Ensayo de adhesión a Opsono para evaluar anticuerpos funcionales en el desarrollo de vacunas contra la antrasis bacillus y otros patógenos encapsulados
Summary
El ensayo de adhesión a opsono es un método alternativo al ensayo de muerte opsonótico-fagocítico para evaluar las funciones opsónicas de los anticuerpos en el desarrollo de vacunas.
Abstract
El ensayo de opsono-adherencia es un ensayo funcional que enumera el apego de patógenos bacterianos a fagocitos profesionales. Debido a que la adherencia es necesaria para la fagocitosis y matar, el ensayo es un método alternativo a los ensayos de matanza opsono-fagocítico. Una ventaja del ensayo de opsono-adherencia es la opción de usar patógenos inactivados y líneas celulares de mamíferos, lo que permite la estandarización a través de múltiples experimentos. El uso de un patógeno inactivado en el ensayo también facilita el trabajo con agentes infecciosos de nivel 3 de bioseguridad y otros patógenos virulentos. En nuestro trabajo, el ensayo de adhesión al opsono se utilizó para evaluar la capacidad funcional de los anticuerpos, desde el sera de animales inmunizados con una vacuna a base de cápsulas de ántrax, para inducir la adherencia de Bacillus anthracis fijo a una línea celular de macrófago de ratón, RAW 264.7. La microscopía automatizada de fluorescencia se utilizó para capturar imágenes de bacilos adheridos a macrófagos. El aumento de la adherencia se correlacionó con la presencia de anticuerpos anti-cápsula en el suero. Los primates no humanos que presentaban altas concentraciones séricas de anticuerpos anti-cápsula estaban protegidos del desafío del ántrax. Por lo tanto, el ensayo de opsono-adherencia se puede utilizar para dilucidar las funciones biológicas de anticuerpos específicos de antígenos en sera, para evaluar la eficacia de los candidatos a la vacuna y otras terapias, y para servir como un posible correlato de inmunidad.
Introduction
El reconocimiento, la adherencia, la internalización y la degradación de un patógeno son parte integral de la fagocitosis1,una vía destacada en la respuesta inmune innata huésped descrita por primera vez por Ilya Metchnikoff en 18832,3. Los leucocitos fagocíticos, así como otras células del sistema inmunitario, son altamente discriminatorios en su selección de objetivos; son capaces de distinguir entre “yo infeccioso” y “yo no infeccioso” a través de patrones moleculares asociados a patógenos por su repertorio de receptores de reconocimiento de patrones (PRR)4,5. El reconocimiento del huésped de un patógeno también puede producirse con la unión de opsoninas huésped, como complemento y anticuerpos6. Este proceso, llamado opsonización, recubre el patógeno con estas moléculas, mejorando la internalización al unirse a los receptores opsónicos (por ejemplo, complemento y receptores Fc) en las células fagocíticas6. Para que un patógeno se adhiera a un fagocito, es necesaria la unión colectiva de múltiples receptores con sus ligandos de cognado. Sólo entonces la adherencia puede activar y sostener cascadas de señalización dentro de la celda host para iniciar la internalización6.
Debido a la importancia de la fagocitosis en el aclaramiento de patógenos y la prevención de infecciones, patógenos extracelulares han desarrollado numerosas maneras de subvertir este proceso para prolongar su supervivencia. Una estrategia de importancia es la producción de una cápsula polimérica aniónica (por ejemplo, polisacárido o poliaminoácido) que es anti-fagocítica en virtud de su carga, es poco inmunogénica, y protege moléculas en la envolvente bacteriana de los PRR6,7. Patógenos como Cryptococcus neoformans y Streptococcus pneumoniae tienen cápsulas compuestas de polímeros de sacárido, mientras que Staphylococcus epidermidis y algunas especies de Bacillus producen ácido poli-ɣ-glutámico (PGGA)7,8. Sin embargo, otros patógenos producen cápsulas que se asemejan al yo no infeccioso. Por ejemplo, Streptococcus pyogenes y una cepa patógena de B. cereus tienen una cápsula de ácido hialurónico que no sólo es anti-fagocítica, sino que también puede no ser reconocido como extraño por el sistema inmune9,10.
La conjugación de proteínas portadoras de cápsulas las convierte de antígenos pobres e independientes de T en antígenos altamente inmunogénicos dependientes de la T que pueden inducir títulos de anticuerpos anti-cápsula séricos altos11,12. Esta estrategia se emplea para vacunas autorizadas contra S. pneumoniae, Haemophilus influenzaey Neisseria meningitides11. Las actividades opsónicas de anticuerpos anti-cápsula han sido comúnmente evaluadas por ensayos de matanza opsono-fagocítica (OPKA)13,14,15,16. Estos ensayos prueban si los anticuerpos funcionales pueden desencadenar fagocitosis y matara 14. Sin embargo, el uso de OPKA con patógenos infecciosos, como agentes biológicos selectos de nivel 1 y toxinas (BSAT), incluido B. anthracis17,es peligroso y presenta riesgos para la seguridad; estos ensayos requieren un manejo exhaustivo de un agente selecto. El manejo de agentes seleccionados solo se puede realizar en laboratorios restringidos de bioseguridad nivel 3 (BSL-3); el trabajo en estas áreas exige procedimientos operativos prolongados debido a las numerosas precauciones de seguridad que deben seguirse. Los laboratorios BSL-3 tampoco suelen estar equipados con el equipo especializado utilizado para el trabajo opka, como microscopios y citómetros. Así, desarrollamos un ensayo alternativo basado en el uso de bacterias inactivadas18,19. Nos referimos a esto como un ensayo de opsono-adherencia (OAA) que no depende de la internalización y la eliminación de las salidas de ensayo; en su lugar, la adherencia de patógenos inactivados osonizados se utiliza como un índice de fagocitosis. Mecanicistamente, OAA es un sustituto adecuado porque la adherencia ocurre a priori y está íntimamente entrelazada con la internalización y la matanza intracelular. Desde una perspectiva de bioseguridad, OAA es preferible porque requiere un manejo mínimo de un agente infeccioso, es experimentalmente de menor duración que OPKA, y se puede realizar en laboratorios BSL-2 después de que se haya producido y transferido un stock del patógeno inactivado.
Demostramos la utilización de OAA para examinar la función opsónica de anticuerpos anti-cápsula que se encuentran en el sera de primates no humanos (NHP) vacunados con una cápsula conjugada [es decir, PGGA de B. anthracis conjugada al complejo proteico de membrana externa (OMPC) de Meningitidas Neisseria]20. Bacilos osonizados séricos fueron incubados con una línea celular de macrófago de ratón adherente, RAW 264.7. Después de la fijación, la monocapa celular y el bacilo adherente fueron imagenados por microscopía de fluorescencia. La adherencia bacteriana aumentó cuando los bacilos fueron incubados con suero de los NHP vacunados con la cápsula conjugada en comparación con el control sérico20. Adherencia correlacionada con la supervivencia del desafío de ántrax20,21. Por lo tanto, el uso de OAA caracterizó la función de los anticuerpos anti-cápsula y facilitó en gran medida las pruebas de nuestro candidato a la vacuna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se ha demostrado que las vacunas basadas en cápsulas son eficaces contra numerosos patógenos bacterianos, y muchas tienen licencia para su uso en seres humanos25,26,27. Estas vacunas funcionan mediante la generación de anticuerpos dirigidos a la cápsula y muchos de estos estudios utilizan el OPKA para mostrar las funciones opsono-fagocíticas de los anticuerpos13,14,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Chua, D. Chabot y A. Friedlander diseñaron los procedimientos descritos en el manuscrito. J. Chua y T. Putmon-Taylor realizaron los experimentos. D. Chabot realizó análisis de datos. J. Chua escribió el manuscrito.
Los autores agradecen a Kyle J. Fitts por su excelente asistencia técnica.
El trabajo fue apoyado por la agencia de reducción de amenazas de defensa CBM. VAXBT.03.10.RD.015, número de plan 921175.
Opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las de los autores y no necesariamente están respaldadas por el Ejército de los Estados Unidos. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de Defensa, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones implica el respaldo del Gobierno de los Estados Unidos.
Materials
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
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