Summary
オソノ付着アッセイは、ワクチン開発における抗体のオプソニック機能を評価するオソノ貪食性殺死アッセイの代替方法である。
Abstract
オソノ付着アッセイは、細菌病原体のプロの食細胞への付着を列挙する機能的アッセイです。アギャンスは食細胞性および殺死に必要であるため、アッセイはオソノ貪食性殺死アッセイの代替方法である。オソノ付着アッセイの利点は、不活性化病原体と哺乳類細胞株を使用するオプションであり、複数の実験で標準化が可能です。アッセイにおける不活性化病原体の使用はまた、バイオセーフティレベル3感染因子および他の有害な病原体との作業を容易にする。我々の研究では、オソノ付着アッセイは、抗体の機能的能力を評価するために使用され、炭疽菌カプセルベースのワクチンで免疫された動物のセラから、固定 バチルスアントラシス の固定されたアテンスをマウスマクロファージ細胞株RAW 264.7に付着誘導する。マクロファージに付着したバチルの画像を捕捉するために、自動蛍光顕微鏡を用いた。接着性の増加は、血清中の抗カプセル抗体の存在と相関していた。高い血清抗カプセル抗体濃度を示した非ヒト霊長類は炭疽菌の挑戦から保護された。従量的に、オソノ付着アッセイは、セラにおける抗原特異的抗体の生物学的機能を解明し、ワクチン候補および他の治療薬の有効性を評価し、免疫の可能な相関として役立つものとして使用することができる。
Introduction
認識、付着、内在化、および病原体の分解は、貪食症1に不可欠であり、1883年2、3年にイヤ・メチニコフによって最初に説明された宿主の自然免疫応答における顕著な経路である。食細胞性白血球は、免疫系の他の細胞と同様に、標的の選択において非常に差別的である。それらは、パターン認識受容体(PRR)4,5のレパートリーによって病原体関連分子パターンを介して「感染性非自己」と「非感染自己」を区別することができる。病原体の宿主認識は、補体および抗体6などの宿主オプソニンの結合と共に起こり得る。このプロセスは、オプソナイゼーションと呼ばれ、これらの分子で病原体をコーティングし、食作用細胞6上のオプソニック受容体(例えば、補体およびFc受容体)への結合時の内在化を増強する。病原体が食細胞に付着するためには、複数の受容体と同結合リガンドの集合的結合が必要である。そうして初めて、ホストセル内のシグナル伝達カスケードを付着して、内部化を開始することができます。
病原体のクリアランスと感染予防における貪食の重要性のために、細胞外病原体は生存を延長するためにこのプロセスを破壊する多くの方法を開発してきました。重要な1つの戦略は、その電荷によって抗貪食性であるアニオン性高分子(例えば、多糖またはポリアミノ酸)カプセルの製造であり、免疫原性が低く、そしてPR6,7から細菌エンベロープ上の分子を遮蔽する。クリプトコッカス・ネオフォルマンや肺炎球菌などの病原体は、糖類ポリマーで構成されるカプセルを有するのに対し、ブドウ球菌は表皮基内および一部のバチルス種がポリɣグルタミン酸(PGGA)7,8を産生する。しかし、他の病原体は、非感染性の自己に似たカプセルを生成します。例えば、B.セレウスの連鎖球菌性菌株および病原性株は、抗貪食性であるだけでなく、免疫系9,10によって異物として認識されないヒアルロン酸カプセルを有する。
カプセルをキャリアタンパク質に結合すると、それらを貧しいT依存性抗原から高い免疫原性T依存性抗原に変換し、高血清抗カプセル抗体力剤11,12を誘導することができる。この戦略は、S. 肺炎,血友病インフルエンザ ,および Neisseria 髄膜炎菌に対するライセンスワクチンに採用されています。抗カプセル抗体のオプソニック作用は、一般的にオソノ貪食性殺死アッセイ(OPKA)13、14、15、16によって評価されている。これらのアッセイは、機能性抗体が貪食を引き起こし、14を殺すことができるかどうかをテストする。しかし、B.アントラシス17を含む、第1層生物学的選択剤や毒素(BSAT)などの感染病原体とのOPKAの使用は危険であり、セキュリティリスクを伴う。これらのアッセイは、選択剤の広範な取り扱いを必要とする。選択剤の取り扱いは、制限されたバイオセーフティレベル3(BSL-3)の研究所でのみ行うことができます。これらの分野での作業は、従わなければならない多数の安全およびセキュリティ上の予防措置のために長引く操作手順を要求する。BSL-3の実験室はまた顕微鏡およびサイトメーターのようなOPKAの仕事のために使用される専門の装置と一般に装備されていない。そこで、不活化菌18,19の使用に基づく代替アッセイを開発した。我々はこれを、内部化とアッセイ出力としての殺害に依存しないオプソノ付着アッセイ(OAA)と呼ぶ。代わりに、オプゾン化不活化病原体の付着は、貪食の指標として使用される。OAAは、付着が先験的に起こり、内在化および細胞内殺滅と密接に絡み合っているので、OAAは適切な代替物である。バイオセーフティの観点から、OAAは、感染性薬剤の最小の取り扱いを必要とし、OPKAよりも実験的に短い期間であり、そして不活性化病原体のストックが産生および移送された後にBSL-2研究所で行うことができるので好ましい。
カプセルコンジュゲートでワクチン接種した非ヒト霊長類(NHP)の血清に見られる抗カプセル抗体のオプソニック機能を調べるOAAの利用を実証する[すなわち、B.アントラシスからナイセリア髄膜炎の外膜タンパク質複合体(OMPC)に結合したB.アントラシスからのPGGA]20。血清オプゾン化バチル酸は、付着マウスマクロファージ細胞株、RAW 264.7でインキュベートした。固定後、細胞単層及び接着性バチルを蛍光顕微鏡で画像化した。細菌の付着は、バチル菌を対照血清20と比較してカプセルコンジュゲートでワクチン接種したNHPから血清でインキュベートした場合に増加した。付着は炭疽菌チャレンジ20,21の生存と相関した。従って、OAAの使用は抗カプセル抗体の機能を特徴づけ、ワクチン候補の試験を大いに促進した。
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Protocol
動物福祉法、公衆衛生サービスの方針、動物に関する連邦法や動物実験に関するその他の連邦法や規制に従って、ここで述べられた研究は、制度的動物のケアと使用委員会が承認した議定書の下で行われました。この研究が実施された施設は、国際実験動物の評価と認定協会によって認定され、実験動物のケアと使用のためのガイド、国立研究評議会、201124に記載の原則に準拠しています。
1. 細胞株の培養と維持、RAW 264.7
注: 以下の手順は、無菌技術で実行する必要があります。
- 56°Cの水浴で30分間、牛胎児血清(FBS)を熱し、補体を不活性化します。
メモ:30分の不活性化時間は、FBSが56°Cに達したときに始まります。 温度を監視するには、同じ水浴中のビーカーに同様の量の水を熱します。水が56°Cに達したら、FBSの30分のカウントダウンを開始します。あるいは、熱不活化されたFBSも市販されている。 - 高グルコースと10%の熱不活化FBS(v /v)と90%DMEMを組み合わせることにより、RAW 264.7細胞用培地を調製します。6 mMの最終濃度にL-グルタミンを加えます。
注:高グルコースを有するDMEMは、4 mM L-グルタミンで処方される。6 mM に L-グルタミンを補う一貫した細胞の成長を促進します。.100 U/mLペニシリンおよび100 μg/mLストレプトマイシンを加えて汚染を防止します。別の一般的なマウス細胞株、J774A.1も、同様の条件下で増殖して使用され得る。 - 37°Cの水浴で凍結した細胞のバイアルを解凍し、溶けるとすぐにお風呂から取り除きます。円錐管の5 mL完全な媒体に無菌の内容物を加える。円錐管を2回反転し、ペレット細胞に5分間300 x g で回転する。
- 凍結剤を除去するために真空に取り付けられた滅菌パスツールピペットを使用して吸気媒体。新鮮な培地の5 mLに細胞ペレットを再懸濁します。
- 懸濁液をフラスコまたは皿を処理した組織培養物に移す。フラスコの底を完全に覆うのに十分な媒体を加え、細胞を均等に分配するために渦巻く。「1」で始まる通過番号を示します。
- 5%CO2の存在下で37°Cで細胞をインキュベートし、95%〜100%の合流まで湿度が達する。インキュベーションの2日目から始まる顕微鏡の下で、細胞を毎日チェックしてください。セルが持ち上がって死ぬので、セルが >100% の合流率に達するのを許さない。
注意:合流するまでに必要な時間は、メッキされた生細胞の数とフラスコの成長領域によって異なります。したがって、毎日細胞をチェックすることが賢明です。 - 細胞ストックを新鮮な培地で掻き取り、希釈することにより、細胞を切り取り、少なくとも2日間の増殖を可能にする。サブカルチャーごとに 1 つずつ、通路の数を増やします。
注:翌日の通過と即時スクレイピングは、時間の経過とともに一般的な細胞の付着がより速く失われます。RAW 264.7細胞は、約15個まで使用する必要があります。 - OAAアッセイ用のRAW 264.7細胞をプレートするには、新鮮な培地に交換し、セルスクレーパーを使用してフラスコから細胞を静かに掻き取ります。ピペットは、セルの塊を分割してセルカウントを容易にします。
注: RAW 264.7 をサブキュリングするための従来の方法は、スクレイピングです。私たちの経験では、トリプシンを使用すると、RAW 264.7細胞は、スクレーピングよりも時間の経過とともに速く付着性を失います。 - 細胞を数えるために、細胞の等しい量を希釈し、トリパンブルー溶液。10 μLをヘモサイトメーターに積み込みます。10倍の対物レンズを用いた反転した化合物顕微鏡を用いて、色素を除外する生細胞数を観察し、カウントします。
- プレート 1.4 x 104ウェルあたり 96 ウェル 0.15 μm の厚さのガラス平底プレート (プレート #1) に 4 個の生細胞を入れます。細胞が3日間増殖することを許可します。OAAを実行する1日前に使用済みメディアを交換してください。
注:3日間のインキュベーションの後、セルの数は約5 x 104/wellでなければなりません。
2. 細菌培養と調製物
注:このプロトコルで使用される細菌種は、カプセル化された悪質な株 、B.アントラシス エイムズです。この種を用いたすべての操作は、適切なバイオセーフティとセキュリティクリアランスを必要とし、BSL-3の実験室にあるクラスIIまたはクラスIII生物学的安全キャビネットで行う必要があります。BSL-3の仕事のための制度的な操作手順および細菌を扱うときの個人的な保護具の使用のために従ってください。
- 脳心注入(BHI)の液を1L水に溶解し、121°Cで15分間オートクレーブして調製します。周囲温度でスープを保存します。
- 8%炭酸水素ナトリウム溶液を水に調製し、0.20 μmのフィルターシリンジを使用して滅菌します。4 °Cで溶液を保管し、1日以内に使用してください。
- 8 g の栄養ブロス、3 g 酵母エキス、1L 水に 15 g 寒天を混ぜ、NBY寒天プレートを調製します。121°Cで15分間オートクレーブ。シャーレに注ぎ、固める。プレートは4°Cで保管してください。
注:NBY寒天プレートは、重炭酸ナトリウムの有無にかかわらず作ることができる。炭酸水素ナトリウムをブロスおよび寒天プレートに添加すると、カプセル化されたバチルからなる粘膜コロニーの成長を誘導する。液体および固体培地中の炭酸水素ナトリウムの最終濃度は0.8%である。 - 50%オートクレーブBHIブロス、40%FBS、10%重炭酸ナトリウム溶液(v/v)を混合して 、B.アントラシス 用の培養液を調製します。
注:このスープは、カプセル化されたバチルスの短鎖を生成するために配合されています。 - B.アントラシスのマスタープレートを準備し、スープで培養する前に、胞毛ストックからNBY寒天プレートで分離するためにそれをストリーキングします。37°Cでインキュベートする。
- B. アントラシスのいくつかのコロニーを持つ通気250 mLフラスコで培養液の30 mLを接種.
注:ここで指定されているように、スープの表面比に対する特定の体積は、最大にカプセル化されたバチルを生成するために必要です。 - 125 rpm、37 °C、20%CO2、湿度18~24時間で振ります。
注:37°Cを超える温度で B.アントラシスを 成長させることは、カプセル産生を阻害する可能性があります。 - 十分なカプセル化を確保するためにインドのインクで負の染色を使用し、そのバチルは、固定する前に短鎖(1-5バチル/鎖)にあることを確認します(セクション3を参照)。
- コロニー形成単位(CFU)を決定するために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液および羊血寒天プレート上のプレート培養希釈液で1:10の培養液を1:10の連続的に希釈した。37°Cで12〜18時間インキュベートします。 CFUsをカウントし、培養のmLあたりの細菌数を決定します。
注:細菌を固定したら、顕微鏡下でヘモサイトメーターを使用してカウントすることもできます。しかし、これは、低倍率で見えにくいため、推奨されません。 - 細菌培養物の全容に16%パラホルムアルデヒド(PF)を加え、最終濃度4%PFで菌体を固定します。周囲温度で7日間、シェーカーでゆっくりと攪拌します。
注:4%PFのインキュベーションの7日間は、栄養バチルを固定するためのUSAMRIID制度標準操作手順に基づいています。 - 固定液を除去し、滅菌のテストを行うために、50mL円錐管内の固定細菌懸濁液を45分間≥3000 x g で遠心分離し、PBSで30mL/洗浄を行います。残りのサンプルを4%PFで4°Cで保存してください。
注:ペレット化後、カプセルの存在により、細菌ペレットがふわふわです。洗浄中にペレットを邪魔しないように注意してください。実行可能性テストを妨げないように、すべての固定を削除する必要があります。必要に応じて、多くの場合、この数を増やします。 - 生存率試験のために、4mLの洗浄懸濁液(≤の10%のスープ容量)を用いた細菌増殖培地(例えばBHIブロス)の40mLを接種し、37°Cで7日間インキュベートする。濁度を測定するために、7日前と後の600 nmで光学濃度を確認してください。
- 7日間の培養液の培養後、100μLのスープを寒天プレートにプレート≥し、さらに7日間インキュベートします。濁度の増加がなく、プレート上の成長が見られない場合、元の培養物は無菌とみなされ、BSL-2実験室に移され得る。
注:連邦選択エージェントプログラム22は、不活性化B.アントラシスは、サンプルの完全な無菌性を実証した後にのみBSL-3研究所から転送することができることを義務付けています。不活性化B.アントラシスの生存率試験は、7日間のスープ中のサンプルの10%を培養し、続いてさらに7日間22、23の固体培地で培養することからなる。無菌が確立したら、移転承認を受けるために制度ガイドラインに従ってください。
3. カプセル化とバチル鎖を観察する陰性染色と光顕微鏡
- 5 μL の細菌懸濁液とインドのインク 2 μL を顕微鏡スライドに混ぜます。1または1.5μmの厚さのカバーガラスを、泡を作成せずにサスペンションの上に置きます。
メモ:マニキュアを使用して、カバーガラスをスライドに密封することができます。 - 40x~100xの油対対物レンズを用いて、軽顕微鏡で細菌懸濁液を観察します。各細菌を取り囲むクリアランスゾーン(カプセルはインドのインクを除く)を観察することによって、バチルがカプセル化され、細菌鎖が短いものであることを確認してください。
4. 細菌のFITC標識
- 2mg/mLの濃度でジメチルスルホキシドにフルオレセインイソチオシアネート(FITC)を溶解します。
- 不活化菌ストックの体積を測定します。
- ストック3xをPBSで洗浄して固定剤を取り除きます。
- FITC溶液を最終濃度75μg/mLで添加します。4°Cで18〜24時間ゆっくりと混合物を攪拌する。
- 3thは≥3000 x g、45分でペレット化し、30 mL PBS/洗浄を使用して過剰なFITCを除去することによって細菌を洗浄します。洗い物中にふわふわペレットが邪魔されないようにしてください。PBS のバチル菌を同じ開始ボリュームで再中断します。
- アリコートを使用するまで-20°Cでマイクロチューブにバチルを保存します。バチル菌はカプセルを失う可能性があるため、何度も凍結/解凍しないでください。
5. 細菌のオプゾン化
- 熱は、熱ブロックで30分間56°Cで少量のテストセラ(NHPから)を不活性化します。
- 15000 x g で 3 ~ 5 分間ペレット化することで、PBS 2x で FITC ラベルの細菌を解凍して洗浄します。同じ開始ボリュームの PBS で再中断します。
- 96ウェルラウンドボトムプレート(プレート#2)で、細胞培地中の連続してテストセラを希釈する。別の96ウェルラウンドボトムプレート(プレート#3)で、希釈されたテストセラの10 μLを各ウェルに加えます。
注:すべてのプレートでは、PBSと通常のサルセラは、陰性対照として希釈されたテストセラの代わりに含まれていました。また、異なる日に行われたすべてのアッセイを正規化するための標準曲線を生成するための陽性対照として、1つのテスト血清を選択しました。陽性対照検査用血清は豊富であったため任意に選ばれた。 - プレート#3には、10 μLの新しく再構成された赤ちゃんウサギの補数を加えます。
注:一度再構成,残りの赤ちゃんウサギの補完を捨てる。再凍結して解凍しないでください。 - #3プレートするには、FITC標識菌の適切な量を追加して、感染の多重度を1:20にします。たとえば、5 x 104 セル に 5 x 10 4 x 20 バチルを含むボリュームを追加します。 各ウェルをプレート#3に、適切なセル・メディアの量を合計105 μLに上げなさい。
注:細胞を含むプレート#1は、残りの5μLを空隙体積として100μLのオプソン化菌を受け取ります。我々は、重複してテストセラの各希釈をテストした。 - インキュベートプレート#3 37°Cで30分間、湿度が5%のCO2 の存在下で30分間、バチル酸菌をオッホナイズする。
哺乳動物細胞のアドヒスアセシングと蛍光標識
- 使用前に37°Cですべての試薬を維持してください。
- 接着細胞を含むプレート#1を37°Cのヒートブロックに置きます。
- マルチチャンネルピペットを使用して、使用済み培地を井戸から取り除き、プレート#3から100 μLのオプソナイズ菌に素早く交換します。ピペットの間にウェルに泡が発生しないようにしてください。インキュベートプレート#1 37°Cで5%CO2、 湿度を30分間付着します。
- 37°Cのヒートブロックの上に150 μL PBSで各井戸を5倍洗い、取り付けられていないバチルを取り除きます。
注:洗浄中に細胞が誤って分散しないように注意してください。 - PBS 1:4で16%のPFを希釈して4%PFを作り、各ウェルに150 μLを加えて4%PFを1時間固定します。PBSで細胞2倍を洗浄する。
- 10 mL PBSで2 μL HCS(高含有スクリーニング)オレンジセル染色を混合します。この染色液を150μL固定細胞に加え、周囲温度で30分間インキュベートします。
- PBSで2倍の井戸を洗います。
- 顕微鏡まで4°Cで保管してください。
7. 顕微鏡
注:一般的に、高スループットの自動蛍光顕微鏡はOAAのイメージングを容易にします。自動化システムが利用できない場合、接着性バチルの蛍光画像を手動で21に撮影することができる。本研究20では、粘着性のバチルおよび細胞単層を、専用の装置を備えたZeiss 700レーザー走査顕微鏡システムを用いて画像化した。当社のシステムは、自動ステージ、明確な焦点モジュール、40 x NA 0.6目的、AxioカムHRcカメラとZen 2012(ブルーエディション)ソフトウェアを搭載したツァイスアクシオオブザーバーZ1反転顕微鏡で構成されていました。取得した画像は、共焦点画像ではなく、広視野画像です。以下のプロトコルは、さまざまな自動顕微鏡システムに適用可能な基本的な顕微鏡セットアップとして意図されています。
- 周囲温度で30分間#1インキュベートプレート。顕微鏡と関連機器の電源を入れます。
メモ:周囲温度での順応により、イメージング中にガラス板に凝縮が生じないようにします。また、温度変化による焦点のずれを防ぎます。 - ステージ上にプレートを配置し、明視野または位相コントラストを使用して細胞に焦点を当てます。
- プレート設定として96ウェルフォーマットを選択します。チャンネル設定を選択します。
注意:FITCのピーク励起および発光波長は495/519 nmである。HCSオレンジセル染色は556および572 nmである。他の蛍光ホルは、顕微鏡で利用可能なフィルターに応じて使用されてもよいです。 - タイル モードに設定を選択します。取得する画像の数を示します。
注: タイル機能は、サンプルウェル内の複数の位置のキャプチャを可能にし、タイルまたはランダム形式で画像を取得するように設定することができます。私たちは井戸ごとに10のランダムな領域を画像化しました。 - 取得モードを「黒と白」または「モノクロ」に変更し、2x2≥ビンを設定します。
注: ビニングを 1x1 から 2x2 または 4x4 に設定すると、顕微鏡の速度は向上しますが、イメージの解像度も低くなります。OAAの場合、アッセイがマクロファージと付着細菌の両方を列挙するようにこれらの設定を使用するだけで十分である。 - 自動フォーカスまたはフォーカスモジュールをオンにします。自動焦点を合わせる機能を実行する頻度を示します。Z スタック機能をオンにします (可能な場合)。細胞単層と付着性バチルの厚さを捉えるZスタックの数を示します。
注:選択されたZスタックの数は顕微鏡の時間を増加させますが、各Zスタックで正しいフォーカスを持つ画像が確実に撮影されます。 - イメージを保存するファイル フォルダを指定します。自動イメージングプログラムを実行します。
8. データ収集と分析
- 画像あたりの接着性バチルおよび哺乳類細胞の数を数える。バチルの各鎖を1つの細菌として数える。
- 陽性対照検査血清および価価子(例えば、1:10希釈は10価単位)のバチル/細胞をプロットし、適切な統計プログラムで標準曲線を生成する。
- 非線形回帰曲線フィッティングを使用して、陽性対照試験血清を分析します。次に、陽性対照検査血清の標準曲線を用いて残りのサンプルを分析し、対応する力乗を決定します。
注: 通常、タンターを決定する際に、標準曲線の中央付近にあるサンプル希釈を選択するのが最も正確です。 - 各ワクチン群からサンプルの幾何平均を計算します。最小の有意差 ANOVA 分析により、変換された対数の P- 値を計算します。
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Representative Results
本セクションでは、OAA実験中に収集された代表的な顕微鏡写真と、OAAを使用して抗体の生物学的機能を調べることができることを示す結果を示します。ここで、アッセイは炭疽菌ワクチン候補の有効性を評価するためにうまく使用された。バチルスのカプセル化の状態を確認することは重要であり、カプセル化がほとんどまたはまったくない場合、宿主細胞に付着し、高いバックグラウンドを産生する。 図1 は、カプセル化を調べるためにインドのインクで否定的に染色された B.アントラシス ・エイムズの画像である。OAA では、隣接する複数の視野を照らし、共焦点顕微鏡を使用する場合は複数のスタックまたはセクションを使用する必要があります。したがって、バチルが薄暗くも、写真漂白剤でもなく、あまりにも早く過ぎないことを確認する必要があります。 図2 はFITCで標識されたバチルの画像である。 図3 は、細胞単層に結合した B.アントラシス ・エイムズの最大投影画像を示す。これらは、OAAに対してカウントされ、スコア付けされた代表的な視野です。PGGA-OMPC抗血清でインキュベートされたバシリの付着の増加は、バチル菌をオプソニングした抗カプセル抗体の存在によるものです。 図4 は、10および50μg PGGA-OMPCでワクチン接種されたNHPの血清価が、OMPCおよびPGGA単独の価数よりも有意に高いことを示す。
図 1.固定 されたB.アントラシス エイムズのインドのインク画像。 カプセルの存在によるバチルス周囲のクリアランスのゾーンに注意してください。バー = 10 μm。画像は、100 x 1.4数値開口(NA)油対物レンズを備えたEVOS FL自動顕微鏡システムで撮影されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.FITCの画像は、固定 B.アントラシス エイムズとラベル付けされました。 (左)差動干渉コントラスト画像;緑色(中央)の蛍光画像擬似色;マージ (右)。バー = 10 μm。共焦点画像は、40 x 1.3 NA油対物レンズを使用したツァイス700 LSM共焦点顕微鏡で撮影されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.B. アントラシスエイムズの蛍光画像は、RAW 264.7細胞単層に付着した。バチルは、ワクチン接種されたNHPから試験血清でオプソナイズされ、(A)10μg PGGA-OMPC、(B)50 μg PGGA-OMPC、(C)50 μg PGGA-OMPC単独、または(D)OMPC単独で後押しされた。緑 = B. アントラシスエイムズ, 赤 = RAW 264.7 細胞.バー = 20 μm。広いフィールド画像は、40 x 0.6対物レンズとAxio Cam HRcカメラを用いたツァイスアクシオオブザーバーZ1顕微鏡で撮影されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.NHPのオソノ付着価は、PGGA-OMPC、5 μ 0μg PGGA-OMPC、50 μ g PGGA単独、またはOMPC単独でワクチン接種した。 グループあたり5匹の動物の幾何学的手段をグラフ化した。エラーバーは、PGGA単独と比較して、0.001≤SEM. * pを示します。p値は、LSDポストホック試験を用いてANOVAを用いて計算した。データはもともとChabotで公開されました, ら, 201620.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
カプセル系ワクチンは、多数の細菌病原体に対して有効性が示されており、多くはヒト25、26、27での使用に対してライセンスされている。これらのワクチンは、カプセルを標的とする抗体を生成することによって働き、これらの研究の多くはOPKAを用いて、抗体13、14、16、28、29のオソノ貪食機能を示す。バイオセーフティの懸念と作業の容易さのために、我々はB.アントラシスカプセルコンジュゲートでワクチン接種された動物からの抗体を評価するOAAを開発しました。B. アントラシス上のカプセルの存在は、付着および貪食症30を防ぐが、ワクチン接種動物からのセラを伴うバチル酸のオプソナイゼーションは、マクロファージ20,21への付着を誘導する。
OAAの場合、アドヒアランス活性は、内部化や殺しではなく、オプソニック活性を定量するために使用されます。これにより、OAAにいくつかの利点が与えきました。生きた生物の代わりに、殺されたパラホルムアルデヒドを蛍光標識したカプセル化バチルスを利用することができました。アルデヒド固定および蛍光標識による細菌表面への変化は、細菌のマクロファージへの全体的な付着を変えなかった。固定および標識されたバチルスは、生きたバチルス(データは示さない)と同じように付着性がなかった。カプセル化の程度は、文化によって異なり、同様の成長条件にもかかわらず全体的な付着に影響を与える可能性があります。したがって、単一の不活性化細菌ストックを使用することで、異なる日に、異なる実験セット間で行われる実験間で標準化が可能になります。これは、この研究で使用される20のNHPのセラと、今後の研究で生成されるセラを比較するのに役立ちます。最後に、RAW 264.7細胞を含むほとんどのマクロファージは、生きた病原体31によって産生される炭疽菌致死性毒素に敏感であり、生菌を本質的に問題としている。
RAW 264.7細胞の使用も標準化を促進した。我々は当初、OPKA、HL-60細胞で一般的に使用される細胞株を使用した。しかし、他の28,32によって報告されているように、ジメチルホルムアミドを使用して顆粒球に分化する際に困難が見つかりました。RAW 264.7細胞は、化学的に分化する必要がなくなり、接着性があり、顕微鏡ベースのOAAに適しているという利点があります。この細胞株は、細胞内病原体33、34、ならびにB.アントラシス31との多数の貪食研究で使用されてきた。マウス由来のRAW 264.7細胞の使用は、マウスFc受容体が他の種35に由来するIgGに対する結合特異性において無差別であるため、有利である。これにより、NHPからの抗カプセル抗体をマウス細胞株で評価することができました。
炭疽菌はまれですが、世界と米国の一部の地域で固有のものです。1つの懸念は、米国から供給されたFBSが、動物が土壌中の B.アントラシス 胞子または他のPGGA産生微生物にさらされた結果として、すでに抗カプセル抗体を含んでいる可能性があるということです。この問題に対処するために、使用した FBS ロットは事前にテストされました。熱不活化FBSの添加は、DMEM単独と比較して付着性が増加することがわかった(データは示されていない)。しかし、モルモット、サル、マウスまたはヒトからの熱不活化正常セラと比較して付着率が増加しなかった(データは示していない)。従って、我々が使用したFBSロットは、暴露の結果として抗カプセル抗体を含みませんでした。さらに、カプセル産生に必要なpXO2プラスミドを欠く菌株であるアン トラシス ・スターンでワクチン接種を受けた動物の結果として、抗カプセル抗体も含まない。テストされた FBS ロットは、後続のすべての OAA に使用されました。
この技術の限界は、膨大な時間と労力を要した実験室の人員によるバチルスと細胞の数え方のタスクです。このタイプの分析を行うソフトウェアを使用することで、これを修正できます。このソフトウェアは当時は利用できませんでした。しかし、手動カウントが必要であったため、重要なステップは、タスクを容易にするために、無関係および未接続のバチルの除去または洗い流しでした。また、低いバックグラウンドノイズにつながった試薬をテストする必要がありました。OAA はオポニゼーション36を強化するため、補数のソースが必要です。そこで、モルモット、ヒト、赤ちゃんウサギ補体を含む様々な補体源を試験しました。我々は、それが異球抗原に対して弱い、多特異的な活動を持っていないことがわかったので、我々は、我々のアッセイのために赤ちゃんウサギを補完することを選んだ、それは一般的にOPKA研究14、15、37で使用され、それは容易に商業的に入手可能である。
OAAは定量的で再現性の高いことがわかります。当社は、IgG総レベルのみを定量するが、機能的抗体と非機能的抗体を区別しない、エリサスなどのリガンド結合アッセイを含む研究を補完するために使用します。OAAは、他の機能アッセイ(例えば、血清殺菌活性および毒素中和アッセイ)を補完するために使用され、ワクチン生成抗体16、38の異なる機能性を示す。OAAの開発により、ワクチンや治療薬を評価するための免疫原性研究のレパートリーが増加しました。
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Disclosures
著者らは、利益相反を引き起こす可能性のある商業的または他の関連付けを持っていません。
Acknowledgments
J.チュア、D.シャボット、A.フリードランダーは、原稿に記載されている手順を設計しました。J.チュアとT.プトモン・テイラーが実験を行った。D. Chabot はデータ分析を実行しました。J.チュアは原稿を書いた。
著者らは、優れた技術支援のためにカイル・J・フィットに感謝します。
この作業は、国防脅威削減庁の助成金CBMによって支援されました。VAXBT.03.10.RD.015、プラン番号921175。
意見、解釈、結論、勧告は著者のものであり、必ずしもアメリカ陸軍によって承認されるとは限りません。本書の内容は、必ずしも国防総省の見解や方針を反映したものではなく、商号、商用製品、または組織に関する言及も、米国政府による支持を意味するものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
References
- Walters, M. N., Papadimitriou, J. M.
- Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144 (1883).
- Tauber, A. I.
- Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
- Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Candela, T., Fouet, A.
- Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
- Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
- Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
- Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
- Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
- Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
- Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
- Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
- Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
- List of Tier 1 BSAT. , Available from: www.selectagents.gov/ohp-app1.html (2017).
- Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
- Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
- Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
- Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
- Revised FSAP Policy Statement: Inactivated Bacillus anthracis and Bacillus cereus Biovar anthracis. , Available from: www.selectagents.gov/policystatement_bacillus.html (2017).
- Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, Suppl 1 1-9 (2013).
- Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
- Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
- Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
- Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400 (2019).
- Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250 (1999).
- Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J.
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
- Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
- Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
- Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
- Wolf, J. J. Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , Elsevier. 243-255 (2013).
