Summary
opsono-준수 분석법은 백신 개발에서 항체의 opsonic 기능을 평가하기 위한 opsono-phagocytic 살인 분석법에 대한 대안적 방법입니다.
Abstract
opsono 준수 분석법은 전문 식세포에 세균성 병원체의 부착을 열거하는 기능성 분석입니다. 준수는 phagocytosis와 살인에 필수이기 때문에, 분석법은 opsono-phagocytic 살인 분석의 대안 방법입니다. opsono 준수 분석의 장점은 여러 실험에 걸쳐 표준화를 허용하는 불활성화 된 병원체 및 포유류 세포주를 사용하는 옵션입니다. 분석에서 불활성화 된 병원체의 사용은 또한 생물 안전 수준 3 전염성 요원 및 기타 악성 병원균과 함께 작동을 용이하게합니다. 우리의 작업에서, opsono 준수 분석체는 탄저병 캡슐 기지를 둔 백신으로 면역화된 동물의 세라로부터 항체의 기능적 능력을 평가하기 위해 사용되었으며, 고정 된 바실러스 탄트라시스의 부착을 마우스 대식세포 세포주, RAW 264.7로 유도하는 데 사용되었습니다. 자동 형광 현미경 검사는 대식세포에 고부딩하는 바실리의 이미지를 캡처하는 데 사용되었습니다. 증가된 준수는 혈청에 있는 항체 항체의 존재와 상관관계가 있었다. 높은 혈청 항체 항체 농도를 전시한 비인간 영장류는 탄탈병 도전으로부터 보호되었다. 따라서, opsono-준수 분석체는 세라에서 항원 특이적 항체의 생물학적 기능을 해명하고, 백신 후보 및 기타 치료제의 효능을 평가하고, 면역의 가능한 상관관계로서 작용할 수 있다.
Introduction
병원체의 인식, 준수, 내재화 및 분해는 1883년 일리아 메치니코프가 처음 기술한 숙주 인내 면역 반응에서 현저한 통로인식세포증1,3에 필수적이다. 면역 계통의 그밖 세포뿐만 아니라 식세포 백혈구는 표적의 그들의 선택에 있는 높게 차별적입니다; 그들은 패턴 인식 수용체 (PRR)4,5의레퍼토리에 의해 병원균 관련 분자 패턴을 통해 "전염성 비 자기"와 "비 감염성 자아"를 구별 할 수 있습니다. 병원체의 숙주 인식은 또한 보완 및 항체6과같은 숙주 opsonins의 결합으로 발생할 수 있다. opsonization에게 불린 이 프로세스는, phagocytic 세포에 opsonic 수용체 (예를 들면, 보충 및 Fc 수용체)에 결합시 내성을 강화하는 이 분자로 병원체를 코팅합니다6. 병원체가 식세포에 부착하려면, 그들의 cognate 리간드와 다중 수용체의 집단 결합이 필요하다. 그런 다음에야 내산화6을 시작하기 위해 호스트 셀 내부의 신호 캐스케이드를 트리거하고 유지할 수있습니다.
병원균의 허가와 감염 예방에 있는 phagocytosis의 중요성 때문에, 세포외 병원체는 그들의 생존을 연장하기 위하여 이 과정을 전복하는 수많은 쪽을 개발했습니다. 중요도의 한 가지 전략은 음이온 중합체(예를 들어, 다당류 또는 폴리아미노산) 캡슐의 생산으로, 그 전하에 의한 항식세포이며, 면역성이 좋지 않으며, PRRs6,7로부터세균용 봉투에 분자를 보호한다. Cryptococcus neoformans 및 연쇄상 구균 폐렴과 같은 병원체는 사카라이드 폴리머로 구성된 캡슐을 가지고 있는 반면, 황색포도상구균 표피증 및 일부 바실러스 종은 폴리 ɣ 글루타믹 산 (PGGA)7,8을생산한다. 그러나 그밖 병원체는 비 전염성 자기를 닮은 캡슐을 생성합니다. 예를 들어, 연쇄상구균 표겐과 B. 세레우스의 병원성 균주는 항식세포뿐만 아니라 면역계통9,10에의해 외국으로 인식되지 않을 수 있는 히알루론산 캡슐을 갖는다.
캡슐을 운반대 단백질로 유도하여 가난한 T-독립적인 항원에서 높은 혈청 항체 티터를 유도할 수 있는 면역성 T 의존성 항원으로 변환한다11,12. 이 전략은 S. 폐렴, 혈우병 인플루엔자, 니세리아 수막기티드11에대한 허가된 백신에 사용된다. 항체의 opsonic 활동은 일반적으로 opsono-phagocytic 살인 분석서(OPKA)13,14,15,16에의해 평가되었다. 이러한 작용성 항체가 식세포증을 유발하고14명을죽일 수 있는지 여부를 테스트합니다. 그러나, B. 탄트라시스17을포함하여 Tier 1 생물학 선택 에이전트 및 독소 (BSAT)와 같은 전염성 병원체를 가진 OPKA의 사용은 위험하고 보안 위험을 제시합니다; 이러한 에세이는 선택 에이전트의 광범위한 처리가 필요합니다. 선택 에이전트 처리는 제한된 생물 안전 수준 3 (BSL-3) 실험실에서만 수행 할 수 있습니다; 이러한 분야에서의 업무는 따라야 할 수많은 안전 및 보안 예방 조치로 인해 장기간 운영 절차를 요구합니다. BSL-3 실험실은 또한 현미경 및 세포계와 같은 OPKA 작업에 사용되는 특수 장비를 전형적으로 갖추지 않습니다. 따라서, 우리는 불활성화박테리아(18),19의사용에 기초하여 대안적 분석체를 개발하였다. 우리는 이것을 내면화와 살인에 의존하지 않는 opsono 준수 분석 (OAA)로 지칭합니다. 대신, 편화불활성 병원균의 준수는 식세포증의 지수로 사용된다. 기계적으로, OAA는 준수가 선견자를 발생하고 내재화 및 세포 내 살인과 밀접하게 얽혀 있기 때문에 적합한 대체품입니다. 생물안전적 관점에서, OAA는 전염하는 제제의 최소한의 취급이 필요하고, OPKA보다 더 짧은 지속 시간의 실험적이며, 불활성화 된 병원체의 재고가 생산및 옮겨진 후 BSL-2 실험실에서 수행 될 수 있기 때문에 선호된다.
우리는 캡슐 공주게이트로 예방 접종된 비인간 영장류(NHP)의 혈청에서 발견되는 항체의 opsonic 기능을 검사하기 위해 OAA의 활용을 입증한다[즉, B. 탄트라시스로부터 PGGA] 네이세리아 수막의외부 막 단백질 복합체(OMPC)에 공각]20. 혈청 협소화 된 바실리는 부착 된 마우스 대식세포 세포주, RAW 264.7로 배양되었다. 고정 후, 세포 단층 및 부착 된 바실리는 형광 현미경 검사법에 의해 이미지되었다. 세균성 준수는 세균성 준수가 대조군혈청(20)에비해 캡슐 컨쥬게이트로 예방 접종된 NHPs로부터 혈청으로 배양되었을 때 증가하였다. 탄집 도전20,21의생존과 상관 관계가 있는 준수. 따라서, OAA의 사용은 항체항체의 기능을 특징으로 하고 백신 후보의 시험을 크게 촉진시켰다.
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Protocol
동물 복지법, 공중 보건 서비스 정책 및 동물과 관련된 기타 연방 법령 및 규정에 따라 여기에 설명 된 연구는 기관 동물 관리 및 사용위원회 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 연구가 수행 된 시설은 국제 실험실 동물 관리협회의 인증을 받았으며 실험실 동물의 치료 및 사용 가이드, 국립 연구 위원회, 201124에명시된 원칙을 준수합니다.
1. 세포주 배양 및 유지 보수, RAW 264.7
참고: 무균 기술로 다음 절차를 수행해야 합니다.
- 56°C 수조에서 태아 소 혈청(FBS)을 30분 동안 가열하여 보완합니다.
참고: FBS가 56°C에 도달하면 30분의 비활성화 시간이 시작됩니다. 온도를 모니터링하려면 동일한 수조의 비커에 비슷한 양의 물을 가열합니다. 물이 56°C에 도달하면 FBS에 대한 30분 카운트다운을 시작합니다. 또는 열 비활성화된 FBS도 시판됩니다. - 90% DMEM과 높은 포도당 및 10% 열 비활성화 FBS(v/v)를 결합하여 RAW 264.7 세포에 대한 배지를 준비한다. L-글루타민을 6mM의 최종 농도에 추가합니다.
참고 : 높은 포도당DMEM은 4 mM L-글루타민으로 제조됩니다. L-글루타민을 6mM로 보충하는 것은 일관된 세포 성장을 촉진합니다. 100 U/mL 페니실린 과 100 μg/mL 연쇄 절제술은 오염을 방지하기 위해 첨가될 수 있다. 또 다른 일반적인 뮤린 세포주, J774A.1, 또한 사용 될 수 있으며 유사한 조건하에서 성장. - 37°C 수조에서 냉동 된 세포 유리병을 해동하고 녹자마자 욕조에서 제거하십시오. 원적 튜브에 5mL 완성 매체에 무균으로 내용을 추가합니다. 원추형 튜브를 두 번 반전시키고 300 x g에서 펠릿 세포까지 5분 동안 회전합니다.
- 진공에 부착된 멸균 파스퇴르 파이펫을 사용하여 흡인 매체를 사용하여 동결제를 제거합니다. 신선한 배지의 5mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
- 플라스크 또는 접시를 치료한 조직 배양으로 현탁액을 옮기. 플라스크의 바닥을 완전히 덮고 세포를 균등하게 분배할 수 있는 충분한 매체를 추가합니다. "1"로 시작하는 통로 번호를 나타냅니다.
- 37°C에서 세포를 배양하여 5% CO2의 존재와 습도가 95% ~ 100% 연결성에 도달한다. 인큐베이션의 둘째 날부터 현미경으로 매일 세포를 확인하십시오. 세포가 들어 올리고 죽게 하기 때문에 세포가 도달하도록 허용하지 마십시오.gt;100% 합류.
참고: 합류에 도달하는 데 필요한 시간은 얼마나 많은 라이브 세포가 도금되었는지, 플라스크의 성장 영역에 따라 달라집니다. 따라서, 매일 세포를 확인하는 것이 신중하다. - 스크레이핑 사이에 적어도 이틀간의 성장을 허용하는 신선한 배지에서 세포 육수를 긁고 희석하여 서브배양 세포. 각 하위 문화권에서 통로 수를 1로 늘립니다.
참고: 다음 날 통과되고 즉시 긁으면 시간이 지남에 따라 일반 셀 준수가 더 빨라집니다. RAW 264.7 셀은 대략 15항까지만 사용해야 한다. - OAA 분석에 대 한 RAW 264.7 세포를 플레이트하려면, 신선한 매체로 교체 하 고 부드럽게 플라스크에서 세포를 긁어 세포 를 긁어 세포 스크레이퍼를 사용 하 여. 파이펫을 위아래로 분해하여 세포 응고를 쉽게 만듭니다.
참고: RAW 264.7을 세분화하는 기존의 방법은 긁어내는 것입니다. 우리의 경험에서 트립신을 사용하면 RAW 264.7 셀이 긁는 것보다 시간이 지남에 따라 준수를 잃게됩니다. - 셀을 계산하려면 동일한 양의 셀과 trypan blue 용액을 희석합니다. 혈류계에 10 μL을 적재합니다. 10배 객관적렌즈를 사용하여 반전된 복합 현미경을 사용하여 염료를 배제하는 살아있는 세포의 수를 관찰하고 계산한다.
- 플레이트 1.4 x 104 96 에서 잘 당 실행 가능한 셀 0.15 μm 두께의 유리 평면 바닥 플레이트 (플레이트 #1). 세포가 3일 동안 성장할 수 있도록 합니다. OAA를 수행하기 전에 하루 동안 소비된 매체를 교체하십시오.
참고: 3일 간의 인큐베이션 후 셀 수는 약5 x 10 4/well이어야 합니다.
2. 세균 문화와 준비
참고 : 이 프로토콜에 사용되는 세균성 종은 캡슐화된 악성 균주, B. 탄트라시스 에임스입니다. 이 종과의 모든 조작은 적절한 생체 안전 및 보안 허가를 필요로하며 BSL-3 실험실에 위치한 클래스 II 또는 클래스 III 생물학적 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. BSL-3 작업에 대한 제도적 운영 절차를 따르고 박테리아를 취급할 때 개인 보호 장비를 사용할 수 있습니다.
- 1L물에 37g BHI 분말을 용해하고 15분 동안 121°C에서 오토클레이브하여 뇌 심장 주입(BHI) 국물을 준비합니다. 주변 온도에서 국물을 저장합니다.
- 물에 8% 중탄산나트륨 용액을 준비하고 0.20 μm 필터 주사기를 사용하여 살균한다. 용액을 4°C로 저장하고 1일 이내에 사용하십시오.
- 영양 국물 8g, 효모 추출물 3g, 15g의 한마고를 1L 물에 섞어 NBY 한천 판을 준비합니다. 121 °C에서 15 분 동안 오토 클레이브. 페트리 접시에 붓고 굳어두는 다. 4 °C에서 접시를 보관하십시오.
참고: NBY 한천 플레이트는 중탄산나트륨 유무에 관계없이 만들 수 있습니다. 국물 및 한천 판에 중탄산나트륨을 첨가하여 캡슐화된 바실리로 구성된 점막 식민지의 성장을 유도한다. 액체 및 고체 매체 모두에서 중탄산나트륨의 최종 농도는 0.8%입니다. - 50% 오토클레이브 BHI 국물, 40% FBS 및 10% 중탄산나트륨 용액(v/v)을 혼합하여 B. 탄트라시스에 대한 배양 국물을 준비합니다.
참고 : 이 국물은 캡슐화된 바실리의 짧은 사슬을 생성하도록 제조되었습니다. - 물자에서 배양하기 하루 전에 포자 스톡에서 NBY 한천 접시에 절연을 위해 줄무늬로 B. 탄트라시스의 마스터 플레이트를 준비합니다. 37 °C에서 인큐베이션.
- B. 탄트라시스의여러 식민지와 환기 250 mL 플라스크에서 문화 국물의 30 mL 접종.
참고: 여기에 명시된 바와 같이 국물의 표면 비에 대한 특정 부피는 최대 캡슐화된 바실리를 생성하기 위해 필요합니다. - 국물 배양을 125rpm, 37°C에서 20% CO2, 습도 18-24h로 흔들어 주세요.
참고: 37°C 이상의 온도에서 B. 탄트라시스가 증가하여 캡슐 생산을 저해할 수 있습니다. - 충분한 캡슐화를 보장하기 위해 인도 잉크와 부정적인 염색을 사용하고 바실리가 고정하기 전에 짧은 사슬 (1-5 bacilli / 체인)에 있습니다 (섹션 3 참조).
- 식민지 형성 단위 (CFU)를 결정하기 위해, 연속적으로 배양 100 μL을 희석 1:10 인산염 완충식 식염수 (PBS) 용액 및 양 혈액 천막 판에 플레이트 배양 희석. 37°C에서 12-18h의 인큐베이션을 사용할 수 있습니다. CfUs를 계산하고 문화의 mL 당 박테리아의 수를 결정합니다.
참고: 박테리아가 고정되면 현미경의 밑에 혈종계를 사용하여 계산은 또한 수행될 수 있습니다. 그러나, 이것은 바실리가 낮은 배율하에서 보기 어렵기 때문에 권장되지 않습니다. - 16% 파라포름알데히드(PF)를 세균 배양의 전체 부피에 4% PF의 최종 농도로 첨가하여 바실리를 고치게 한다. 7일 동안 주변 온도에서 셰이커를 천천히 동요합니다.
참고: 4% PF에서 7일간의 인큐베이션은 식물성 간균 을 고정하기 위한 USAMRIID 제도적 표준 운영 절차를 기반으로 합니다. - 멸균에 대한 고정 및 테스트를 제거하기 위해 50mL 원심관에서 고정 세균 서스펜션의 4mL(10% 부피)을 45분 동안 ≥3000 x g에서 원심분리하고 PBS로 30mL/wash를 사용한다. 나머지 샘플을 4°C에서 4% PF에 저장합니다.
참고 : 펠릿 후, 세균성 펠릿은 캡슐의 존재로 인해 푹신푹신합니다. 세탁 하는 동안 펠 릿을 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 실행 가능성 테스트를 방해하지 않도록 모든 고정을 제거해야합니다. 필요한 경우 세하 수를 늘립니다. - 생존성 검사를 위해, 4mL의 세척현탁액(국물량의 ≤ 10%)을 가진 세균성장 배지(예를 들어 BHI 국물)의 40mL를 접종하고 7일 동안 37°C에서 배양한다. 탁도를 측정하기 위해 7일 전후 600nm에서 광학 밀도를 확인합니다.
- 국물 배양 7일 후, 접시≥100 μL의 국물을 한천판에 ≥ 7일 동안 배양한다. 탁도가 증가하지 않고 플레이트에 대한 성장이 보이지 않으면 원래 배양은 멸균으로 간주되며 BSL-2 실험실로 옮겨질 수 있습니다.
참고: 연방 선택 에이전트프로그램(22)은 불활성화된 B. 탄트라시스가 샘플의 완전한 멸균을 입증한 후에만 BSL-3 실험실에서 전송될 수 있음을 규정하고 있습니다. 불활성화 된 B. 탄트라시스에 대한 생존 성 테스트는 7 일 동안 국물에 있는 샘플의 10 %를 배양한 다음 7 일22,23일 다른 고체 배지에서 배양하는 것으로 구성됩니다. 불임이 확립되면 기관 지침을 따라 이전 승인을 받을 수 있습니다.
3. 캡슐화 및 간실리 사슬을 관찰하는 부정적인 염색 및 가벼운 현미경 검사법
- 5 μL 세균 현탁액을 현미경 슬라이드에 인도 잉크 2 μL과 혼합합니다. 거품을 만들지 않고 서스펜션 위에 1 또는 1.5 μm 두께의 커버 글래스를 놓습니다.
참고: 매니큐어는 커버 글래스를 슬라이드에 밀봉하는 데 사용될 수 있습니다. - 가벼운 현미경에서 40x 에서 100x 오일 객관적 렌즈를 사용하여 세균 현탁액을 관찰하십시오. 각 박테리아를 둘러싼 클리어런스 영역(캡슐제외 인도 잉크)을 관찰하고 박테리아 사슬이 짧다는 것을 바실리가 캡슐화되었는지 확인하십시오.
4. 박테리아의 FITC 라벨링
- 2 mg/mL의 농도로 디메틸 설프리산화물에 형광균 이소티오야네이트(FITC)를 용해하십시오.
- 불활성화 된 세균 재고의 양을 측정합니다.
- PBS에서 스톡을 3배 세척하여 고정을 제거합니다.
- 75 μg/mL의 최종 농도에서 FITC 솔루션을 추가합니다. 4°C에서 18-24h의 혼합물을 천천히 동요합니다.
- 세 번 ≥3000 x g, 45 분에서 펠릿과 30 mL PBS / 세척을 사용하여 과도한 FITC를 제거하여 박테리아를 씻으십시오. 푹신한 펠릿이 세탁 중에 방해받지 않도록 하십시오. 동일한 시작 볼륨에서 PBS에서 바실리를 다시 중단합니다.
- Aliquot 및 사용 전까지 -20°C의 마이크로튜브에 바실리를 저장합니다. 바실리가 캡슐을 잃을 수 있기 때문에 바실리를 여러 번 동결/해동하지 마십시오.
5. 세균 성 편화
- 열은 열 블록에서 30 분 동안 56 °C에서 소량의 테스트 세라 (NHP에서)를 비활성화합니다.
- 3-5 분 동안 15000 x g에서 펠릿하여 PBS 2x로 FITC 라벨박테리아를 해동하고 세척하십시오. PBS에서 동일한 시작 볼륨으로 다시 일시 중지합니다.
- 96웰 원형 바닥 플레이트(플레이트 #2)에서, 세포 배지에서 연속적으로 테스트 세라를 희석시. 또 다른 96 개의 잘 둥근 바닥 플레이트 (플레이트 #3)에서 각 우물에 희석 된 테스트 세라 10 μL을 추가하십시오.
참고 : 모든 접시에서 PBS와 일반 원숭이 세라가 희석 된 테스트 세라 대신 에 포함되었습니다. 또한 하나의 테스트 세럼을 긍정적인 컨트롤로 선택하여 다른 날에 수행된 모든 분석방법을 정규화하는 표준 곡선을 생성했습니다. 양성 제어 테스트 혈청은 풍부했기 때문에 임의로 선택되었습니다. - 플레이트 #3 10 μL 갓 재구성된 아기 토끼 를 추가하십시오.
참고: 일단 재구성되면 남은 아기 토끼 를 폐기하십시오. 재고정 및 해동하지 마십시오. - 플레이트 #3, 1:20의 감염의 복합성에 대한 FITC 라벨 바실리의 적절한 볼륨을 추가합니다. 예를 들어 5 x 104 x 20 바실리를 포함하는 부피를 5 x 104 세포에 추가합니다. 총 105 μL에 셀 배지의 적절한 부피와 #3 플레이트에서 각 우물을 위로.
참고: 세포를 포함하는 플레이트 #1, 빈 부피로 나머지 5 μL와 함께 공손화 된 박테리아의 100 μL을 수신합니다. 우리는 테스트 세라의 각 희석을 복제하여 테스트했습니다. - 37°C에서 30분 동안 30분 동안 배양판이 #3 습도가 있는CO25%의 존재하여 바실리를 오손화한다.
6. 포유류 세포의 준수 분석 및 형광 라벨링
- 사용하기 전에 모든 시약을 37 °C에서 유지하십시오.
- 37°C 열 블록에 부착 셀이 포함된 플레이트 #1 놓습니다.
- 멀티채널 피펫터를 사용하여 우물에서 소비된 매체를 제거하고 플레이트 #3 100 μL의 공진균으로 빠르게 교체하십시오. 파이펫팅 중에 우물에서 거품이 생성되지 않았는지 확인합니다. 인큐베이션 플레이트 #1는 37°C에서 5% CO2, 습도가 30분 동안 준수합니다.
- 37°C 열 블록 위에 150 μL PBS로 각 우물 5배를 세척하여 부착되지 않은 바실리를 제거합니다.
참고: 세척 중에 셀이 실수로 분산되지 않도록 주의해야 합니다. - PBS 1:4로 16% PF를 희석하여 4% PF를 만듭니다. 각 웰에 150 μL을 추가하여 1h에 4% PF로 셀을 수정합니다. PBS로 셀 2배 세척.
- 10mL PBS에 2 μL HCS (고함량 스크리닝) 오렌지 셀 스테인을 혼합합니다. 이 염색 용액의 150 μL을 고정 된 세포에 추가하고 주변 온도에서 30 분 동안 배양하십시오.
- PBS로 우물 2배 세척.
- 현미경 검사법까지 4 °C에 보관하십시오.
7. 현미경 검사법
참고: 일반적으로 고처리량 자동 형광 현미경은 OAA에 대한 이미징을 용이하게 합니다. 자동화 된 시스템을 사용할 수없는 경우, 부착 된 간실리의 형광 이미지는 수동으로 촬영 할 수있다21. 본연구에서는 20,부착된 바실리 및 세포 단층은 특수 장비를 갖춘 자이스 700 레이저 스캐닝 현미경 시스템을 사용하여 이미지화되었다; 우리의 시스템은 자동화 된 단계, 명확한 초점 모듈, 40 x NA 0.6 목표, 악시오 캠 HRc 카메라와 젠 2012 (블루 에디션) 소프트웨어가 장착 된 자이스 악시오 옵저버 Z1 반전 현미경으로 구성되었다. 획득한 이미지는 공초점 이미지가 아닌 와이드필드 이미지입니다. 다음 프로토콜은 다양한 자동화 된 현미경 시스템에 적용되는 기본 현미경 설정으로 설계되었습니다.
- 30 분 동안 주변 온도에서 #1 인큐베이션 플레이트. 현미경 및 관련 장비를 켭니다.
참고: 주변 온도에서 의적응하면 이미징 중에 유리 판에 응축이 형성되는 것을 방지할 수 있습니다. 또한 온도 변화로 인한 디포커싱을 방지합니다. - 스테이지에 플레이트를 놓고 밝은 필드 또는 위상 대비를 사용하여 세포에 집중하십시오.
- 플레이트 설정으로 96의 잘 포맷을 선택합니다. 채널 설정을 선택합니다.
참고: FITC의 피크 여기 및 방출 파장495/519 nm; HCS 오렌지 셀 얼룩은 556 및 572 nm입니다. 다른 형광은 현미경에서 사용할 수있는 필터에 따라 사용될 수있다. - 타일 모드로 설정을 선택합니다. 획득할 이미지 수를 나타냅니다.
참고: 타일링 기능을 사용하면 샘플에서 여러 위치를 잘 캡처할 수 있으며 타일 또는 임의 형식으로 이미지를 획득하도록 설정할 수 있습니다. 우리는 잘 당 10 임의의 영역을 이미지. - 획득 모드를 "흑백" 또는 "흑백" 또는 비닝 ≥ 2x2로 변경합니다.
참고: 비닝을 1x1에서 2x2 또는 4x4로 설정하면 미세 검사 속도가 빨라지지만 이미지해상도도 낮아집니다. OAA의 경우, 분석이 대식세포와 부착박테리아를 모두 내포할 때 이러한 설정을 사용하기에 충분합니다. - 자동 초점 또는 초점 모듈을 켭니다. 자동 초점 조정 함수를 수행하는 빈도를 나타냅니다. 사용 가능한 경우 Z 스택 기능을 켭니다. 세포 단층 및 부착 된 바실리의 두께를 캡처 할 Z 스택의 수를 나타냅니다.
참고: 선택한 Z 스택의 수는 현미경 검사법을 증가하지만 각 Z 스택에서 올바른 초점을 가진 이미지를 촬영합니다. - 이미지를 저장할 파일 폴더를 지정합니다. 자동화된 이미징 프로그램을 실행합니다.
8. 데이터 수집 및 분석
- 이미지당 부착된 바실리 및 포유류 세포의 수를 계산합니다. 간균의 각 사슬을 하나의 박테리아로 계산합니다.
- 적절한 통계 프로그램에서 표준 곡선을 생성하기 위해 양성 대조군 시험 혈청 및 티터(예를 들어, 1:10 희석은 10티터 단위)의 바실리/세포를 플롯한다.
- 비선형 회귀 곡선 피팅을 사용하여 양수 제어 테스트 세럼을 분석합니다. 그런 다음 양수 제어 테스트 혈청의 표준 곡선을 사용하여 나머지 샘플을 분석하여 해당 티터를 결정합니다.
참고: 일반적으로 티터를 결정할 때 표준 곡선의 중간 부근에 있는 샘플 희석을 선택하는 것이 가장 정확합니다. - 각 백신 그룹에서 샘플의 기하학적 평균을 계산합니다. ANOVA 분석의 가장 큰 차이로 로그 변환 된 티터의 P-값을 계산합니다.
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Representative Results
이 섹션은 OAA가 항체의 생물학적 기능을 검사하는 데 사용될 수 있음을 보여주는 결과와 함께 OAA 실험 중에 수집된 대표적인 현미경 사진을 보여줍니다. 여기서, 분석은 탄집병 백신 후보의 효능을 평가하기 위해 성공적으로 사용되었다. 캡슐화가 거의 또는 전혀 캡슐화되지 않아 숙주 세포를 고수하여 높은 배경을 생성하는 바실리에 캡슐화 상태를 확인하는 것이 중요합니다. 도 1은 캡슐화를 검사하기 위해 인도 잉크로 부정적으로 염색한 B. 탄트라시스 에임스의 이미지입니다. OAA는 여러 개의 인접 한 시야 필드를 조명하고 공초점 현미경 검사를 사용하는 경우 여러 스택 또는 단면을 필요로합니다. 따라서, 바실리가 너무 어둡거나 사진 표백제도 너무 빨리 인지 확인해야 합니다. 도 2는 FITC로 표시된 바실리의 이미지입니다. 도 3은 세포 단층층에 부착된 B. 탄트라시스 에임스의 최대 투영 이미지를 나타낸다. 이들은 OAA에 대해 계산되고 득점된 대표적인 시야 분야입니다. PGGA-OMPC 항세럼으로 배양된 바실리의 부착증가는 바실리를 오손화한 항캡슐 항체의 존재 때문이다. 도 4는 10 및 50 μg PGGA-OMPC로 예방 접종된 NHP의 혈청 타이터가 OMPC 및 PGGA만의 티터보다 현저히 높다는 것을 보여준다.
그림 1. 고정 B. 탄트라시스 에임스의 인도 잉크 이미지. 캡슐의 존재로 인해 바실리를 둘러싼 클리어런스 영역을 유의하십시오. 바 = 10 μm. 이 이미지는 100 x 1.4 수분 조리개(NA) 오일 객관적 렌즈가 있는 EVOS FL 자동화 현미경 시스템에서 촬영되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. FITC의 이미지는 고정 B. 탄트라시스 에임스 라벨. (왼쪽) 차동 간섭 대비 이미지; 녹색 (중간)에 형광 이미지 의사 색상; 병합(오른쪽). 바 = 10 μm. 공초점 이미지는 40 x 1.3 NA 오일 객관적 렌즈를 가진 자이스 700 LSM 공초점 현미경 검사법에서 촬영되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. B. 탄트라시스 에임스의 형광 이미지는 RAW 264.7 세포 단층층을 부착했다. 바실리는(A)10 μg PGGA-OMPC,(B)50 μg PGGA-OMPC,(C)50 μg PGGA 단독으로 또는(D)OMPC단독으로 증폭된 NHPs로부터의 시험 혈청으로 오손화되었다. 녹색 = B. 탄트라시스 에임스, 빨간색 = RAW 264.7 셀. 바 = 20 μm. 40 x 0.6 객관적렌즈와 악시오 캠 HRc 카메라가 있는 자이스 악시오 옵저버 Z1 현미경에서 와이드 필드 이미지가 촬영되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 1 μ 0g PGGA-OMPC, 50μg PGGA-OMPC, 50μg PGGA-OMPC, 50 μ g PGGA 단독으로 또는 OMPC로 예방 접종을 받은 NHP의 Opsono 준수 티터는 단독으로 예방 접종을 했습니다. 그룹당 5마리의 동물의 기하학적 수단이 그래프로 표시됩니다. 오류 막대는 PGGA에만 비해 SEM. *p ≤ 0.001을 나타냅니다. p 값은 LSD 사후 테스트를 통해 ANOVA를 사용하여 계산되었습니다. 데이터는 원래 Chabot, 외, 201620에게시되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
캡슐 계 백신은 수많은 세균 성 병원균에 대해 효과적인 것으로 나타났으며, 많은 사람들이 인간25,26,27에서사용하기 위해 허가된다. 이들 백신은 캡슐을 표적으로 하는 항체를 생성함으로써 작용하며 이들 연구의 대부분은 OPKA를 사용하여 항체13,14, 16,28,29의opsono-phagocytic 기능을 나타내고 있다. 생물 안전 문제와 작업 용이성으로 인해 B. 탄트라시스 캡슐 컨쥬게이트로 예방 접종된 동물의 항체를 평가하기 위한 OAA를 개발했습니다. B. 탄트라시스에 캡슐의 존재는 부착 및 phagocytosis(30)를방지하지만, 예방 접종 동물에서 세라와 바실리의 편화는 대식세포에 부착을 유도20,21.
OAA의 경우 내재화 및 살인이 아닌 준수 활동이 opsonic 활동을 양화하는 데 사용됩니다. 이것은 OAA에게 몇 가지 장점을 제공했습니다. 우리는 살아있는 유기체 대신 에캡슐화된 바실리를 형광으로 표기한 파라포름알데히드를 활용할 수 있었습니다. 알데히드 고정 및 형광 라벨링에서 세균 표면에 대한 변화는 대식세포에 대한 박테리아의 전반적인 준수를 변경하지 않았다; 고정 및 표지 된 바실리는 살아있는 바실리 (데이터가 표시되지 않음)보다 더 이상 신봉되지 않았습니다. 캡슐화의 정도는 문화에서 문화에 따라 다를 수 있으며 유사한 성장 조건에도 불구하고 전반적인 준수에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 단일 비활성화 된 세균 재고를 사용하면 다른 일 및 다양한 실험 세트에서 수행 된 실험전반에 걸쳐 표준화를 허용합니다. 이것은 우리의 곧 연구 결과에서 생성될 이 작품및 세라에 사용된 20개의 NHP에서 세라를 비교하기 위한 귀중한 이었습니다. 마지막으로, RAW 264.7 세포를 포함한 대부분의 대식세포는 살아있는병원균(31)에의해 생성된 탄저병 치명적인 독소에 민감하여 본질적으로 문제가 있는 살아있는 바실리를사용한다.
RAW 264.7 셀의 사용도 표준화를 용이하게 하였다. 우리는 처음에 OPKA, HL-60 세포에서 일반적으로 사용되는 세포줄을 사용했습니다. 그러나, 우리는 다른 사람에 의해보고 된 디메틸 포르마미드와 과립구로 차별화에어려움을발견28,32. RAW 264.7 세포는 화학적으로 분화될 필요가 없으며 부착되어 현미경 기반 OAA에 더 순종적이라는 장점이 있습니다. 이 세포주세포내병원균(33,34)과 B. 탄트라시스(31)를이용한 수많은 식세포증 연구에서 사용되어 왔다. 마우스로부터 유래된 RAW 264.7 세포의 사용은 마우스 Fc 수용체가 다른종(35)으로부터파생된 IgG에 대한 결합 특이성에서 난잡하기 때문에 유리하다. 이것은 우리가 murine 세포주로 NHP에서 항체를 평가하는 것을 허용했습니다.
탄트락스는 드물지만 세계 일부 지역과 미국의 일부 지역에서는 발병합니다. 한 가지 관심사는 미국에서 공급되는 FBS가 이미 토양에서 B. 탄트라시스 포자 또는 기타 PGGA 생산 미생물에 노출되는 동물의 결과로 항 캡슐 항체를 포함할 수 있다는 것입니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리가 사용한 FBS 부지는 사전 테스트를 거쳤습니다. 우리는 열 비활성화 FBS의 추가만 DMEM에 비해 준수를 증가 했다 발견 (데이터 표시 되지 않은). 그러나, 기니피그, 원숭이, 마우스 또는 인간으로부터의 열 불활성화 정상 세라에 비해 준수를 증가시키지 않았다(데이터는 도시되지 않음). 따라서, 우리가 사용한 FBS 로트는 노출의 결과로 항캡슐 항체를 포함하지 않았다. 또한, 캡슐 생산에 필요한 pXO2 플라스미드가 부족한 균주인 캡슐 산트라시스 스턴(Anthracis Sterne)으로 예방 접종을 받는 동물의 결과로 항캡슐 항체를 포함하지 않을 것이다. 테스트된 FBS 로트는 모든 후속 OAA에 사용되었습니다.
기술의 한계는 실험실 직원에 의해 bacilli와 세포를 계산하는 작업입니다, 시간과 노력의 엄청난 금액을했다. 이러한 유형의 분석을 가진 소프트웨어를 사용하여 바로잡을 수 있습니다. 이 소프트웨어는 시간에 우리에게 사용할 수 없습니다. 그러나 수동 계수가 필요했기 때문에 작업을 용이하게하기 위해 외부 및 부착되지 않은 간실리를 제거하거나 세척하는 것이 중요한 단계였습니다. 또한 배경 소음을 낮추는 시약을 테스트해야 했습니다. OAA는 opsonization36을향상시키기 때문에 보완의 소스를 필요로한다. 따라서 기니피그, 인간, 아기 토끼 를 포함한 다양한 보완 소스를 테스트했습니다. 우리는 이성애 항원에 대한 약하고 다중 특정 활동이 없는 것을 발견했기 때문에 우리의 분석에 대한 아기 토끼 보완을 선택했으며, OPKA 연구14,15,37에서일반적으로 사용되며, 상업적으로 쉽게 사용할 수 있습니다.
우리는 OAA가 정량적이고 매우 재현 적이라고 찾을 수 있습니다. 우리는 ELISA와 같은 리간드 결합 소와 관련된 연구를 보완하는 데 사용하며, 이는 총 IgG 수준을 정량화하지만 기능성 및 비기능성 항체를 구별하지 는 않습니다. OAA는 다른 기능성 흡사(예를 들어, 혈청 박액 및 독소 중화 작용제)를 보완하여 백신 생성항체(16,38)의상이한 기능을 보여주기 위해 사용될 수 있다. OAA의 발달은 백신과 치료법을 평가하기 위하여 면역genicity 연구 결과의 우리의 레퍼토리를 증가시켰습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 야기할 수 있는 상업적 또는 기타 협회가 없습니다.
Acknowledgments
J. 추아, D. 차봇, A. 프리들랜더는 원고에 설명된 절차를 설계했다. J. 추아와 T. 퍼트몬 테일러는 실험을 수행했다. D. Chabot은 데이터 분석을 수행했습니다. 제이 추아는 원고를 썼다.
저자는 우수한 기술 지원을 카일 J. Fitts 감사합니다.
이 작업은 국방 위협 감소 국 보조금 CBM에 의해 지원되었다. VAXBT.03.10.RD.015, 계획 번호 921175.
의견, 해석, 결론 및 권고사항은 저자의 의견이며 반드시 미 육군의 승인을 받지는 않습니다. 이 출판물의 내용은 반드시 국방부의 견해나 정책을 반영하지 않으며, 무역 이름, 상업용 제품 또는 조직에 대한 언급은 미국 정부의 지지를 의미하지도 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
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