Opsono-adherence assay för att utvärdera funktionella antikroppar i vaccinutveckling mot Bacillus anthracis och andra inkapslade patogener
Summary
Opsono-adherence-analysen är en alternativ metod till opsono-faagocytisk dödande analys för att utvärdera de opsoniska funktionerna hos antikroppar i vaccinutveckling.
Abstract
Opsono-adherence-analysen är en funktionell analys som räknar upp fastsättningen av bakteriella patogener till professionella fagocyter. Eftersom vidhäftning är nödvändiga för fagocytos och dödande, är analysen en alternativ metod till opsono-faagocytiska dödande analyser. En fördel med opsono-adherence-analysen är möjligheten att använda inaktiverade patogener och däggdjurscelllinjer, vilket möjliggör standardisering över flera experiment. Användningen av en inaktiverad patogen i analysen underlättar också arbetet med biosäkerhetsnivå 3 smittämnen och andra virulenta patogener. I vårt arbete användes opsono-adherence-analysen för att bedöma antikropparnas funktionella förmåga, från serum hos djur immuniserade med ett mjältbrandskapselbaserat vaccin, för att inducera vidhäftning av fast Bacillus anthracis till en musmakrofagcelllinje, RAW 264.7. Automatiserad fluorescensmikroskopi användes för att fånga bilder av bacilli som följer makrofager. Ökad vidhäftning korrelerades med förekomsten av antikroppar mot kapseln i serumet. Icke-mänskliga primater som uppvisade höga serum anti-kapsel antikropp koncentrationer skyddades från anthrax utmaning. Således kan opsono-adherence-analysen användas för att belysa de biologiska funktionerna hos antigenspecifika antikroppar i serum, för att utvärdera effekten av vaccinkandidater och andra terapier och för att fungera som en möjlig korrelering av immunitet.
Introduction
Erkännande, vidhäftning, internalisering och nedbrytning av en patogen är integrerade i phagocytos1, en framträdande väg i värd medfödda immunsvar som först beskrivs av Ilya Metchnikoff 18832,3. Fagocytiska leukocyter, liksom andra celler i immunsystemet, är mycket diskriminerande i sitt urval av mål. de kan skilja mellan “infektiöst icke-jag” och “icke-infektiöst jag” genom patogen associerade molekylära mönster genom sin repertoar av mönsterigenkänningsreceptorer (PRR)4,5. Värd erkännande av en patogen kan också uppstå med bindning av värd opsoniner, såsom komplement och antikroppar6. Denna process, kallad opsonisering, täcker patogenen med dessa molekyler, vilket förbättrar internaliseringen vid bindning till opsoniska receptorer (t.ex. komplement och Fc-receptorer) på fagocytiska celler6. För att en patogen ska hålla fast vid en faagocyt är kollektiv bindning av flera receptorer med deras cognate ligands nödvändig. Först då kan vidhäftningsutlösare och upprätthålla signalkaskader inuti värdcellen för att initiera internalisering6.
På grund av vikten av faagocytos vid clearance av patogener och förebyggande av infektion, har extracellulära patogener utvecklat många sätt att undergräva denna process för att förlänga deras överlevnad. En viktig strategi är produktionen av en anjonpolymerisk (t.ex. polysackarid eller polyaminosyra) kapsel som är anti-faagocytisk på grund av sin laddning, är dåligt immunogen och skyddar molekyler på bakteriehöljet från PRR6,7. Patogener som Cryptococcus neoformans och Streptococcus pneumoniae har kapslar bestående av sackaridpolymerer, medan Staphylococcus epidermidis och vissa Bacillus-arter producerar poly-ɣ-glutaminsyra (PGGA)7,8. Men andra patogener producerar kapslar som liknar det icke-infektiösa jaget. Till exempel har Streptococcus pyogener och en patogen stam av B. cereus en hyaluronsyrakapsel som inte bara är anti-fagocytisk utan som inte heller kan erkännas som främmande av immunsystemet9,10.
Konjugation av kapsel till bärarproteiner omvandlar dem från dåliga, T-oberoende antigener till mycket immunogena T-beroende antigener som kan inducera höga serum antikapselantikroppstitrar11,12. Denna strategi används för licensierade vacciner mot S. pneumoniae, Haemophilus influenzae, och Neisseria meningitides11. De opsoniska aktiviteterna hos antikapselantikroppar har ofta utvärderats med opsono-fagocytiska avlivningsanalyser (OPKA)13,14,15,16. Dessa analyser testar om funktionella antikroppar kan utlösa faagocytos och döda14. Användningen av OPKA med infektiösa patogener, såsom biologiska urvalsmedel och toxiner i tier 1 (BSAT), inklusive B. anthracis17,är dock farlig och utgör säkerhetsrisker. Dessa analyser kräver omfattande hantering av en utvald agent. Hantering av utvalda agenser kan endast ske i laboratorier med begränsad biosäkerhetsnivå 3 (BSL-3). arbete på dessa områden kräver utdragna driftsrutiner på grund av de många säkerhets- och säkerhetsåtgärder som måste följas. BSL-3-laboratorier är vanligtvis inte utrustade med den specialiserade utrustning som används för OPKA-arbete, såsom mikroskop och cytometrar. Således utvecklade vi en alternativ analys baserad på användningen av inaktiverade bakterier18,19. Vi hänvisar till detta som en opsono-adherence assay (OAA) som inte är beroende av internalisering och dödande analysutgångar; I stället används vidhäftning av opsoniserade inaktiverade patogener som ett index för faagocytos. Mekanistiskt är OAA en lämplig ersättning eftersom vidhäftning sker a priori och är intimt sammanflätad med internalisering och intracellulärt dödande. Ur ett biosäkerhetsperspektiv föredras OAA eftersom det kräver minimal hantering av ett smittämne, är experimentellt kortare än OPKA och kan utföras i BSL-2-laboratorier efter att ett lager av den inaktiverade patogenen har producerats och överförts.
Vi visar användningen av OAA för att undersöka den opsonic funktionen av anti-kapsel antikroppar som finns i serum av icke-mänskliga primater (NHPs) vaccineras med en kapsel konjugat [dvs PGGA från B. anthracis konjugeras till yttre membran protein komplexa (OMPC) av Neisseria meningitides]20. Serum opsonized bacilli inkuberades med en vidhäftande mus makrofag cellinje, RAW 264,7. Efter fixering, cell monolayer och vidhäftande bacilli var av fluorescens mikroskopi. Bakteriell vidhäftning ökade när bacilli inkuberades med serum från NHPs vaccinerade med kapselkonjugat jämfört med kontrollserum20. Vidhäftning korrelerad med överlevnad av myraxutmaningen20,21. Således karakteriserade användningen av OAA funktionen av antikroppar mot kapseln och underlättade kraftigt testning av vår vaccinkandidat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kapselbaserade vacciner har visat sig vara effektiva mot många bakteriella patogener, och många är licensierade för användning på människor25,26,27. Dessa vacciner verkar genom att generera antikroppar riktade mot kapseln och många av dessa studier använder OPKA för att visa de opsono-fagocytiska funktionerna hosantikropparna 13,14,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Chua, D. Chabot och A. Friedlander designade de procedurer som beskrivs i manuskriptet. J. Chua och T. Putmon-Taylor utförde experimenten. D. Chabot utförde dataanalys. J. Chua skrev manuskriptet.
Författarna tackar Kyle J. Fitts för utmärkt teknisk hjälp.
Arbetet stöddes av Försvarets hotreduceringsbyrå beviljar CBM. VAXBT.03.10.RD.015, plannummer 921175.
Åsikter, tolkningar, slutsatser och rekommendationer är författarnas och stöds inte nödvändigtvis av den amerikanska armén. Innehållet i denna publikation återspeglar inte nödvändigtvis försvarsdepartementets åsikter eller policyer, och inte heller innebär omnämnande av handelsnamn, kommersiella produkter eller organisationer godkännande av den amerikanska regeringen.
Materials
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
References
- Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
- Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144 (1883).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
- Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).
- Candela, T., Fouet, A. Poly-gamma-glutamate in bacteria. Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).
- Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
- Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
- Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
- Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
- Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
- Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
- Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
- Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
- Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
- Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
- Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
- Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
- Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
- Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
- . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition) Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011)
- Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, 1-9 (2013).
- Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
- Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
- Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
- Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400 (2019).
- Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250 (1999).
- Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. On the role of macrophages in anthrax. Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
- Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
- Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
- Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
- Wolf, J. J. . Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , 243-255 (2013).
