Summary
Opsono-adherence-analysen är en alternativ metod till opsono-faagocytisk dödande analys för att utvärdera de opsoniska funktionerna hos antikroppar i vaccinutveckling.
Abstract
Opsono-adherence-analysen är en funktionell analys som räknar upp fastsättningen av bakteriella patogener till professionella fagocyter. Eftersom vidhäftning är nödvändiga för fagocytos och dödande, är analysen en alternativ metod till opsono-faagocytiska dödande analyser. En fördel med opsono-adherence-analysen är möjligheten att använda inaktiverade patogener och däggdjurscelllinjer, vilket möjliggör standardisering över flera experiment. Användningen av en inaktiverad patogen i analysen underlättar också arbetet med biosäkerhetsnivå 3 smittämnen och andra virulenta patogener. I vårt arbete användes opsono-adherence-analysen för att bedöma antikropparnas funktionella förmåga, från serum hos djur immuniserade med ett mjältbrandskapselbaserat vaccin, för att inducera vidhäftning av fast Bacillus anthracis till en musmakrofagcelllinje, RAW 264.7. Automatiserad fluorescensmikroskopi användes för att fånga bilder av bacilli som följer makrofager. Ökad vidhäftning korrelerades med förekomsten av antikroppar mot kapseln i serumet. Icke-mänskliga primater som uppvisade höga serum anti-kapsel antikropp koncentrationer skyddades från anthrax utmaning. Således kan opsono-adherence-analysen användas för att belysa de biologiska funktionerna hos antigenspecifika antikroppar i serum, för att utvärdera effekten av vaccinkandidater och andra terapier och för att fungera som en möjlig korrelering av immunitet.
Introduction
Erkännande, vidhäftning, internalisering och nedbrytning av en patogen är integrerade i phagocytos1, en framträdande väg i värd medfödda immunsvar som först beskrivs av Ilya Metchnikoff 18832,3. Fagocytiska leukocyter, liksom andra celler i immunsystemet, är mycket diskriminerande i sitt urval av mål. de kan skilja mellan "infektiöst icke-jag" och "icke-infektiöst jag" genom patogen associerade molekylära mönster genom sin repertoar av mönsterigenkänningsreceptorer (PRR)4,5. Värd erkännande av en patogen kan också uppstå med bindning av värd opsoniner, såsom komplement och antikroppar6. Denna process, kallad opsonisering, täcker patogenen med dessa molekyler, vilket förbättrar internaliseringen vid bindning till opsoniska receptorer (t.ex. komplement och Fc-receptorer) på fagocytiska celler6. För att en patogen ska hålla fast vid en faagocyt är kollektiv bindning av flera receptorer med deras cognate ligands nödvändig. Först då kan vidhäftningsutlösare och upprätthålla signalkaskader inuti värdcellen för att initiera internalisering6.
På grund av vikten av faagocytos vid clearance av patogener och förebyggande av infektion, har extracellulära patogener utvecklat många sätt att undergräva denna process för att förlänga deras överlevnad. En viktig strategi är produktionen av en anjonpolymerisk (t.ex. polysackarid eller polyaminosyra) kapsel som är anti-faagocytisk på grund av sin laddning, är dåligt immunogen och skyddar molekyler på bakteriehöljet från PRR6,7. Patogener som Cryptococcus neoformans och Streptococcus pneumoniae har kapslar bestående av sackaridpolymerer, medan Staphylococcus epidermidis och vissa Bacillus-arter producerar poly-ɣ-glutaminsyra (PGGA)7,8. Men andra patogener producerar kapslar som liknar det icke-infektiösa jaget. Till exempel har Streptococcus pyogener och en patogen stam av B. cereus en hyaluronsyrakapsel som inte bara är anti-fagocytisk utan som inte heller kan erkännas som främmande av immunsystemet9,10.
Konjugation av kapsel till bärarproteiner omvandlar dem från dåliga, T-oberoende antigener till mycket immunogena T-beroende antigener som kan inducera höga serum antikapselantikroppstitrar11,12. Denna strategi används för licensierade vacciner mot S. pneumoniae, Haemophilus influenzae, och Neisseria meningitides11. De opsoniska aktiviteterna hos antikapselantikroppar har ofta utvärderats med opsono-fagocytiska avlivningsanalyser (OPKA)13,14,15,16. Dessa analyser testar om funktionella antikroppar kan utlösa faagocytos och döda14. Användningen av OPKA med infektiösa patogener, såsom biologiska urvalsmedel och toxiner i tier 1 (BSAT), inklusive B. anthracis17,är dock farlig och utgör säkerhetsrisker. Dessa analyser kräver omfattande hantering av en utvald agent. Hantering av utvalda agenser kan endast ske i laboratorier med begränsad biosäkerhetsnivå 3 (BSL-3). arbete på dessa områden kräver utdragna driftsrutiner på grund av de många säkerhets- och säkerhetsåtgärder som måste följas. BSL-3-laboratorier är vanligtvis inte utrustade med den specialiserade utrustning som används för OPKA-arbete, såsom mikroskop och cytometrar. Således utvecklade vi en alternativ analys baserad på användningen av inaktiverade bakterier18,19. Vi hänvisar till detta som en opsono-adherence assay (OAA) som inte är beroende av internalisering och dödande analysutgångar; I stället används vidhäftning av opsoniserade inaktiverade patogener som ett index för faagocytos. Mekanistiskt är OAA en lämplig ersättning eftersom vidhäftning sker a priori och är intimt sammanflätad med internalisering och intracellulärt dödande. Ur ett biosäkerhetsperspektiv föredras OAA eftersom det kräver minimal hantering av ett smittämne, är experimentellt kortare än OPKA och kan utföras i BSL-2-laboratorier efter att ett lager av den inaktiverade patogenen har producerats och överförts.
Vi visar användningen av OAA för att undersöka den opsonic funktionen av anti-kapsel antikroppar som finns i serum av icke-mänskliga primater (NHPs) vaccineras med en kapsel konjugat [dvs PGGA från B. anthracis konjugeras till yttre membran protein komplexa (OMPC) av Neisseria meningitides]20. Serum opsonized bacilli inkuberades med en vidhäftande mus makrofag cellinje, RAW 264,7. Efter fixering, cell monolayer och vidhäftande bacilli var av fluorescens mikroskopi. Bakteriell vidhäftning ökade när bacilli inkuberades med serum från NHPs vaccinerade med kapselkonjugat jämfört med kontrollserum20. Vidhäftning korrelerad med överlevnad av myraxutmaningen20,21. Således karakteriserade användningen av OAA funktionen av antikroppar mot kapseln och underlättade kraftigt testning av vår vaccinkandidat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I enlighet med djurskyddslagen, folkhälsopolitiken och andra federala lagar och förordningar om djur och djurförsök genomfördes den forskning som beskrivs här enligt ett institutionellt djurskydds- och användningskommitté-godkänt protokoll. Anläggningen där denna forskning utfördes är ackrediterad av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International och följer de principer som anges i Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, National Research Council, 201124.
1. Kultur och underhåll av cellinjen, RAW 264.7
OBS: Följande procedurer måste utföras med aseptiska tekniker.
- Värm fetala nötkreatursserum (FBS) i ett 56 °C vattenbad i 30 minuter för att inaktivera komplement.
OBS: Inaktiveringstiden på 30 min börjar när FBS når 56 °C. För att övervaka temperaturen, värm en liknande volym vatten i en bägare i samma vattenbad. När vattnet når 56 °C, börja nedräkningen på 30 minuter för FBS. Alternativt är FBS som har värmeaktiverats också kommersiellt tillgängligt. - Förbered medium för RAW 264,7 celler genom att kombinera 90% DMEM med hög glukos och 10% värme inaktiverad FBS (v/v). Tillsätt L-glutamin till en slutlig koncentration på 6 mM.
OBS: DMEM med hög glukos är formulerad med 4 mM L-glutamin. Komplettera L-glutamin till 6 mM främjar konsekvent celltillväxt. 100 U/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin kan tillsättas för att förhindra kontaminering. En annan vanlig murincelllinje, J774A.1, kan också användas och odlas under liknande förhållanden. - Tina en frusen flaska celler i ett 37 °C vattenbad och ta bort från badet så snart det smälter. Tillsätt innehållet aseptiskt till 5 ml komplett medium i ett koniskt rör. Invertera koniskt rör två gånger och snurra vid 300 x g i 5 min till pelletsceller.
- Aspirera medium med hjälp av en steril Pasteur-rörledning fäst vid ett vakuum för att avlägsna frysmedel. Återanvänd cellpellet i 5 ml färskt medium.
- Överför suspension till en vävnadskulturbehandlad kolv eller skål. Tillsätt tillräckligt med medium för att helt täcka kolvens botten och snurra för att fördela cellerna jämnt. Ange passagenummer som börjar med "1".
- Inkubera celler vid 37 °C i närvaro av 5% CO2 och fuktighet tills 95% till 100% sammanflöde uppnås. Kontrollera cellerna dagligen under mikroskopet som börjar med den andra inkubationsdagen. Låt inte cellerna nå >100% sammanflöde eftersom detta gör att cellerna lyfter och dör.
OBS: Den tid som behövs för att nå confluency beror på hur många levande celler som pläterades och kolvens tillväxtområde. Således är det klokt att kontrollera cellerna dagligen. - Subkulturceller genom att skrapa och späda ut cellbeståndet i färskt medium, vilket möjliggör minst två dagars tillväxt mellan skrapningar. Öka passagenumret med 1 med varje subkultur.
OBS: Om du passerar och omedelbart skrapar följande dag kommer det att leda till snabbare förlust av allmän cellanpassning över tid. RAW 264,7-celler får endast användas upp till ungefär 15 passager. - För att plätera RAW 264.7-celler för OAA-analysen, byt ut med färskt medium och använd en cellskrapa för att försiktigt skrapa bort celler från kolven. Pipett upp och ner för att bryta upp cellklumparna för enklare cellräkning.
OBS: Den traditionella metoden för att subkulturera RAW 264.7 är genom att skrapa. Enligt vår erfarenhet orsakar användningen av trypsin RAW 264.7 celler att förlora vidhäftning över tiden snabbare än med skrap. - Om du vill räkna celler späder du ut lika stora volymer celler och trypan blue-lösning. Ladda 10 μL på en hemocytometer. Observera och räkna antalet levande celler som utesluter färgämnet med hjälp av ett inverterat sammansatt mikroskop med en 10x objektiv.
- Plåt 1,4 x 104 livskraftiga celler per brunn i en 96 brunn 0,15 μm tjock glasplatta bottenplatta (platt #1). Låt cellerna växa i 3 dagar. Byt ut förbrukat medium en dag innan du utför OAA.
OBS: Efter 3 dagars inkubation bör antalet celler vara cirka 5 x 104/brunn.
2. Bakteriekultur och preparat
OBS: De bakteriearter som används i detta protokoll är en inkapslad virulent stam, B. anthracis Ames. Alla manipuleringar med denna art kräver lämpliga säkerhets- och säkerhetsgodkännanden och skall utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp av klass II eller klass III i ett BSL-3-laboratorium. Följ institutionella rutiner för BSL-3-arbete och för användning av personlig skyddsutrustning vid hantering av bakterier.
- Förbered hjärnhjärtainfusion (BHI) buljong genom att lösa upp 37 g BHI-pulver i 1 L vatten och autoklavering vid 121 °C i 15 min. Förvara buljongen vid rumstemperatur.
- Bered 8% natriumbikarbonatlösning i vatten och sterilisera med en 0,20 μm filterspruta. Förvara lösningen vid 4 °C och använd den inom 1 dag.
- Blanda 8 g näringsbuljong, 3 g jästextrakt och 15 g agar i 1 L vatten för att förbereda NBY agarplattor. Autoklav vid 121 °C i 15 min. Häll i petriskålar och låt stelna. Förvara plåtarna vid 4 °C.
OBS: NBY agarplattor kan tillverkas med eller utan natriumbikarbonat. Tillsats av natriumbikarbonat till buljong och agarplattor inducerar tillväxten av mucoidkolonier bestående av inkapslad bacilli. Slutlig koncentration av natriumbikarbonat i både flytande och fasta medier är 0,8%. - Förbered kulturbuljong för B. anthracis genom att blanda 50% autoklaverad BHI-buljong, 40% FBS och 10% natriumbikarbonatlösning (v/v).
OBS: Denna buljong är formulerad för att producera korta kedjor av inkapslad bacilli. - Förbered en master plate av B. anthracis genom att strecka den för isolering på en NBY agarplatta från en sporbuljong en dag innan du odlar i buljong. Inkubera vid 37 °C.
- Inokulera 30 ml kulturbuljong i en ventilerad 250 ml kolv med flera kolonier av B. anthracis.
OBS: Ett specifikt volym-till-ytförhållande av buljong, som anges här, behövs för att producera maximalt inkapslad bacilli. - Skaka buljongkulturen vid 125 varv/min, 37 °C med 20 % CO2 och luftfuktighet i 18–24 timmar.
OBS: Odling B. mjältbrand vid temperaturer över 37 °C kan hämma kapselproduktionen. - Använd negativ färgning med Indien bläck för att säkerställa tillräcklig inkapsling och att bacilli är i korta kedjor (1-5 bacilli/kedja) före fixering (se avsnitt 3).
- För att bestämma koloniformningsenheter (CFU), späd 100 μL kultur 1:10 i Fosfat buffrad saltlösning (PBS) och plattkulturutspädningar på fårblod agarplattor. Inkubera i 12–18 timmar vid 37 °C. Räkna CFUs och bestämma antalet bakterier per ml kultur.
OBS: Räkning kan också utföras med hjälp av en hemocytometer under mikroskopet när bakterierna har åtgärdats. Detta rekommenderas dock inte eftersom bacilli är svåra att se under låg förstoring. - Tillsätt 16% paraformaldehyd (PF) till hela volymen bakteriekultur vid en slutlig koncentration av 4% PF för att fixa bacilli. Rör långsamt om på en skakapparat vid omgivningstemperatur i 7 dagar.
OBS: Sju dagars inkubation i 4% PF är baserad på USAMRIID institutionella standard operativa förfarande för att fixa vegetativ bacilli. - För att ta bort fixeringen och testet för sterilitet, tvätta tre gånger 4 ml (10% volym) av fast bakteriell suspension i ett 50 ml koniskt rör genom centrifugering vid ≥3000 x g i 45 min och använd en 30 ml / tvätt med PBS. Förvara det återstående provet i 4 % PF vid 4 °C.
OBS: Efter pelletering är bakteriepelleten fluffig på grund av närvaron av kapseln. Var försiktig så att du inte stör pelleten under tvätten. Det är nödvändigt att ta bort alla fixativ så att det inte stör lönsamhetstestningen. Om det behövs, öka antalet tvättar. - För livsduglighetstestning, inokulera 40 ml av ett bakteriellt tillväxtmedium (t.ex. BHI-buljong) med 4 ml tvättad suspension (≤ 10% av buljongvolymen) och inkubera vid 37 °C i 7 dagar. Kontrollera optisk densitet vid 600 nm före och efter 7 dagar för att mäta grumlighet.
- Efter 7 dagars inkubation i buljongkultur, ≥ 100 μL buljong på en agarplatta och inkubera i ytterligare 7 dagar. Om ingen ökning av grumlighet och ingen tillväxt på tallrikar ses, anses den ursprungliga kulturen steril och kan överföras till ett BSL-2-laboratorium.
OBS: Federal Select Agent Program22 föreskriver att inaktiverad B. anthracis endast kan överföras från BSL-3 laboratorier efter att ha visat fullständig sterilitet av provet. Livsduglighetstestning för inaktiverad B. anthracis består av odling av 10% av provet i buljong i 7 dagar följt av odling på fast medium i ytterligare 7 dagar22,23. Följ institutionella riktlinjer för att få överföringsgodkännande när sterilitet har fastställts.
3. Negativ färgning och lätt mikroskopi för att observera inkapsling och bacillikedjor
- Blanda 5 μL bakteriell suspension med 2 μL Indien bläck på en mikroskopbild. Placera ett 1 eller 1,5 μm tjockt täckglas ovanpå fjädringen utan att skapa bubblor.
OBS: Nagellack kan användas för att täta täckglaset på rutschkanan. - Observera bakteriesuspensionen med en 40x till 100x oljemållins på ett ljusmikroskop. Se till att bacilli är inkapslad genom att observera en frigångszon (kapseln utesluter Indien bläck) som omger varje bakterie och att bacillikedjorna är korta.
4. FITC-märkning av bakterier
- Lös fluorescein isothiocyanate (FITC) i dimetylsulfoxid vid en koncentration av 2 mg/ml.
- Mät volymen inaktiverat bakterielager.
- Tvätta buljongen 3x i PBS för att ta bort fixeringsmedel.
- Tillsätt FITC-lösning vid en slutlig koncentration på 75 μg/ml. Rör långsamt om blandningen i 18–24 timmar vid 4 °C.
- Tvätta bakterierna tre gånger genom pelletering vid ≥3000 x g, 45 min och använd 30 ml PBS/tvätt för att avlägsna överflödig FITC. Se till att den fluffiga pelleten inte störs vid tvätt. Återanvänd bacilli i PBS i samma startvolym.
- Aliquot och förvara bacilli i mikrorör vid -20 °C tills den används. Frys/tina inte bacilli flera gånger eftersom bacilli kan förlora kapseln.
5. Bakteriell opsonisering
- Värme inaktiverar en liten volym testsera (från NHPs) vid 56 °C i 30 minuter i ett värmeblock.
- Tina och tvätta FITC-märkta bakterier med PBS 2x genom pelletering vid 15000 x g i 3–5 min. Återanvänds i PBS i samma startvolym.
- I en 96 väl rund bottenplatta (#2), seriespädd testsera i cellmedium. I en annan 96 väl rund bottenplatta (#3), tillsätt 10 μL utspädd testsera i varje brunn.
OBS: I varje platta inkluderades PBS och normal apsera i stället för utspädd testsera som negativa kontroller. Vi valde också ett testserum som en positiv kontroll för att generera en standardkurva för att normalisera alla analyser som görs på olika dagar. Positiva kontroll test serum valdes godtyckligt eftersom det var rikligt. - För att #3, tillsätt 10 μL nyrenbildat babykaninkomplement.
OBS: När den har rekonstituerats, kassera återstående babykaninkomplement; Frys inte och tina. - För att #3, tillsätt lämplig volym FITC-märkt bacilli för en multiplicitet av infektion på 1:20. Lägg till exempel till volymen som innehåller 5 x 104 x 20 bacilli för 5 x 104 celler. Toppa varje brunn i #3 med lämplig volym cellmedium till totalt 105 μL.
OBS: #1, som innehåller celler, får 100 μL opsoniserade bakterier med resterande 5 μL som hålrumsvolym. Vi testade varje utspädning av testseran i två exemplar. - Inkubera plattan #3 vid 37 °C i 30 min i närvaro av 5% CO2 med fuktighet för att opsonera bacilli.
6. Vidhäftningsanalys och fluorescerande märkning av däggdjursceller
- Håll alla reagenser vid 37 °C före användning.
- Placera #1, som innehåller vidhäftande celler, på ett värmeblock på 37 °C.
- Använd en flerkanals pipettor för att ta bort förbrukat medium från brunnar och snabbt ersätta med 100 μL opsoniserade bakterier från #3. Se till att inga bubblor har genererats i brunnarna under pipetting. Inkubatplattan #1 vid 37 °C med 5 % CO2 och luftfuktighet i 30 minuter för vidhäftning.
- Tvätta varje brunn 5x med 150 μL PBS ovanpå ett 37 °C värmeblock för att ta bort obunden bacilli.
OBS: Var försiktig så att cellerna inte sprids av misstag under tvättningen. - Späd 16% PF med PBS 1:4 för att göra 4% PF. Fixera celler med 4% PF i 1 h genom att tillsätta 150 μL till varje brunn. Tvätta celler 2x med PBS.
- Blanda 2 μL HCS (screening med högt innehåll) Orange Cell Stain i 10 ml PBS. Tillsätt 150 μL av denna färgningslösning till fasta celler och inkubera i 30 minuter vid omgivningstemperatur.
- Tvätta brunnar 2x med PBS.
- Förvara vid 4 °C tills mikroskopin.
7. Mikroskopi
OBS: I allmänhet kommer ett automatiserat fluorescensmikroskop med hög genomströmning att underlätta avbildning för OAA. Om ett automatiserat system inte är tillgängligt kan fluorescerande bilder av vidhäftande bacilli tas manuellt21. I denna studie20,vidhäftande bacilli och cell monolayers avbildades med Zeiss 700 laser scanning mikroskopisystem med specialiserad utrustning; vårt system bestod av Zeiss Axio Observer Z1 inverterat mikroskop utrustat med ett automatiserat steg, Definite Focus-modulen, 40 x NA 0,6-mål, Axio Cam HRc-kamera och Zen 2012 (Blue Edition) programvara. Bilderna som förvärvas är widefield-bilder, inte konfokala bilder. Följande protokoll är avsett som en grundläggande mikroskopinställning som är tillämplig på en mängd automatiserade mikroskopisystem.
- Inkubera plattan #1 vid omgivningstemperatur i 30 min. Slå på mikroskopet och tillhörande utrustning.
OBS: Acklimatisering vid omgivningstemperatur förhindrar kondens på glasplattan under avbildning. Dessutom förhindrar det defokusering på grund av temperaturförskjutning. - Placera plattan på scenen och fokusera på cellerna med hjälp av ljus fält- eller faskontrast.
- Välj 96 brunnsformat som plåtinställning. Välj kanalinställningar.
OBS: FITC:s toppexcitation och utsläppsvåglängd är 495/519 nm; HCS orange cellfläck är 556 och 572 nm. Andra fluorforer kan användas beroende på vilka filter som finns tillgängliga på mikroskopet. - Välj inställning till panelläge. Ange antalet bilder som ska förvärvas.
Obs: Plattsättningsfunktionen gör det möjligt att fånga flera platser i en exempelbrunn och kan ställas in för att hämta bilden i en plattsättning eller ett slumpmässigt format. Vi avbildade 10 slumpmässiga områden per brunn. - Ändra anskaffningsläget till "svartvitt" eller "monokromt" och binning ≥ 2x2.
OBS: Att ställa in binningen från 1x1 till 2x2 eller 4x4 skulle öka mikroskopihastigheten men skulle också resultera i lägre upplösning på bilden. För OAA är det tillräckligt att använda dessa inställningar eftersom analysen räknar upp både makrofager och vidhäftande bakterier. - Aktivera autofokus eller fokuseringsmodul. Ange hur ofta autofokuseringsfunktionen ska utföras. Aktivera Z-stackfunktionen om den är tillgänglig. Ange antalet Z-staplar som fångar tjockleken på cellmonager och vidhäftande bacilli.
OBS: Antalet Z-staplar som väljs ökar mikroskopitiden men säkerställer att en bild med rätt fokus tas vid varje Z-stack. - Ange en filmapp som du vill spara bilder i. Kör det automatiska bildprogrammet.
8. Insamling och analys av uppgifter
- Räkna antalet vidhäftande bacilli- och däggdjursceller per bild. Räkna varje kedja av bacilli som en bakterie.
- Rita bacilli/celler i det positiva kontrolltestserumet och titern (t.ex. 1:10 utspädning är 10 titerenheter) för att generera en standardkurva i ett lämpligt statistikprogram.
- Analysera det positiva kontrolltestserumet med icke-linjär regressionskurva. Analysera sedan de återstående proverna med hjälp av standardkurvan för det positiva kontrolltestserumet för att bestämma motsvarande titrar.
OBS: Det är vanligtvis mest exakt att välja provutspädningar nära mitten av standardkurvan vid bestämning av titrar. - Beräkna det geometriska medelvärdet av proverna från varje vaccingrupp. Beräkna P-värdena för logtransformerade titrar med minst signifikant skillnad ANOVA-analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta avsnitt visar representativa mikrografer som samlats in under ett OAA-experiment tillsammans med resultat som visar att OAA kan användas för att undersöka antikroppars biologiska funktion. Här användes analysen framgångsrikt för att utvärdera effekten av en anthraxvaccinkandidat. Det är viktigt att verifiera tillståndet för inkapsling på bacilli så lite eller ingen inkapsling orsakar dem att hålla sig till värdceller, vilket ger en hög bakgrund. Figur 1 är en bild av B. anthracis Ames negativt fläckad med Indien bläck för att undersöka inkapsling. OAA kräver att flera intilliggande synfält belyses och om konfokal mikroskopi används, flera staplar eller sektioner. Således är det nödvändigt att verifiera att bacilli varken är för dim eller fotoblekmedel för snabbt. Figur 2 är en bild av bacilli märkt med FITC. Figur 3 visar maximala projektionsbilder av B. anthracis Ames som är fästa vid cellmonalayers. Dessa är representativa synfält som räknades och poängsättdes för OAA. Ökningen i fastsättning av bacilli inkuberad med PGGA-OMPC antiserum beror på förekomsten av antikroppar mot kapseln som opsonized bacilli. Figur 4 visar att serumtitrarna hos NHPs som vaccinerats med 10 och 50 μg PGGA-OMPC är betydligt högre än titrarna enbart för OMPC och PGGA.
Figur 1. En Indien bläck bild av fasta B. anthracis Ames. Observera frigångszonen som omger bacilli på grund av närvaron av kapseln. Bar = 10 μm. Bilden är tagen på EVOS FL automatiserade mikroskopisystem med 100 x 1,4 numerisk bländare (NA) oljemålslins. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Bilder av FITC märkta fasta B. anthracis Ames. -Jag har inte tid med det här. Kontrastbild för differentiella störningar. fluorescerande bild pseudofärgad i grönt (mitten); slås samman (höger). Bar = 10 μm. Konfokala bilder togs på Zeiss 700 LSM Confocal Microscopy med 40 x 1,3 NA oljemållins. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3. Fluorescerande bilder av B. anthracis Ames klibbade sig till RAW 264.7 cell monolayers. Bacilli var opsonized med test serum från NHPs vaccineras och boostas med (A) 10 μg PGGA-OMPC, (B) 50 μg PGGA-OMPC, (C) 50 μg PGGA ensam, eller (D) OMPC ensam. Grön = B. anthracis Ames, röd = RAW 264,7 celler. Stapel = 20 μm. Breda fältbilder togs på Zeiss Axio Observer Z1-mikroskopet med 40 x 0,6 objektiv och Axio Cam HRc-kameran. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4. Opsono-adherence titrar av NHPs vaccinerade med 10 μg PGGA-OMPC, 50 μg PGGA-OMPC, 50 μg PGGA ensam, eller OMPC ensam. De geometriska medlen för 5 djur per grupp är graferade. Felstaplar indikerar SEM. *p ≤ 0,001 jämfört med PGGA ensam. P-värdena beräknades med hjälp av ANOVA med LSD posthoc test. Uppgifterna publicerades ursprungligen i Chabot, et al., 201620. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kapselbaserade vacciner har visat sig vara effektiva mot många bakteriella patogener, och många är licensierade för användning på människor25,26,27. Dessa vacciner verkar genom att generera antikroppar riktade mot kapseln och många av dessa studier använder OPKA för att visa de opsono-fagocytiska funktionerna hosantikropparna 13,14,16,28,29. På grund av problem med biosäkerhet och för att underlätta arbetet utvecklade vi en OAA för att utvärdera antikroppar från djur som vaccinerats med B. anthracis kapselkonjugat. Förekomsten av kapsel på B. anthracis förhindrar vidhäftning och fagocytos30, men opsonisering av bacilli med serum från vaccinerade djur inducerar fastsättning på makrofager20,21.
För OAA används vidhäftningsaktiviteten, inte internalisering och dödande, för att kvantifiera opsonisk aktivitet. Detta gav OAA flera fördelar. Vi kunde använda paraformaldehyd dödad, fluorescerande märkt inkapslad bacilli istället för levande organismer. Förändringar i bakterieytan från aldehydfixering och fluorescerande märkning ändrade inte bakteriernas totala vidhäftning till makrofagerna; fast och märkt bacilli var inte mer vidhäftande än levande bacilli (data visas inte). Graden av inkapsling kan variera från kultur till kultur och påverka övergripande efterlevnad trots liknande tillväxtförhållanden. Således tillåter användningen av ett enda inaktiverat bakterielager standardisering över experiment som utförs på olika dagar och över olika uppsättningar experiment. Detta var värdefullt för att jämföra serum från de 20 NHPs som används i detta arbete och serum som kommer att genereras i våra kommande studier. Sist är de flesta makrofager, inklusive RAW 264,7-celler, känsliga för det myrax dödliga toxinet som produceras av levande patogen31, vilket gör användningen av levande bacilli i sig problematisk.
Användningen av RAW 264.7 celler underlättade också standardisering. Vi använde ursprungligen en vanlig cellinje i OPKA, HL-60 celler. Vi fann dock svårigheter att differentiera dem till granulocyter med dimetylformamid, som rapporterats av andra28,32. RAW 264.7 celler har fördelen att de inte behöver vara kemiskt differentierade och är vidhäftande och därmed mer mottagliga för mikroskopibaserade OAA. Denna cellinje har använts i många faagocytosstudier med intracellulära patogener33,34, liksom B. anthracis31. Användningen av RAW 264.7 celler, som härrör från mus, är också fördelaktigt eftersom mus Fc-receptorer är promiskuösa i sin bindande specificitet för IgG härledd från andra arter35. Detta gjorde det möjligt för oss att utvärdera anti-kapsel antikroppar från NHPs med en murin cellinje.
Anthrax, även om det är sällsynt, är endemiskt i vissa regioner i världen och USA. Ett problem är att de FBS som används, som kommer från USA, redan kan innehålla antikroppar mot kapslar till följd av att djuret exponeras för B. anthracis sporer eller andra PGGA-producerande mikrober i jorden. För att ta itu med det här problemet var FBS-partiet vi använde förtestad. Vi fann att tillsats av värme inaktiverade FBS ökade följsamhet jämfört med DMEM ensam (data visas inte). Det ökade dock inte vidhäftning jämfört med värme inaktiverad normal serum från marsvin, apa, mus eller människa (data visas inte). Således innehöll FBS-partiet vi använde inte antikroppar mot kapseln till följd av exponering. Dessutom skulle det inte heller innehålla antikroppar mot kapslar till följd av att djuret vaccinerades med den oinkapslade B. anthracis Sterne, en stam som saknar den pXO2-plasmid som krävs för kapselproduktion. Det testade FBS-partiet användes för alla efterföljande OAA.
En begränsning av tekniken är uppgiften att räkna bacilli och celler av laboratoriepersonal, vilket tog enormt mycket tid och ansträngning. Detta kan åtgärdas med hjälp av programvara som har denna typ av analys; denna programvara var inte tillgänglig för oss vid den tiden. Men eftersom manuell räkning var nödvändig, var ett kritiskt steg avlägsnande eller tvättning av främmande och obunden bacilli för att underlätta uppgiften. Det var också nödvändigt att testa reagenser som ledde till lägre bakgrundsljud. OAA kräver en källa till komplement eftersom det förbättrar opsonization36. Därför testade vi en mängd olika komplementkällor inklusive marsvin, människa och babykaninkomplement. Vi valde babykaninkomplement för vår analys eftersom vi fann att den inte har svaga, multispecifika aktiviteter mot heterofila antigener, det används ofta i OPKA-studier14,15,37, och det är lätt tillgängligt kommersiellt.
Vi anser att OAA är kvantitativt och mycket reproducerbart. Vi använder den för att komplettera studier som involverar ligand bindande analyser som ELISAs, som endast kvantifierar totala IgG-nivåer men inte skiljer mellan funktionella och icke-funktionella antikroppar. OAA kan användas för att komplettera andra funktionella analyser (t.ex. serumbakteriell aktivitet och toxinneutraliseringsanalyser) för att visa de olika funktionerna hos vaccingenererade antikroppar16,38. Utvecklingen av OAA har ökat vår repertoar av immunogenicitetsstudier för att utvärdera vacciner och terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inte en kommersiell eller annan förening som kan utgöra en intressekonflikt.
Acknowledgments
J. Chua, D. Chabot och A. Friedlander designade de procedurer som beskrivs i manuskriptet. J. Chua och T. Putmon-Taylor utförde experimenten. D. Chabot utförde dataanalys. J. Chua skrev manuskriptet.
Författarna tackar Kyle J. Fitts för utmärkt teknisk hjälp.
Arbetet stöddes av Försvarets hotreduceringsbyrå beviljar CBM. VAXBT.03.10.RD.015, plannummer 921175.
Åsikter, tolkningar, slutsatser och rekommendationer är författarnas och stöds inte nödvändigtvis av den amerikanska armén. Innehållet i denna publikation återspeglar inte nödvändigtvis försvarsdepartementets åsikter eller policyer, och inte heller innebär omnämnande av handelsnamn, kommersiella produkter eller organisationer godkännande av den amerikanska regeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
References
- Walters, M. N., Papadimitriou, J. M.
- Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144 (1883).
- Tauber, A. I.
- Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
- Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Candela, T., Fouet, A.
- Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
- Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
- Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
- Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
- Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
- Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
- Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
- Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
- Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
- List of Tier 1 BSAT. , Available from: www.selectagents.gov/ohp-app1.html (2017).
- Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
- Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
- Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
- Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
- Revised FSAP Policy Statement: Inactivated Bacillus anthracis and Bacillus cereus Biovar anthracis. , Available from: www.selectagents.gov/policystatement_bacillus.html (2017).
- Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, Suppl 1 1-9 (2013).
- Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
- Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
- Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
- Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400 (2019).
- Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250 (1999).
- Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J.
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
- Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
- Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
- Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
- Wolf, J. J. Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , Elsevier. 243-255 (2013).
