Summary

Ensayo de adhesión a Opsono para evaluar anticuerpos funcionales en el desarrollo de vacunas contra la antrasis bacillus y otros patógenos encapsulados

Published: May 19, 2020
doi:

Summary

El ensayo de adhesión a opsono es un método alternativo al ensayo de muerte opsonótico-fagocítico para evaluar las funciones opsónicas de los anticuerpos en el desarrollo de vacunas.

Abstract

El ensayo de opsono-adherencia es un ensayo funcional que enumera el apego de patógenos bacterianos a fagocitos profesionales. Debido a que la adherencia es necesaria para la fagocitosis y matar, el ensayo es un método alternativo a los ensayos de matanza opsono-fagocítico. Una ventaja del ensayo de opsono-adherencia es la opción de usar patógenos inactivados y líneas celulares de mamíferos, lo que permite la estandarización a través de múltiples experimentos. El uso de un patógeno inactivado en el ensayo también facilita el trabajo con agentes infecciosos de nivel 3 de bioseguridad y otros patógenos virulentos. En nuestro trabajo, el ensayo de adhesión al opsono se utilizó para evaluar la capacidad funcional de los anticuerpos, desde el sera de animales inmunizados con una vacuna a base de cápsulas de ántrax, para inducir la adherencia de Bacillus anthracis fijo a una línea celular de macrófago de ratón, RAW 264.7. La microscopía automatizada de fluorescencia se utilizó para capturar imágenes de bacilos adheridos a macrófagos. El aumento de la adherencia se correlacionó con la presencia de anticuerpos anti-cápsula en el suero. Los primates no humanos que presentaban altas concentraciones séricas de anticuerpos anti-cápsula estaban protegidos del desafío del ántrax. Por lo tanto, el ensayo de opsono-adherencia se puede utilizar para dilucidar las funciones biológicas de anticuerpos específicos de antígenos en sera, para evaluar la eficacia de los candidatos a la vacuna y otras terapias, y para servir como un posible correlato de inmunidad.

Introduction

El reconocimiento, la adherencia, la internalización y la degradación de un patógeno son parte integral de la fagocitosis1,una vía destacada en la respuesta inmune innata huésped descrita por primera vez por Ilya Metchnikoff en 18832,3. Los leucocitos fagocíticos, así como otras células del sistema inmunitario, son altamente discriminatorios en su selección de objetivos; son capaces de distinguir entre “yo infeccioso” y “yo no infeccioso” a través de patrones moleculares asociados a patógenos por su repertorio de receptores de reconocimiento de patrones (PRR)4,5. El reconocimiento del huésped de un patógeno también puede producirse con la unión de opsoninas huésped, como complemento y anticuerpos6. Este proceso, llamado opsonización, recubre el patógeno con estas moléculas, mejorando la internalización al unirse a los receptores opsónicos (por ejemplo, complemento y receptores Fc) en las células fagocíticas6. Para que un patógeno se adhiera a un fagocito, es necesaria la unión colectiva de múltiples receptores con sus ligandos de cognado. Sólo entonces la adherencia puede activar y sostener cascadas de señalización dentro de la celda host para iniciar la internalización6.

Debido a la importancia de la fagocitosis en el aclaramiento de patógenos y la prevención de infecciones, patógenos extracelulares han desarrollado numerosas maneras de subvertir este proceso para prolongar su supervivencia. Una estrategia de importancia es la producción de una cápsula polimérica aniónica (por ejemplo, polisacárido o poliaminoácido) que es anti-fagocítica en virtud de su carga, es poco inmunogénica, y protege moléculas en la envolvente bacteriana de los PRR6,7. Patógenos como Cryptococcus neoformans y Streptococcus pneumoniae tienen cápsulas compuestas de polímeros de sacárido, mientras que Staphylococcus epidermidis y algunas especies de Bacillus producen ácido poli-ɣ-glutámico (PGGA)7,8. Sin embargo, otros patógenos producen cápsulas que se asemejan al yo no infeccioso. Por ejemplo, Streptococcus pyogenes y una cepa patógena de B. cereus tienen una cápsula de ácido hialurónico que no sólo es anti-fagocítica, sino que también puede no ser reconocido como extraño por el sistema inmune9,10.

La conjugación de proteínas portadoras de cápsulas las convierte de antígenos pobres e independientes de T en antígenos altamente inmunogénicos dependientes de la T que pueden inducir títulos de anticuerpos anti-cápsula séricos altos11,12. Esta estrategia se emplea para vacunas autorizadas contra S. pneumoniae, Haemophilus influenzaey Neisseria meningitides11. Las actividades opsónicas de anticuerpos anti-cápsula han sido comúnmente evaluadas por ensayos de matanza opsono-fagocítica (OPKA)13,14,15,16. Estos ensayos prueban si los anticuerpos funcionales pueden desencadenar fagocitosis y matara 14. Sin embargo, el uso de OPKA con patógenos infecciosos, como agentes biológicos selectos de nivel 1 y toxinas (BSAT), incluido B. anthracis17,es peligroso y presenta riesgos para la seguridad; estos ensayos requieren un manejo exhaustivo de un agente selecto. El manejo de agentes seleccionados solo se puede realizar en laboratorios restringidos de bioseguridad nivel 3 (BSL-3); el trabajo en estas áreas exige procedimientos operativos prolongados debido a las numerosas precauciones de seguridad que deben seguirse. Los laboratorios BSL-3 tampoco suelen estar equipados con el equipo especializado utilizado para el trabajo opka, como microscopios y citómetros. Así, desarrollamos un ensayo alternativo basado en el uso de bacterias inactivadas18,19. Nos referimos a esto como un ensayo de opsono-adherencia (OAA) que no depende de la internalización y la eliminación de las salidas de ensayo; en su lugar, la adherencia de patógenos inactivados osonizados se utiliza como un índice de fagocitosis. Mecanicistamente, OAA es un sustituto adecuado porque la adherencia ocurre a priori y está íntimamente entrelazada con la internalización y la matanza intracelular. Desde una perspectiva de bioseguridad, OAA es preferible porque requiere un manejo mínimo de un agente infeccioso, es experimentalmente de menor duración que OPKA, y se puede realizar en laboratorios BSL-2 después de que se haya producido y transferido un stock del patógeno inactivado.

Demostramos la utilización de OAA para examinar la función opsónica de anticuerpos anti-cápsula que se encuentran en el sera de primates no humanos (NHP) vacunados con una cápsula conjugada [es decir, PGGA de B. anthracis conjugada al complejo proteico de membrana externa (OMPC) de Meningitidas Neisseria]20. Bacilos osonizados séricos fueron incubados con una línea celular de macrófago de ratón adherente, RAW 264.7. Después de la fijación, la monocapa celular y el bacilo adherente fueron imagenados por microscopía de fluorescencia. La adherencia bacteriana aumentó cuando los bacilos fueron incubados con suero de los NHP vacunados con la cápsula conjugada en comparación con el control sérico20. Adherencia correlacionada con la supervivencia del desafío de ántrax20,21. Por lo tanto, el uso de OAA caracterizó la función de los anticuerpos anti-cápsula y facilitó en gran medida las pruebas de nuestro candidato a la vacuna.

Protocol

En cumplimiento de la Ley de Bienestar Animal, la política del Servicio de Salud Pública y otras leyes y regulaciones federales relativas a animales y experimentos que involucran animales, la investigación descrita aquí se llevó a cabo bajo un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. La instalación donde se llevó a cabo esta investigación está acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado De Los Animales de Laboratorio, Internacional y se adhie…

Representative Results

Esta sección muestra micrografos representativos recogidos durante un experimento de OAA junto con resultados que muestran que la OAA se puede utilizar para examinar la función biológica de los anticuerpos. Aquí, el ensayo se utilizó con éxito para evaluar la eficacia de un candidato a la vacuna contra el ántrax. Es fundamental verificar el estado de encapsulación en el bacilo, ya que la poca o ninguna encapsulación hace que se adhieran a las celdas del host, produciendo un fondo alto. La Fi…

Discussion

Se ha demostrado que las vacunas basadas en cápsulas son eficaces contra numerosos patógenos bacterianos, y muchas tienen licencia para su uso en seres humanos25,26,27. Estas vacunas funcionan mediante la generación de anticuerpos dirigidos a la cápsula y muchos de estos estudios utilizan el OPKA para mostrar las funciones opsono-fagocíticas de los anticuerpos13,14,

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

J. Chua, D. Chabot y A. Friedlander diseñaron los procedimientos descritos en el manuscrito. J. Chua y T. Putmon-Taylor realizaron los experimentos. D. Chabot realizó análisis de datos. J. Chua escribió el manuscrito.

Los autores agradecen a Kyle J. Fitts por su excelente asistencia técnica.

El trabajo fue apoyado por la agencia de reducción de amenazas de defensa CBM. VAXBT.03.10.RD.015, número de plan 921175.

Opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las de los autores y no necesariamente están respaldadas por el Ejército de los Estados Unidos. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de Defensa, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones implica el respaldo del Gobierno de los Estados Unidos.

Materials

0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) Corning, Corning, NY 431222
10 mL syringe (Luer-Lok tip) BD, Franklin Lakes, NJ 302995
15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA P96-1-N
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Science, Hatfield, PA 15710
75 cm sq. tissue culture treated flask Corning, Corning, NY 430641
Agar (powder) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A1296
Baby Rabbit Complement Cedarlane Labs, Burlington, NC CL3441
Bacto Yeast Extract BD, Sparks, MD 288620
BBL Brain Heart Infusion (BHI) BD, Sparks, MD 211059
Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates Remel, Lenexa, KS R01198
Cell scraper Sarstedt, Newton, NC 83.183
Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) Corning, Corning, NY 3596
Cover glass Electron Microscopy Science, Hatfield, PA 72200-10
Difco Nutrient Broth BD, Sparks, MD 234000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 11965-092 contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red
EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA AMAFD1000
Fetal Bovine Serum Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT SH30071.03 not gamma irradiated, not heat inactivated
Fluorescein isothiocyanate Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA F143
HCS Cell Mask Orange Cell Stain Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA H32713
hemocytometer (Improved Neubauer) Hausser Scientific, Horsham, PA 3900
India Ink solution BD, Sparks, MD 261194
L- glutamine (200 mM) Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA 25030081 supplement medium with additional 2mM L-glutamine
Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) Nikon Instruments, Melville, NY TE2000
PBS without Calcium or Magnesium Lonza, Walkersville, MD 17-516F
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT SV30010
petri dishes (100 x 15 mm) Falcon, Corning, Durham, NC 351029 for agar plates
RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) ATCC, Manassas, VA ATCC TIB-71
Slides VWR, Radnor, PA 16004-422
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S5761
Trypan Blue Solution (0.4%) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T8154
Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY 4109001865956000

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Chua, J., Chabot, D. J., Putmon-Taylor, T., Friedlander, A. M. Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens. J. Vis. Exp. (159), e60873, doi:10.3791/60873 (2020).

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