha fazla adımlardan bu yordamı tekrarlayın.
- Girdap supernatant karıştırmak için.
- Havuzlanmış tane özü örneği yapmak için her ekstresin eşit hacmi (55°L) ayrı bir 2 mL boruya aktarın.
- Ekstrenin 50 μL'lik aliquot'ünü cam bir şişeye aktarın.
NOT: Ekstreler bu noktada dondurulabilir (-80 °C) veya bir sonraki adıma geçerek LC-MS analizine kadar devam edebilir.
4. LC-MS analizi için çözümlerin hazırlanması
DİkKAT: Konsantre asit için her zaman suya/çözücüye asit ekleyin.
- 1 M amonyum formatı stok çözeltisi 50 mL hazırlayın. 3.153 g amonyum formatı ağırlığında ve 50 mL hacimsel şişeye aktarın. LC-MS grade H2O ile çizgiye hacimsel şişe doldurun.
- 10 mM amonyum formatı, %0,1 formik asitiçeren mobil faz A'nın 1 L'sini hazırlayın. Bunu yapmak için, 1 L hacimsel şişeye yaklaşık 500 mL LC-MS sınıfı su ekleyin. 10 mL 1 M amonyum formatı stok ve formik asit 1 mL ekleyin. LC-MS sınıfı H2O. 1 L şişeye transfer ve degas için 15 dakika sonicate ile çizgiye hacimsel şişe doldurun.
- 79:20:1 asetonitile 10 mM amonyum formatı oluşan mobil faz B 1 L hazırlayın: izopropil alkol:su, 0.1% formik asit oranı. 1 L hacimsel şişeye 200 mL isopropanol ekleyin. 10 mL 1 M amonyum formatı stok ve formik asit 1 mL ekleyin. Hacimsel şişeyi asetonitril ile çizgiye doldurun. Degas için 15 dakika için 1 L şişe ve sonicate aktarın.
NOT: ACN'yi eklemeden önce 1 M amonyum formatını izopropil alkole (IPA) seyreltin. Amonyum formatı CAN'da çözünmez. - 89:10:1 izopropil alkol:asetonitril:su oranında 10 mM amonyum formatı içeren 1 L mobil faz C hazırlayın. Bunu yapmak için, yaklaşık 500 mL izopropanol, 1 0 m amonyum formatı stok 10 mL ve 1 L volumetrik şişe ye 100 mL asetonitril ekleyin. Isopropanol ile çizgiye doldurun. Degas için 15 dakika için 1 L şişe ve sonicate aktarın.
- LC-MS sistem yıkama solventlerinin hazırlanması
- Pompa kafası yıkama solüsyonunu taze çözeltiile değiştirin. %50 metanol, %10 izopropil alkol veya üretici nin önerdiği gibi diğer kullanın.
- Numune enjeksiyonundan önce ve sonrasında enjeksiyon akışkanlarını yıkamak için güçlü ve zayıf iğne yıkama solüsyonları hazırlayın. Güçlü yıkama için eşit hacimlerde ACN ve IPA ekleyin. Zayıf yıkama için, ayrı şişelerde %10 ACN (bu protokol ve numune sayısı için sırasıyla güçlü ve zayıf yıkamaların her biri için yaklaşık 500 mL ve 1 L gerektiren) bir çözelti hazırlayın.
- İğne yıkama hacimlerini güçlü ve zayıf yıkamalar için sırasıyla 600 μL ve 1800 μL olarak ayarlayın.
5. LC-MS analizi için numunelerin hazırlanması
- 400 ng/μL lösin enkephalin hazırlanması için üreticilerin standart çalışma prosedürüne göre, pipet 7.5 mL su içeren 12 mL ll lösin-enkephalin vial 3 mg lösin-enkephalin. 50°L aliquots -80 °C'de dondurun.
- 200 ng/mL lösin-enkephalin içeren %5 ACN'lik 100 mL hazırlayın (50 μL 400 ng/μL lösin enkephalin). LC-MS analizi ile aynı gün hazırlanın.
- Adım 3'ten hazırlanan 50 μL numune aliquot'a enjeksiyon standardı lösin-enkephalin içeren %5 asetonitrilin 950 μL'sini ekleyin.
- Hazırlanan numuneyi karıştırmak için girdap.
6. LC-MS kurulumu
NOT: Üreticinin kullanım kılavuzunda enstrüman ve satın alma yöntemi kurulumunun ayrıntılı bir açıklaması açıklanmıştır. Genel bir kılavuz ve bu protokole özgü ayrıntılar aşağıda özetlenmiştir. Aşağıdaki adımlar, verileri almadan önce herhangi bir zamanda tamamlanabilir.
- Bir LC-MS donanım profili açın.
- Tablo 1'deözetlenen kromatografik yöntemi ayarlayın. LC sisteminin bu degradeyi kurmak için bir kuaternary solvent yöneticisi ile donatılmış olduğundan emin olun.
NOT: IPA viskoz bir çözücüdür. Kompozisyon %98.0'a yükseltilmeden önce düşük akış hızında kullanılmalı ve yeterli bir denge süresi kullanılmalıdır. Bu adımlar, LC sisteminin aşırı baskı ve durmasını önler. - M/z aralığı 50-1.300 üzerinde pozitif ve negatif ToF-MS modlarının her biri için kütle spektrometre kazanım yöntemlerini ayarlayın.
NOT: Burada sunulan çalışma için kullanılan alet, olumlu ve olumsuz yöntemlerin tek tek kalibre edilip çalıştırılmasını gerektirir (yani bir yöntem içinde polarite geçişi mümkün değildir). - LC sütunu yeniyse, kolon üreticinin önerisine göre koşullandırma.
NOT: Aşağıdaki adımlar veri toplamadan önce doğrudan tamamlanmalıdır. - 'Yalnızca MS' donanım profilinde, kütle spektrometresini üreticinin önerilerine göre kalibre edin. Her satın alma modundan önce bu adımı tamamlayın ve sistemin kalibrasyondan önce verilen her modalitede stabilize olmasını sağlar.
- LC-MS sınıfı çözücüler kullanarak LC akışkan sistemini mobil faz ve yıkama çözücüleri de dahil olmak üzere temizle ve temizle.
- LC sistemini LC yöntemiyle dengeleyin ve kolon basıncının dengelenmesini sağlar.
- Cihazın kalibrasyonunun kontrol edilebiyi kontrol etmek için numune dizisinin başına sodyum formatı (%90 IPA'da 0,5 mM) enjekte edin.
- Önce çözücü ve preparative (ekstraksiyon) boşlukların analiz edilmesi için alet sıra tablosunu ayarlayın; sistem klima için havuzlu QC örnekleri (6-10) takip; daha sonra QC örnekleri ile randomize örnek listesi düzenli aralıklarla (örneğin, her beş enjeksiyon) teknik çoğaltma olarak çalıştırın. Dizinin sonunda iki QC örneği çalıştırın.
NOT: Örnek dosya adı ve örnek kimlik namenin yanı sıra tarih ve enjeksiyon/satın alma siparişini de eklemek yararlı olacaktır. Örneğin: YYYY çoğaltmanumber_Variety_Biological MMDD_Injection. Başlatmadan önce, LC sütun basıncının kararlı olduğundan ve LC'nin MS'e bağlı olduğundan emin olun.
7. Veri işleme
NOT: Genel bir veri işleme iş akışı Şekil 1'desunulmuştur.
- Sıra çalışırken veri kalitesini (iç standart kütle doğruluğu (aşağıda hesaplama) ve sinyal tekrarlanabilirliğini kontrol edin. Sinyal tekrarlanabilirliğini kontrol etmek için, overlaid spectra görsel muayene yeterli olmalıdır.
NOT: Kütle hatası (ppm) = ((Teorik kütle – ölçülen kütle) / teorik kütle) x 106 - Örnekler x iç standartlarını içeren hizalanmış bir tepe yoğunluk matrisi oluşturun (bekletme süresi ve m/z değerlerine göre hizalanır).
- Veri işleme yazılımını açın (bkz. Malzemeler Tablosu). Ana Sayfa > Aç, Veri'yitıklatın. Uygun dosya konumuna gidin ve tüm veri dosyalarını açın.
- Ana Sayfa > Sıra > İşlem Türüaltında açılan menüden Nicelik'i seçin.
- Ana Sayfa > Yöntem > Quanaltında Kalibrasyon Bileşenleri'nitıklatın. Tablo 2'deverilen ayrıntıları kullanarak her alanı doldurun. Tamam'ıtıklatın.
- Veri dosyalarının yanındaki sütunlarda sol panelde, hücreye sağ tıklayarak ve Bilinmeyen'iseçerek örnek türünü doldurun. Düzeyi n/aolarak doldurun.
- Ana Sayfa > İşlemealtında , Sıra'yıseçin. Sırayı kaydetmek için bir konum seçin ve ardından İşlem'itıklatın.
- Ana Sayfa > Sonuçlaraltında, Quan'ıseçin. Quan görüntüleyicisinden, matris çözümleyicisine Dışa Aktar'ıseçin.
- Matris çözümleyicisi sonuçları görüntüleyiciden, aktarım'dan csv'ye aktar'ıtıklatın. Dosyayı elektronik tablo dosyası olarak kaydedin.
- Elektronik tablo yazılımında, her iç standardın yoğunluğunun (tepe alanının) ortalamasını, standart sapması ve göreli standart sapması hesaplayın.
- Örnekler x hedeflenmemiş özellikleri içeren hizalanmış bir tepe yoğunluk matrisi oluşturun (bekletme süresi ve m/z değerlerine göre hizalanır).
- Küçük molekül bulma çözümleme yazılımını açın (bkz. Malzemeler Tablosu)ve yeni bir deneme oluşturmak için Dosya > Yeni'yi seçin. Denemeyi adlandırın ve deneme dosyalarını kaydetmek ve depolamak için konumu seçin. İleri'yitıklatın.
- Kullanılan enstrüman türünü (yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi), veri biçimini (profili) ve polariteyi (pozitif veya negatif) seçin. İleri'yitıklatın. Kitaplıkta bulunan tüm adduct'ları seçin ve gerektiğinde adduct kitaplığını edin. Deneme Oluştur'utıklatın. Yeni bir sayfa, veri işlemenin geri kalanının devam edeceği/gerçekleşeceği yere yüklenir.
- Veri dosyalarını içe aktarın. Dosya biçimini seçin ve sonra içe aktar'ı seçin. Veri konumuna göz atın ve aktak edilecek veri dosyalarını seçin. İlerleme, sayfanın sol panelindeki her dosya için gösterilir.
- Veri dosyaları alındıktan sonra Otomatik İşlemi Başlat'ıseçin. Hizalama başvurusu seçmek için bir yöntem seçin. Ya yazılım uygunluk için tüm çalışır değerlendirmek, uygun örneklerin bir listesini vermek (yani, QC örnekleri) ya da referans en uygun yani bir orta sıra QC örnek seçin. Evet'i seçin, koşularımı otomatik olarak hizala > Sonraki.
- Deneme tasarımı sayfasında İleri'yi seçin (bu daha sonra ayarlanabilir).
- En Yüksek Çekme'yi Gerçekleştir'i seçin ve ardından Parametreleri Ayarlayın. Tepe Çekme Sınırları sekmesinin altında Mutlak Iyon Yoğunluğu'nu seçin ve 100girin. En az tepe genişliğini uygula'yı seçin ve 0,01 dk. Ok > Finish'iseçin. İşlem tamamlandığında Kapat'ıseçin.
NOT: Tepe toplama sınırları gerektiğinde diğer veri dosya türleri için optimize edilebilir. - Ekranın sağ alt kısmında Bölüm Tamamlandı'yıseçin. Hizalanmış çalıştırmaları gözden geçirin ve her örneğin başvuruya hizalandığından emin olun. Burada sunulan veriler için hizalama puanları >%90 idi. Bölüm Tamamlandı'yıseçin.
- Bir sonraki sayfada, konu tasarımı arasında seçim belirleyin. Tasarımı söyle. Çalıştırmaları el ile Grupla'yı seçin ve tasarım oluşturun. Koşul ekleyin, Koşul 1'e tıklayın ve grubu uygun şekilde adlandırın. Bölüm Tamamlandı'yatıklayın.
NOT: Yazılım içindeki istatistikleri kullanmaya uygun koşullar eklemeye devam edin. Yazılımı yalnızca hedeflenmemiş bir matris oluşturmak için kullandığımıziçin , 'hepsi' etiketli tek bir koşul kullandık. - Sonraki sayfada Bölüm Tamamlandı'yıseçin. Tepe toplamayı yeniden yapmayın.
- Deconvolution gözden geçirin ve sonra Bölüm Tamamlandı'yıtıklatın.
- Dosyaya Git > Bileşik Ölçümleri Dışa Aktar. Çıktıda istenmeyen tüm özellikleri seçin. Tamam'ıtıklatın. .csv dosyasını kaydetmek için bir konum seçin. Kaydet > Dosyayı Aç > Klasörü Aç veya Kapat'ıtıklatın.
- Eserleri (elektronik tablo yazılımını) kaldırmak için ayıklama boşluklarını kullanarak verileri filtreleyin.
- Her RT x m/z özelliği için, yeni bir sütunda, çıkarma boşluklarındaki ortalama yanıtı hesaplayın.
- Her RT x m/z özelliği için, diğer tüm örneklerdeki (QC örnekleri dahil) ortalama yanıtı hesaplayın.
- Örneklerdeki boşlukların % tepe yoğunluğunu hesaplayın (örneklerdeki boş/ortalama yanıttaki ortalama yanıt x 100).
- Yüzde katkı sütununu en düşük değerlerden en yüksek değerlere sıralayın.
- Boşluklardan >%5 yoğunluk katkısı olan özellikleri kaldırın.
- Eksik değerleri filtreleyin ve özellik sinyallerini havuzlu QC örneklerindeki sinyallere doğru şekilde düzeltin.
- Veri işleme yazılımını açın (Malzeme Tablosu). MatrixAnalyzer'ı Görüntüle düğmesini tıklatın. Veri Dosyasını Aç düğmesini tıklatın.
- Her örnek için RT x m/z özelliklerinin en yüksek yoğunluğunu içeren .csv dosya konumuna gidin (hedeflenmemiş matris). Aç'ıseçin.
- QC örnekleri sekmesinin altında, her parametreyi gerektiği gibi doldurun. Burada açıklanan veri kümesi için QC category=QC, ignore categories=boş, impute type=none, kapsama eşiği=80, ölçeklendirme kullanma=ölçeklendirme, işaret dönüştürmeyi açma, doğru kullanma=yumuşatma spline, smoothing=0,25 kullanın.
- Matris panelinin sağ üst kısmında, oynatma düğmesi QC düzeltmetıklayın.
- Düzeltme matris panelinin sağ üst kısmında yapıldıktan sonra Sonuçları Kaydet'itıklatın. Uygun bir konuma gidin ve .csv sonuç dosyasını kaydedin.
- QC örneklerinde >%20 RSD olan özellikleri kaldırmak için verilere filtre uygulayın.
- Verileri, örneklerin satırlar halinde ve özelliklerin sütunlarda olması için düzenleyin.
- Yeni bir sütunda, QC örnekleri için ortalama tepe yoğunluğunu hesaplayın.
- Yeni bir sütunda, QC örnekleri için en yüksek yoğunluğun standart sapması hesaplayın.
- QC örnekleri için pik yoğunluğun göreli standart sapması hesaplayın: (QC standart sapma/QC ortalaması) x 100.
- Özellikleri en düşük %RSD'den en yüksek %'ye doğru sıralayın ve QC RSD >%20 olan özellikleri kaldırın.
- Düşük RSDörneği/RSDQC oranlarına (örneğin, <1) sahip özellikleri kaldırmak için verileri filtreleyin.
- Yeni bir sütunda, örneklerin ortalama tepe yoğunluğunu hesaplayın.
- Yeni bir sütunda, örnekler için en yüksek yoğunluğun standart sapması hesaplayın.
- Numunelerin pik yoğunluğunun göreli standart sapması hesaplayın: (örnek standart sapma/örnek ortalaması) x 100.
- Yeni bir sütunda, rsd örneklerini QC RSD'ye bölün.
- Değerleri (RSDörnek /RSDQC oranları) en yüksekten en düşüke sıralayın ve bir oran <1 ile özellikleri kaldırın.
- Eksik değerleri (çevrimiçi olarak kullanılabilen çeşitli yöntemler) impute edin.
- Elektronik tabloyu, örneklersatırve özellikler sütunlarda olacak şekilde biçimlendirin. İlk sütun örnekleri dosya adı olmalıdır. Dosya adlarının yanında ek bir sütun oluşturun ve örnek gruplandırmaları girin. Bu durumda, örnekler çeşitli olarak gruplandı.
- Elektronik tabloyu .csv dosyası olarak kaydedin.
- Yüksek işlemmetabolomics için web tabanlı analitik boru hattı için ana sayfaya gidin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve Başlamak için Buraya tıklayın.
- İstatistiksel Analiz'itıklatın. Verilerinizi Yükle'ninaltında Veri Türü'nü seçin: en yüksek yoğunluk tablosu, Biçim: Satırdaki örnekler (eşleşmemiş) ve ardından Dosya'yı seçin.
- .csv dosyasına gidin, Aç'ı seçin ve sonra Gönder'iseçin.
- Sonraki sayfada Eksik Değer Tahmini'niseçin. Adım 1'i kaldırın (bu AnalyzerPro XD'de gerçekleştirildi). Adım 2'de, eksik değerleri tahmin etmek için bir yöntem seçin.
NOT: Burada sunulan veriler için - 'KNN' ile 'tahmini eksik değerler' seçilmiştir. - Bu aşamada, veri matrisi indirilebilir (web sayfasının sol panelinden İndir'i seçin) veya daha fazla istatistiksel analiz yapmaya devam edebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bitki metabolom genomu ve çevre bir arada etkilenir, ve ayrıca bir tarımsal ortamda, ürün yönetimi rejimi. Buğday çeşitleri arasındaki genetik farklılıkların metabolit düzeyinde gözlemlenebildiği, burada 500'den fazla ölçülen bileşiğin sadece tahıldaki çeşitler arasında anlamlı olarak farklı konsantrasyonlar gösterdiğini gösteriyoruz. İyi kütle doğruluğu (<10 ppm hatası) ve iç standartların sinyal tekrarlanabilirliği (<%20 RSD) hem negatif hem de pozitif iyonizasyon modları için gözlendi (Tablo 3).Figure 2 Açıklanan numune hazırlama ve sıvı kromatografi-kütle spektrometresi tabanlı analiz, negatif iyonizasyon modunda >900 dekonvoluted ve pozitif iyonizasyon modunda >1300 dekonvoluted özellikleri ortaya çıktı. Örnek hazırlama ve analiz yöntemlerinin eser özelliklerini ortaya çıkarıp tanıtmadığını belirlemek için preparatif boşluklar(Şekil 3)eklenmiştir ve böylece tüm biyolojik olmayan etkiler veri matrisinden çıkarIlmiştir. Negatif modda 421, pozitif modda 835 sinyalin ise tahıl örneklerindeki ortalama sinyal yoğunluğunun %5'ine eşit veya daha büyük sinyal yoğunluklarına sahip olduğu bulunmuştur. Bu özellikler kaldırıldı ve daha fazla veri filtreleme adımları sonra (adım 7 ve Şekil 1),negatif modu 483 özellikleri döndü ve pozitif modu metabolik anlık oluşturan 523 özellikleri döndü. Bu yöntem, her iki iyonizasyon modunda >500 önemli özelliklere sahip buğday çeşitleri(Şekil 4)arasında önemli ölçüde farklı yoğunluklara sahip özellikleri tespit etmede başarılı oldu. Negatif iyonizasyon modunda, önemli özelliklerin çoğu ters faz gradyan ve pozitif iyonizasyon modunda, önemli özelliklerin çoğunluğu lipid gradyanı idi(Şekil 4).
Şekil 1: Veri denetimi, işleme ve filtreleme için bu çözümlemede kullanılan iş akışı. Adım 1, 'anında' değerlendirmelerin yapilebilmeleri için cihazdaki veri toplama/görüntüleme yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Bu, iç standartların kütle hatasının (ppm) hesaplanmasını ve veri tekrarlanabilirliğinin görsel olarak değerlendirilmesi için iç standart zirvelerinin üst üst düzeye çakıştırMasını içerir. 2-7. adımlar, protokolde özetlenen veri işleme yordamını açıklar, adım 7. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Çıkarılan iyon kromatogramları. 13C6-sorbitol (koyu mavi), lösin-enkephalin (pembe), d6-trans-sinnamik asit (turuncu), 2-aminoanthracene (yeşil) ve mikonazol (açık mavi) pozitif (üst) ve negatif (alt) elektrosprey iyonizasyon (ESI) modlarında iç standartlarda ayıklanmış iyon kromatogramları. Dahili standart saklama süreleri ve yoğunlukları gösterilir. ESI + ve ESI - Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Negatif mod (pembe) ve pozitif mod (mavi) kazanımlarını gösteren preparatif boşlukların toplam iyon kromatogramı (TIC) kaplaması. Bir iç standart, mikonazol, gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Toplam iyon kromatogram (TIC) bindirme, negatif modu gösteren (pembe) ve pozitif modu (mavi) kazanımlar ve kromatografik gradyan arasında buğday çeşitliliği arasında önemli ölçüde farklı özellikleri sayısı. Negatif modda, mobil faz B kompozisyonu yüksek olduğunda en fazla önemli özellik bulunmuştur. Pozitif modda, mobil faz C kompozisyonu yüksek olduğunda en fazla önemli özellik bulunmuştur. Bir iç standart, mikonazol, gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Segment | Zaman | Akış hızı | %A | %B | %C | Eğri |
| (dk) | (mL/dk) | |||||
| 1 | Ilk | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 2 | 1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 3 | 7 | 0.8 | 2 | 98 | 0 | 6 |
| 4 | 7.1 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 5 | 10 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 6 | 18 | 0.4 | 0 | 10 | 90 | 6 |
| 7 | 21 | 0.4 | 0 | 2 | 98 | 6 |
| 8 | 21.1 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 9 | 24 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 10 | 24.1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 11 | 25 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
Tablo 1: Mobil faz bileşimlerinin sıvı kromatografi zamanlı programı.
| Parametre | Dahili standart | ||||
| 13.000 C6-sorbitol | Lösin-enkephalin | d6-transsinnamik asit | 2-amino-antracen | Mikonazol | |
| Quan m/z | 211.09 (187.09) | 556.28 (554.26) | 155.097 (153.08) | 194.1 | 414.99 |
| Kütle toleransı (amu) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 | 0.01 |
| Bekletme süresi | 1.2 | 4.6 | 5.1 | 6.5 | 7 |
| Bekletme süresi penceresi | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 | 0.1 |
| Algılama türü | Yüksek | Yüksek | Yüksek | Yüksek | Yüksek |
| Yanıt türü | Alan | Alan | Alan | Alan | Alan |
| Alan eşiği | 10 | 10 (50) | 10 (50) | 10 | 10 |
| Genişlik eşiği | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| Yükseklik eşiği | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Sinyal-gürültü oranı | 5 | 5 | 3 (5) | 5 | 5 |
| Yumuşatma | 5 | 5 (3) | 5 (3) | 5 | 5 |
Tablo 2: Pozitif (ve negatif) kazanım modlarında iç standartlar için tepe algılama parametreleri.
| Kütle doğruluğu (ppm) | QC düzeltmesinden önce %RSD | QC düzeltmesi sonrası %RSD | ||
| Negatif mod | 13.000 C6-sorbitol | 4.59 | 6.12 | 7.08 |
| D6-transsinnamik asit | 7.94 | 3.93 | 5.99 | |
| Lösin-enkephalin | 0.91 | 1.8 | 1.96 | |
| Pozitif mod | 13.000 C6-sorbitol | 5.65 | 14.1 | 15.3 |
| Lösin-enkephalin | 3 | 3.24 | 5 | |
| D6-transsinnamik asit | 8.03 | 5.41 | 9.81 | |
| 2-aminoanthracene | 3.99 | 7.97 | 5.45 | |
| Mikonazol | 1.8 | 3.01 | 5.72 | |
Tablo 3: Örnek(n=30) iç standart kütle doğruluğu (ppm) ve QC düzeltmesi öncesi ve sonrası sinyal tekrarlanabilirliği göreceli standart sapma (%) olarak ifade edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, buğday tanesi nin analizi için LC-MS tabanlı hedeflenmemiş metabolomik bir yöntem salıyoruz. Yöntem, ters faz degradesine üçüncü bir mobil faz getirerek dört kazanım modunu (ters faz ve lipid-amenable ters faz ile pozitif ve negatif iyonizasyon) iki modda birleştirir. Birleşik yaklaşım, iyon polaritesi başına yaklaşık 500 biyolojik olarak ilgili özellik vermiştir ve bunların kabaca yarısı buğday çeşitleri arasındaki yoğunluk açısından önemli ölçüde farklılık göstermiş. Farklı buğday çeşitlerinin tanelerinde metabolit konsantrasyonundaki önemli değişiklikler, hastalık direnci, stres toleransı ve tahıl kalitesi ve verimi için önemli olan diğer henotik özelliklerle bağlantılı olabilecek değiştirilmiş biyokimyayı gösterir. Örneğin, metabolomik yaklaşımlar yeni savunma mekanizmaları tanımlamak için kullanılmıştır12 ve kuraklık toleransı metabolitlerin rolünü önermek13. Bu protokolün gelecekteki uygulamaları, belirli çeşitlerin biyokimyasal profillerini belirli ortamlar ve yönetim uygulamaları için arzu edilen genetik özelliklere daha fazla bağlayabilir. Buna karşılık, bu seçilen genotipler için optimum tane kalitesi ve verim üretimine olanak sağlayacaktır.
Dahili standartların dahil edilmesi, kullanıcının sinyal, bekletme süresi değişimleri ve kütle doğruluğu göstergeleri olarak değişiklikleri belirlemesine olanak sağlamak için bu protokol için çok önemlidir. Sinyaldeki değişiklikler, örneğin, alt optimal ekstraksiyon, enjeksiyon (akışkan sistem tıkanıklıkları dahil) veya dedektör performansını gösterebilir. Bekletme süresi değişimleri düşük pompa performansı, uygun olmayan mobil faz gradyan dengesi veya LC sütun sabit fazının bozulduğunu gösterebilir. Düşük kütle doğruluğu sürüklenmiş bir kalibrasyonun ve sistemin yeniden kalibrasyon gerektirdiğini gösteren bir gösterge olabilir. Yukarıdaki durumların tümlerinde sistem durdurulmalı ve parçaların uygun bakım/değiştirme işlemi yapılmalıdır. Tahıl hazırlamak için kullanılan ekstraksiyon çözeltisine dört standart ve enjeksiyondan önce eklenen son numuneye bir standart ekledik. Standartların her iyonizasyon moduna uygun olmasını ve bir dizi bekletme süresini kapsadığından emin olmak için özen; ancak, bu standartlar dizisinin etiketli bir lipid standardının eklenmesiyle geliştirilebileceğini kabul ediyoruz. Bu buğday tanesi triacylglycerols yüzlerce içerdiği gösterilmiştir (TAGs)5, herhangi biri bu protokole uygun bir ek olacaktır. Preparative boşluklar ve havuzlu QC örnekleri8 dahil edilmesi de bu protokolde kritik adımlardır. Hedeflenmemiş kütle spektrometresi yöntemlerinde binlerce iyon özelliği saptanmaktadır ve analiz boyunca yalnızca boş örneklerde bulunanve aynı zamanda tekrarlayıcı olarak tespit edilemeyen (örn. yüksek %RSD) bu özellikleri dışlamak önemlidir.
Mevcut yöntem önemli ölçüde zaman ve kaynak tasarrufu sağlasa da, kuaterniyer bir çözücü yöneticisi yoksa, aynı sonuçları elde etmek için standart ters faz ve lipid yöntemleri kullanılabilir. Bu protokolde kullanılan çıkarma hacmi, ek edinme modlarının analizi için yeterli olacaktır. Bu protokol bir asetonitril ekstraksiyonu açıklar. Başarılı olsa da, alternatif bir ekstraksiyon çözücü, ya da çözücülerin kombinasyonu, farklı bir metabolit kapsamı sağlayacaktır, hangi sırayla daha fazla özellik sunabilir ve / veya bazı bileşiklerin daha iyi (veya daha az) ekstraksiyon verimliliği verebilir. Bu protokolde çözümlenen istatistiksel olarak anlamlı ölçümlerin metabolit kimliğini belirlemeye çalışmıyoruz; ancak, bitki metabolitleri ve lipidler için kütle spektral veritabanları mevcuttur ve gelişmekte olan5,14,15. Metabolitleri tanımlamak için, tandem kütle spektrumları (MS/MS) tam tsam verilerine ek olarak toplanması gerekir. Bunlar ilk çalıştırma sırasında havuzlu numuneler ve uygun bir MS/MS yöntemi kullanılarak veya ilgili metabolitler belirlendikten sonra ayrılmış ekstre (-80 °C'de depolanır) ile toplanabilir. Biz çeşitleri arasında bileşiklerin büyük kat değişiklikleri gözlendi, bu yüzden hem de ikinci durumda, en yüksek kaliteli MS / MS spektrumu elde etmek için ilgi bileşik yüksek konsantrasyon içeren bilinen çeşitli kullanarak tavsiye ederim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Batı Avustralya Premier Tarım ve Gıda Bursu programı (İş Bölümü, Turizm, Bilim ve Yenilik, Batı Avustralya Hükümeti) ve Premier Fellow, Profesör Simon Cook (Merkezi kabul etmek istiyorum Dijital Tarım, Curtin Üniversitesi ve Murdoch Üniversitesi). Saha denemeleri ve tahıl numunesi toplama, Batı Avustralya'nın Bölgeler için Telif Hakları programı hükümeti tarafından desteklendi. Grantley Stainer ve Robert French'i saha denemelerine katkılarından dolayı kabul ediyoruz. NCRIS tarafından finanse edilen Bioplatforms Avustralya ekipman finansmanı için kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
