Summary
Der Opsono-Adhärenz-Assay ist eine alternative Methode zum opsono-phagozytischen Tötungstest zur Bewertung der Opsonic-Funktionen von Antikörpern in der Impfstoffentwicklung.
Abstract
Der Opsono-Adhärenz-Assay ist ein funktioneller Test, der die Bindung bakterieller Krankheitserreger an professionelle Phagozyten aufzählt. Da die Einhaltung der Phagozytose und Tötung erforderlich ist, ist der Assay eine alternative Methode zu opsono-phagozytischen Tötungstests. Ein Vorteil des Opsono-Adhärenz-Assays ist die Möglichkeit, inaktivierte Krankheitserreger und Säugetierzelllinien zu verwenden, was eine Standardisierung über mehrere Experimente hinweg ermöglicht. Die Verwendung eines inaktivierten Erregers im Test erleichtert auch die Arbeit mit Infektionserregern der Biosicherheitsstufe 3 und anderen virulenten Krankheitserregern. In unserer Arbeit wurde der Opsono-Adhärenz-Test verwendet, um die funktionelle Fähigkeit von Antikörpern von Tieren zu bewerten, die mit einem Impfstoff auf Milzbrandkapsel-Basiert immunisiert wurden, um die Einhaltung der festen Bacillus-Anthrakis an einer Maus-Makrophagenzelllinie, RAW 264.7, zu induzieren. Automatisierte Fluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um Bilder von Bazillen zu erfassen, die an Makrophagen haften. Erhöhte Adhärenz wurde mit dem Vorhandensein von Anti-Kapsel-Antikörpern im Serum korreliert. Nichtmenschliche Primaten, die hohe Serum-Antikapsel-Antikörperkonzentrationen aufwiesen, wurden vor Milzbrand-Herausforderungen geschützt. So kann der Opsono-Adhärenz-Test verwendet werden, um die biologischen Funktionen von antigenspezifischen Antikörpern in seren zu klären, die Wirksamkeit von Impfstoffkandidaten und anderen Therapeutika zu bewerten und als mögliches Korrelat der Immunität zu dienen.
Introduction
Erkennung, Adhärenz, Internalisierung und Abbau eines Erregers sind integraler Bestandteil der Phagozytose1, ein markanter Weg im Wirt angeborene Immunantwort zuerst beschrieben von Ilya Metchnikoff in 18832,3. Phagozytäre Leukozyten, sowie andere Zellen des Immunsystems, sind sehr diskriminierend in ihrer Auswahl von Zielen; sie sind in der Lage, zwischen "infektiösem Nicht-Selbst" und "nicht-infektiöses Selbst" durch pathogene assoziierte molekulare Muster durch ihr Repertoire an Mustererkennungsrezeptoren (PRRs)4,5zu unterscheiden. Die Wirterkennung eines Erregers kann auch mit der Bindung von Wirtsopsoninen, wie Komplement undAntikörpern 6auftreten. Dieser Prozess, der als Opsonisierung bezeichnet wird, beschichtet den Erreger mit diesen Molekülen und verbessert die Internalisierung bei Bindung an Opsonic-Rezeptoren (z. B. Komplement- und Fc-Rezeptoren) auf phagozytären Zellen6. Damit ein Erreger an einer Phagozyten haften kann, ist eine kollektive Bindung mehrerer Rezeptoren mit ihren Cognate-Ninentinanden erforderlich. Nur dann kann die Adhärenz Signalkaskaden innerhalb der Hostzelle auslösen und aufrechterhalten, um die Internalisierung zu initiieren6.
Aufgrund der Bedeutung der Phagozytose für die Clearance von Krankheitserregern und die Prävention von Infektionen haben extrazelluläre Krankheitserreger zahlreiche Wege entwickelt, diesen Prozess zu untergraben, um ihr Überleben zu verlängern. Eine Strategie von Bedeutung ist die Herstellung einer anionischen Polymerkapsel (z. B. Polysaccharid oder Polyaminosäure), die aufgrund ihrer Ladung antiphagozytisch ist, schlecht immunogen ist und Moleküle auf der bakteriellen Hülle aus PRRs6,7abschirmt. Pathogene wie Cryptococcus neoformans und Streptococcus pneumoniae haben Kapseln aus Saccharidpolymeren, während Staphylococcus epidermidis und einige Bacillus-Arten Poly-ɣ-Glutaminsäure (PGGA)7,8produzieren. Doch andere Krankheitserreger produzieren Kapseln, die dem nicht-infektiösen Selbst ähneln. Zum Beispiel haben Streptococcus pyogenes und ein pathogener Stamm von B. cereus eine Hyaluronsäurekapsel, die nicht nur antiphagozytisch ist, sondern auch vom Immunsystem nicht als fremd erkannt werden kann9,10.
Konjugation von Kapsel zu Trägerproteinen wandelt sie von armen, T-unabhängigen Antigenen in hochimmunogene T-abhängige Antigene um, die hohe Serum-Antikapsel-Antikörper-Titers induzieren können11,12. Diese Strategie wird für lizenzierte Impfstoffe gegen S. pneumoniae, Haemophilus influenzaeund Neisseria meningitides11eingesetzt. Die Opsonic-Aktivitäten von Anti-Kapsel-Antikörpern wurden häufig durch opsono-phagozytische Tötungstests (OPKA)13,14,15,16ausgewertet. Diese Assays testen, ob funktionelle Antikörper Phagozytose auslösen und14töten können. Die Verwendung von OPKA mit infektiösen Krankheitserregern wie Tier 1 Biological Select Agents and Toxins (BSAT), einschließlich B. anthracis17, ist jedoch gefährlich und birgt Sicherheitsrisiken; diese Assays erfordern eine umfassende Handhabung eines ausgewählten Agenten. Die Auswahl der Agentenhandhabung kann nur in Laboratorien der biologischen Sicherheitsstufe 3 (BSL-3) erfolgen; Die Arbeit in diesen Bereichen erfordert aufgrund der zahlreichen Sicherheitsvorkehrungen, die befolgt werden müssen, langwierige Betriebsabläufe. BSL-3-Labore sind in der Regel auch nicht mit den speziellen Geräten für OPKA-Arbeiten wie Mikroskope und Zytometer ausgestattet. So entwickelten wir einen alternativen Assay auf Basis der Verwendung von inaktivierten Bakterien18,19. Wir bezeichnen dies als einen Opsono-Adherence-Assay (OAA), der nicht von Internalisierung und Tötung als Assay-Output sabhängt; Stattdessen wird die Adhärenz von opsonisierten inaktivierten Krankheitserregern als Index der Phagozytose verwendet. Mechanistisch ist OAA ein geeigneter Ersatz, da die Adhärenz a priori auftritt und eng mit Internalisierung und intrazellulärer Tötung verflochten ist. Aus Sicht der Biosicherheit wird OAA bevorzugt, da es einen minimalen Umgang mit einem Infektier erfordert, experimentell kürzer ist als OPKA und in BSL-2-Labors durchgeführt werden kann, nachdem ein Vorrat des inaktivierten Erregers produziert und übertragen wurde.
Wir zeigen die Verwendung von OAA zur Untersuchung der Opsonic-Funktion von Anti-Kapsel-Antikörpern, die in Seren von nichtmenschlichen Primaten (NHPs) gefunden wurden, die mit einem Kapselkonjugat geimpft sind [d.h. PGGA von B. anthracis konjugiert mit dem äußeren Membranproteinkomplex (OMPC) von Neisseria Meningitiden]20. Serum-opsonisierte Bazillen wurden mit einer anhaftenden Mausmakrophagenzelllinie, RAW 264.7, inkubiert. Nach der Fixierung wurden die Zellmonolayer und die anhaftenden Bazillen durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Die bakterielle Adhärenz nahm zu, wenn die Bazillen mit Serum von NHPs inkubiert wurden, die mit dem Kapselkonjugat geimpft wurden, verglichen mit Kontrollserum20. Die Einhaltung korrelierte mit dem Überleben der Milzbrand-Herausforderung20,21. So charakterisierte die Verwendung von OAA die Funktion von Anti-Kapsel-Antikörpern und erleichterte die Prüfung unseres Impfstoffkandidaten erheblich.
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Protocol
In Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz, der Politik des öffentlichen Gesundheitswesens und anderen Bundesgesetzen und -vorschriften für Tiere und Tierversuche wurde die hier beschriebene Forschung im Rahmen eines vom Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss genehmigten Protokolls durchgeführt. Die Einrichtung, in der diese Forschung durchgeführt wurde, ist von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International akkreditiert und hält sich an die Grundsätze, die im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, National Research Council, 201124, angegeben sind.
1. Kultur und Pflege der Zelllinie, RAW 264.7
HINWEIS: Die folgenden Verfahren müssen mit aseptischen Techniken durchgeführt werden.
- Erhitzen Sie das fetale Rinderserum (FBS) in einem 56 °C-Wasserbad für 30 min, um die Komplementzulage zu inaktivieren.
HINWEIS: Die Inaktivierungszeit von 30 min beginnt, wenn FBS 56 °C erreicht. Um die Temperatur zu überwachen, erhitzen Sie eine ähnliche Wassermenge in einem Becher im selben Wasserbad. Sobald das Wasser 56 °C erreicht, beginnen Sie den 30 min Countdown für FBS. Alternativ ist auch die wärmeinaktivierte FBS im Handel erhältlich. - Bereiten Sie Medium für RAW 264.7 Zellen vor, indem Sie 90% DMEM mit hoher Glukose und 10% hitzeinaktiviertem FBS (v/v) kombinieren. L-Glutamin zu einer Endkonzentration von 6 mM hinzufügen.
HINWEIS: DMEM mit hoher Glukose wird mit 4 mM L-Glutamin formuliert. Die Ergänzung von L-Glutamin zu 6 mM fördert das gleichmäßige Zellwachstum. 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin können hinzugefügt werden, um eine Kontamination zu verhindern. Eine andere häufige murine Zelllinie, J774A.1, kann auch verwendet werden und wird unter ähnlichen Bedingungen angebaut. - Eine gefrorene Durchstechflasche mit Zellen in einem 37 °C-Wasserbad auftauen und aus dem Bad entfernen, sobald sie schmilzt. Fügen Sie den Inhalt aseptisch zu 5 ml komplettem Medium in einem konischen Rohr hinzu. Konische Röhre zweimal inumieren und bei 300 x g für 5 min zu Pelletzellen drehen.
- Aspirieren Sie das Medium mit einer sterilen Pasteur-Pipette, die an einem Vakuum befestigt ist, um Gefriermittel zu entfernen. Zellpellet in 5 ml frischem Medium resuspendieren.
- Transfer Suspension zu einem Gewebe Kultur behandelt Kolben oder Schale. Fügen Sie genügend Medium hinzu, um den Boden des Kolbens vollständig zu bedecken und wirbeln, um Zellen gleichmäßig zu verteilen. Geben Sie die Durchgangsnummer an, die mit "1" beginnt.
- Inkubationszellen bei 37 °C in Gegenwart von 5%CO2 und Feuchtigkeit bis 95% bis 100% Konfluenz erreicht wird. Überprüfen Sie die Zellen täglich unter dem Mikroskop, beginnend mit dem zweiten Tag der Inkubation. Lassen Sie die Zellen nicht >100% Konfluenz erreichen, da dies dazu führt, dass die Zellen abheben und absterben.
HINWEIS: Die Zeit, die benötigt wird, um die Konfluenz zu erreichen, hängt davon ab, wie viele lebende Zellen plattiert wurden und die Wachstumsfläche des Kolbens. Daher ist es ratsam, die Zellen täglich zu überprüfen. - Subkulturzellen durch Abkratzen und Verdünnen des Zellbestands in frischem Medium, wodurch mindestens zwei Tage Wachstum zwischen den Abkratzungen möglich sind. Erhöhen Sie die Durchgangszahl um 1 mit jeder Subkultur.
HINWEIS: Das Passieren und sofortiges Abkratzen am nächsten Tag führt zu einem schnelleren Verlust der allgemeinen Zellhaftung im Laufe der Zeit. RAW 264.7-Zellen sollten nur bis etwa Durchgang 15 verwendet werden. - Um RAW 264.7-Zellen für den OAA-Assay zu verplatten, ersetzen Sie es durch frisches Medium und verwenden Sie einen Zellschaber, um Zellen vorsichtig vom Kolben abzukratzen. Pipette nach oben und unten, um die Zellklumpen für eine einfachere Zellzählung aufzubrechen.
HINWEIS: Die traditionelle Methode zum Unterteilen von RAW 264.7 ist das Abkratzen. Nach unserer Erfahrung führt die Verwendung von Trypsin dazu, dass RAW 264.7-Zellen im Laufe der Zeit schneller an Haftung verlieren als beim Abkratzen. - Um Zellen zu zählen, verdünnen Sie gleiche Volumen von Zellen und Trypan-Blau-Lösung. Legen Sie 10 L auf ein Hämozytometer. Beobachten und zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen, die den Farbstoff ausschließen, mit einem invertierten zusammengesetzten Mikroskop mit einer 10-fachen Objektivlinse.
- Platte 1,4 x 104 lebensfähige Zellen pro Brunnen in einer 96 gut 0,15 m dicken Glas-Flachbodenplatte (Platte #1). Lassen Sie Zellen für 3 Tage wachsen. Ersetzen Sie das Medium einen Tag vor der Ausführung von OAA.
HINWEIS: Nach 3 Tagen inkubationszeit, sollte die Anzahl der Zellen etwa 5 x 104/ well sein.
2. Bakterielle Kultur und Präparate
HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendete Bakterienart ist ein verkapselter virulenter Stamm, B. anthracis Ames. Alle Manipulationen mit dieser Art erfordern angemessene Biosicherheits- und Sicherheitsabstände und müssen in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II oder Klasse III in einem BSL-3-Labor durchgeführt werden. Befolgen Sie die institutionellen Betriebsverfahren für BSL-3-Arbeiten und für die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung enden, wenn Sie mit Bakterien umgehen.
- Bereiten Sie die Gehirnherzinfusion (BHI) Brühe vor, indem Sie 37 g BHI-Pulver in 1 L Wasser auflösen und 15 min bei 121 °C autoklavieren. Brühe bei Umgebungstemperatur aufbewahren.
- 8% Natriumbicarbonatlösung in Wasser vorbereiten und mit einer 0,20 m Filterspritze sterilisieren. Lösung bei 4 °C lagern und innerhalb von 1 Tag verwenden.
- 8 g Nährwertbrühe, 3 g Hefeextrakt und 15 g Agar in 1 L Wasser mischen, um NBY-Agarplatten zuzubereiten. Autoklav bei 121 °C für 15 min. Gießen Sie in Petrischalen und lassen Sie zu erstarren. Platten bei 4 °C lagern.
HINWEIS: NBY-Agarplatten können mit oder ohne Natriumbicarbonat hergestellt werden. Die Zugabe von Natriumbicarbonat zu Brühe nümern und Agarplatten induziert das Wachstum von Schleimhautkolonien, die aus verkapselten Bazillen bestehen. Die Endkonzentration von Natriumbicarbonat in flüssigen und festen Medien beträgt 0,8%. - Bereiten Sie Kulturbrühe für B. Anthracis vor, indem Sie 50% autoklavierte BHI-Brühe, 40% FBS und 10% Natriumbicarbonatlösung (v/v) mischen.
HINWEIS: Diese Brühe ist formuliert, um kurze Ketten von gekapselten Bazillen zu produzieren. - Bereiten Sie eine Master-Platte von B. anthracis vor, indem Sie sie für die Isolierung auf einer NBY-Agarplatte von einem Sporenbestand einen Tag vor der Kultivierung in brüten. Bei 37 °C inkubieren.
- 30 ml Kulturbrühe in einem entlüfteten 250 ml Kolben mit mehreren Kolonien von B. anthracisimpfen.
HINWEIS: Ein bestimmtes Volumen-Oberflächen-Verhältnis von Brühe, wie hier angegeben, ist erforderlich, um maximal gekapselte Bazillen zu produzieren. - Schütteln Sie die BrüheKultur bei 125 Rpm, 37 °C mit 20%CO2 und Luftfeuchtigkeit für 18–24 h.
HINWEIS: Der Anbau von B. Anthracis bei Temperaturen über 37 °C kann die Kapselproduktion hemmen. - Verwenden Sie negative Färbung mit Indientinte, um eine ausreichende Verkapselung zu gewährleisten und sicherzustellen, dass Bazillen in kurzen Ketten (1–5 Bacilli/Kette) vor der Fixierung sind (siehe Abschnitt 3).
- Um koloniebildende Einheiten (CFU) zu bestimmen, verdünnen Sie seriell 100 l Kultur 1:10 in Phosphatgepufferte Kochin (PBS) Lösung und Plattenkultur Verdünnungen auf Schafsblut Agarplatten. 12–18 h bei 37 °C inkubieren. Zählen Sie KBE und bestimmen Sie die Anzahl der Bakterien pro ml Kultur.
HINWEIS: Die Zählung kann auch mit einem Hämozytometer unter dem Mikroskop durchgeführt werden, sobald die Bakterien fixiert sind. Dies wird jedoch nicht empfohlen, da die Bazillen bei geringer Vergrößerung schwer zu erkennen sind. - Fügen Sie 16% Paraformaldehyd (PF) in das gesamte Volumen der Bakterienkultur mit einer Endkonzentration von 4% PF hinzu, um die Bacilli zu fixieren. Langsam auf einem Shaker bei Umgebungstemperatur für 7 Tage bewegen.
HINWEIS: Sieben Tage Inkubation in 4% PF basiert auf dem institutionellen Standardverfahren DER USAMRIID zur Fixierung vegetativer Bazillen. - Um das Fixativ zu entfernen und sterilitätsprüfen, waschen Sie dreimal 4 ml (10 % Volumen) fester bakterieller Suspension in einem 50 ml konischen Rohr durch Zentrifugation bei ≥3000 x g für 45 min und mit einer 30 ml/Waschanlage mit PBS. Bewahren Sie die verbleibende Probe in 4% PF bei 4 °C auf.
HINWEIS: Nach dem Pellet ist das bakterielle Pellet aufgrund des Vorhandenseins einer Kapsel flauschig. Achten Sie darauf, das Pellet beim Waschen nicht zu stören. Es ist notwendig, alle fixativen zu entfernen, so dass es nicht mit der Rentabilität sprossierung stört. Erhöhen Sie bei Bedarf die Anzahl der Wähbe. - Für die Wirtschaftlichkeitsprüfung 40 ml eines bakteriellen Wachstumsmediums (z. B. BHI-Brühe) mit 4 ml gewaschener Suspension (≤ 10% des Brühevolumens) impfen und 7 Tage lang bei 37 °C inkubieren. Überprüfen Sie die optische Dichte bei 600 nm vor und nach 7 Tagen, um die Trübung zu messen.
- Nach 7 Tagen Inkubation in der Brühekultur ≥100 L Brühe auf eine Agarplatte und brüten weitere 7 Tage. Wenn keine Zunahme der Trübung und kein Wachstum auf Platten zu sehen sind, gilt die ursprüngliche Kultur als steril und kann in ein BSL-2 Labor übertragen werden.
HINWEIS: Das Federal Select Agent Program22 schreibt vor, dass inaktivierte B. anthracis nur aus BSL-3-Labors übertragen werden können, nachdem eine vollständige Sterilität der Probe nachgewiesen wurde. Die Durchführbarkeitsprüfung für inaktivierte B. Anthracis besteht darin, 10% der Probe 7 Tage lang in Brühe zu kultivieren, gefolgt von einer Kultivierung auf festem Medium für weitere 7 Tage22,23. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien, um die Übertragungsgenehmigung zu erhalten, sobald die Sterilität festgelegt ist.
3. Negative Färbung und Lichtmikroskopie zur Beobachtung von Verkapselungs- und Bazillketten
- Mischen Sie die bakterielle Suspension mit 2 L Indien-Tinte auf einem Mikroskopschlitten. Legen Sie ein 1 oder 1,5 m dickes Deckglas auf die Federung, ohne Blasen zu erzeugen.
HINWEIS: Nagellack kann verwendet werden, um das Deckglas auf dem Schlitten zu versiegeln. - Beobachten Sie die bakterielle Suspension mit einer 40x bis 100x Ölobjektivlinse auf einem Lichtmikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Bazillen gekapselt werden, indem Sie eine Clearance-Zone (Kapsel ohne Indientinte) um jedes Bakterium herum beobachten und dass die Bacilli-Ketten kurz sind.
4. FITC-Kennzeichnung von Bakterien
- Fluoresceinisothiocyanat (FITC) in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 2 mg/ml auflösen.
- Messen Sie das Volumen des inaktivierten Bakterienbestands.
- Waschen Sie den Lagerbestand 3x in PBS, um fixative zu entfernen.
- Fügen Sie die FITC-Lösung in einer Endkonzentration von 75 g/ml hinzu. Langsames Rühren für 18–24 h bei 4 °C.
- Dreimal waschen Sie die Bakterien durch Pelletieren bei ≥3000 x g, 45 min und mit 30 ml PBS/Wash, um überschüssiges FITC zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass das flauschige Pellet beim Waschen nicht gestört wird. Setzen Sie die Bacilli in PBS im gleichen Startvolumen wieder aus.
- Aliquot und lagern Sie die Bazillen in Mikroröhren bei -20 °C bis zur Verwendung. Bhasillen nicht mehrmals einfrieren/tauen, da die Bazillen die Kapsel verlieren können.
5. Bakterielle Opsonisierung
- Wärme inaktivieren ein kleines Volumen von Testsera (von NHPs) bei 56 °C für 30 min in einem Wärmeblock.
- FITC-markierte Bakterien mit PBS 2x durch Granulieren bei 15000 x g für 3–5 min auftauen und waschen. Resuspend ieren in PBS im gleichen Startvolumen.
- In einer 96 gut runden Bodenplatte (Platte #2) werden die Testseren im Zellmedium seriell verdünnt. In einem weiteren 96 gut runden Bodenplatte (Platte #3) 10 l verdünnte Testseren in jeden Brunnen geben.
HINWEIS: In jeder Platte wurden PBS und normale Affenseren anstelle von verdünnten Testseren als Negativkontrollen einbezogen. Wir haben auch ein Testserum als Positivkontrolle gewählt, um eine Standardkurve zu generieren, um alle Assays zu normalisieren, die an verschiedenen Tagen durchgeführt werden. Das Positivkontroll-Testserum wurde willkürlich gewählt, weil es reichlich vorhanden war. - Auf Platte #3, fügen Sie 10 l frisch rekonstituierte Baby Kaninchen Ergänzung.
HINWEIS: Nach der Rekonstituiertwerden, entsorgen Sie die verbleibenden Babykaninchen Komplement; nicht wieder einfrieren und auftauen. - Um platte #3, fügen Sie das entsprechende Volumen von FITC-markierten Bazillen für eine Vielzahl von Infektionen von 1:20. Fügen Sie beispielsweise das Volumen hinzu, das 5 x 104 x 20 Bacilli für 5 x 104 Zellen enthält. Jeden Brunnen in der Platte #3 mit dem entsprechenden Volumen des Zellmediums auf insgesamt 105 l ab.
ANMERKUNG: Die Platte #1, die Zellen enthält, erhält 100 L opsonisierte Bakterien, wobei die restlichen 5 l als Leervolumen enthalten sind. Wir haben jede Verdünnung der Testseren in doppelter Ausführung getestet. - Inkubationsplatte #3 bei 37 °C für 30 min in Gegenwart von 5%CO2 mit Feuchtigkeit, um Bazillen zu opsonisieren.
6. Adherence Assay und fluoreszierende Kennzeichnung von Säugetierzellen
- Halten Sie alle Reagenzien vor der Anwendung bei 37 °C auf.
- Platte #1, die haftende Zellen enthält, auf einen 37 °C-Wärmeblock legen.
- Verwenden Sie einen Mehrkanalpipetten, um verbrauchte Mittel aus Brunnen zu entfernen und schnell durch 100 l opsonisierte Bakterien aus platte#3 zu ersetzen. Stellen Sie sicher, dass während des Pipetierens keine Blasen in den Brunnen erzeugt wurden. Inkubationsplatte #1 bei 37 °C mit 5%CO2 und Feuchtigkeit für 30 min zur Haftung.
- Waschen Sie jeden Brunnen 5x mit 150 L PBS auf einem 37 °C-Wärmeblock, um ungebundene Bazillen zu entfernen.
HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, dass die Zellen beim Waschen nicht versehentlich dispergiert werden. - Verdünnen Sie 16% PF mit PBS 1:4, um 4% PF zu machen. Fixzellen mit 4% PF für 1 h, indem Sie jedem Brunnen 150 l hinzufügen. Waschen Sie Zellen 2x mit PBS.
- Mischen Sie 2 l HCS (High-Content-Screening) Orange Cell Stain in 10 ml PBS. Fügen Sie 150 l dieser Färbelösung zu festen Zellen hinzu und brüten sie 30 min bei Umgebungstemperatur.
- Waschen Sie Brunnen 2x mit PBS.
- Bei 4 °C bis zur Mikroskopie lagern.
7. Mikroskopie
HINWEIS: Im Allgemeinen erleichtert ein automatisiertes Fluoreszenzmikroskop mit hohem Durchsatz die Bildgebung für die OAA. Wenn ein automatisiertes System nicht verfügbar ist, können fluoreszierende Bilder von haftenden Bazillen manuell aufgenommen werden21. In dieser Studie wurden20,anhähnte Bazillen und Zellmonolayer mit dem Zeiss 700 Laserscanmikroskopiesystem mit spezialisierter Ausrüstung abgebildet; Unser System bestand aus dem invertierten Zeiss Axio Observer Z1 Mikroskop, das mit einer automatisierten Stufe, dem Definite Focus Modul, 40 x NA 0.6 objektiv, axio Cam HRc Kamera und Zen 2012 (Blue Edition) Software ausgestattet ist. Bei den aufgenommenen Bildern handelt es sich um Weitfeldbilder, nicht um konfokale Bilder. Das folgende Protokoll ist als grundlegendes Mikroskop-Setup gedacht, das für eine Vielzahl von automatisierten Mikroskopiesystemen geeignet ist.
- Inkubationsplatte #1 bei Umgebungstemperatur für 30 min. Schalten Sie das Mikroskop und die zugehörigen Geräte ein.
HINWEIS: Die Akklimatisierung bei Umgebungstemperatur verhindert, dass sich während der Bildgebung Kondensation auf der Glasplatte bildet. Darüber hinaus verhindert es die Defokussierung durch Temperaturverschiebung. - Platzieren Sie die Platte auf der Bühne und konzentrieren Sie sich auf die Zellen mit hellem Feld- oder Phasenkontrast.
- Wählen Sie 96 Gut-Format als Platteneinstellung. Wählen Sie Kanaleinstellungen aus.
HINWEIS: Die Spitzenanregungs- und Emissionswellenlänge von FITC sind 495/519 nm; der HCS Orange-Zell-Fleck sind 556 und 572 nm. Je nach den Filtern, die auf dem Mikroskop verfügbar sind, können andere Fluorophore verwendet werden. - Wählen Sie die Einstellung auf Kachelmodus aus. Geben Sie die Anzahl der zu erstellenden Bilder an.
HINWEIS: Die Kachelfunktion ermöglicht die Erfassung mehrerer Positionen in einem Sample-Brunnen und kann so eingestellt werden, dass ein Bild in einem Kachel- oder Zufallsformat erfasst wird. Wir haben 10 zufällige Bereiche pro Brunnen abgebildet. - Ändern Sie den Erfassungsmodus in "schwarz & weiß" oder "monochrom" und ≥ 2x2.
HINWEIS: Die Einstellung des Binnings von 1x1 auf 2x2 oder 4x4 würde die Mikroskopiegeschwindigkeit erhöhen, aber auch zu einer niedrigeren Auflösung des Bildes führen. Für OAA reicht es aus, diese Einstellungen zu verwenden, da der Assay sowohl die Makrophagen als auch die anhaftenden Bakterien aufzählt. - Schalten Sie das Autofokus- oder Fokussiermodul ein. Geben Sie an, wie oft die Autofokussierungsfunktion ausgeführt werden soll. Aktivieren Sie die Z-Stack-Funktion, sofern verfügbar. Geben Sie die Anzahl der Z-Stacks an, die die Dicke der Zellmonolayer und der anhaftenden Bacilli erfassen.
HINWEIS: Die Anzahl der ausgewählten Z-Stacks erhöht die Mikroskopiezeit, stellt jedoch sicher, dass bei jedem Z-Stack ein Bild mit dem richtigen Fokus aufgenommen wird. - Legen Sie einen Dateiordner fest, in dem Bilder gespeichert werden sollen. Führen Sie das automatisierte Imaging-Programm aus.
8. Datenerhebung und -analyse
- Zählen Sie die Anzahl der anhaftenden Bacilli- und Säugetierzellen pro Bild. Zählen Sie jede Kette von Bacilli als ein Bakterium.
- Plotten Sie die Bacilli/Zellen des Positivkontroll-Testserums und titer (z. B. 1:10 Verdünnung ist 10 Titereinheiten), um eine Standardkurve in einem entsprechenden Statistikprogramm zu erzeugen.
- Analysieren Sie das Positivkontrolltestserum mithilfe der nichtlinearen Regressionskurvenanpassung. Analysieren Sie dann die restlichen Proben mit der Standardkurve des Positivkontrolltestserums, um die entsprechenden Titer zu bestimmen.
HINWEIS: Es ist in der Regel am genauesten, die Probenverdünnungen in der Mitte der Standardkurve zu wählen, wenn Titer bestimmt werden. - Berechnen Sie den geometrischen Mittelwert der Proben aus jeder Impfstoffgruppe. Berechnen Sie die P-Werte von logtransformierten Titern durch die geringste signifikante Differenz ANOVA-Analyse.
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Representative Results
Dieser Abschnitt zeigt repräsentative Mikrographen, die während eines OAA-Experiments gesammelt wurden, zusammen mit Ergebnissen, die zeigen, dass die OAA zur Untersuchung der biologischen Funktion von Antikörpern verwendet werden kann. Hier wurde der Assay erfolgreich eingesetzt, um die Wirksamkeit eines Milzbrand-Impfstoffkandidaten zu bewerten. Es ist wichtig, den Zustand der Verkapselung auf den Bazillen zu überprüfen, da wenig bis keine Verkapselung dazu führt, dass sie an Wirtszellen haften, wodurch ein hoher Hintergrund entsteht. Abbildung 1 ist ein Bild von B. anthracis Ames negativ mit Indientinte gefärbt, um die Verkapselung zu untersuchen. OAA erfordert, dass mehrere benachbarte Sichtfelder beleuchtet werden und wenn konfokale Mikroskopie verwendet wird, mehrere Stapel oder Abschnitte. Daher ist es notwendig, zu überprüfen, ob die Bazillen weder zu wenig noch Fotobleichmittel zu schnell sind. Abbildung 2 ist ein Bild der mit FITC beschrifteten Bazillen. Abbildung 3 zeigt maximale Projektionsbilder von B. anthracis Ames, die an den Zellmonolayern befestigt sind. Dies sind repräsentative Sichtfelder, die für die OAA gezählt und bewertet wurden. Die Erhöhung der Anhaftung von Bacilli mit PGGA-OMPC Antiserum inkubiert ist aufgrund der Anwesenheit von Anti-Kapsel-Antikörper, die die Bazillen opsonisiert. Abbildung 4 zeigt, dass die Serum-Titter von NHPs, die mit 10 und 50 g PGGA-OMPC geimpft wurden, deutlich höher sind als die Titer für OMPC und PGGA allein.
Abbildung 1. Ein indisches Tintenbild des fixen B. anthracis Ames. Beachten Sie die Zone der Clearance um die Bazillen aufgrund des Vorhandenseins von Kapsel. Bar = 10 m. Das Bild wurde auf dem automatisierten Mikroskopiesystem EVOS FL mit 100 x 1,4 numerischer Blende (NA) Ölobjektiv objektiv aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Bilder von FITC beschriftet fixiert B. anthracis Ames. (Links) Differentialinterferenz Kontrastbild; fluoreszierendes Bild pseudofarben in grün (Mitte); zusammengeführt (rechts). Bar = 10 m. Konfokale Bilder wurden auf der Zeiss 700 LSM Konfokalmikroskopie mit 40 x 1,3 NA Ölobjektiv objektiv aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Fluoreszierende Bilder von B. anthracis Ames hafteten an RAW 264.7 Zellmonolayern. Die Bazillen wurden mit Testserum von NHPs geimpft und mit (A) 10 g PGGA-OMPC, (B) 50 g PGGA-OMPC, (C) 50 g PGGA allein oder (D) OMPC allein verstärkt. Grün = B. anthracis Ames, rot = RAW 264.7 Zellen. Bar = 20 m. Weitfeldbilder wurden auf dem Zeiss Axio Observer Z1 Mikroskop mit 40 x 0,6 Objektiv objektiv und der Axio Cam HRc Kamera aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Opsono-Haft-Titer von NHPs, die mit 10 μg PGGA-OMPC, 50 g PGGA-OMPC, 50 μg PGGA allein oder OMPC allein geimpft sind. Die geometrischen Mittel von 5 Tieren pro Gruppe werden grafisch dargestellt. Fehlerbalken zeigen SEM. *p ≤ 0,001 im Vergleich zu PGGA allein an. Die p-Werte wurden mit ANOVA mit LSD-Posthoc-Test berechnet. Die Daten wurden ursprünglich in Chabot, et al., 201620veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Kapselbasierte Impfstoffe haben sich als wirksam gegen zahlreiche bakterielle Krankheitserreger erwiesen, und viele sind für den Einsatz beim Menschen zugelassen25,26,27. Diese Impfstoffe wirken, indem sie Antikörper erzeugen, die auf die Kapsel abzielen, und viele dieser Studien verwenden das OPKA, um die opsonophagozytischen Funktionen der Antikörper13,14,16,28,29zu zeigen. Aufgrund von Bedenken hinsichtlich der Biosicherheit und zur Benutzerfreundlichkeit haben wir ein OAA entwickelt, um Antikörper von Tieren zu bewerten, die mit B. Anthracis-Kapselkonjugaten geimpft sind. Das Vorhandensein von Kapsel auf B. Anthracis verhindert adhärenhafte und phagozytose30, aber die Opsonisierung von Bazillen mit Seren von geimpften Tieren induziert die Anhaftung an Makrophagen20,21.
Für OAA wird die Adhärenzaktivität, nicht Internalisierung und Tötung, verwendet, um opsonic Aktivität zu quantitieren. Dies bot der OAA mehrere Vorteile. Anstelle von lebenden Organismen konnten wir paraformaldehyd abgetötete, fluoreszierend gekapselte Bacilli verwenden. Veränderungen der bakteriellen Oberfläche durch Aldehydfixierung und fluoreszierende Etikettierung änderten nichts an der allgemeinen Haftung der Bakterien an den Makrophagen; feste und gekennzeichnete Bazillen waren nicht anhaftender als lebende Bazillen (Daten nicht dargestellt). Der Grad der Verkapselung kann von Kultur zu Kultur variieren und die Allgemeine Übereinstimmung trotz ähnlicher Wachstumsbedingungen beeinflussen. So ermöglicht die Verwendung eines einzigen inaktivierten Bakterienbestands die Standardisierung über Experimente hinweg, die an verschiedenen Tagen und in verschiedenen Versuchsgruppen durchgeführt werden. Dies war wertvoll für den Vergleich von Seren aus den 20 NHPs, die in dieser Arbeit verwendet werden, und sera, die in unseren kommenden Studien generiert werden. Zuletzt sind die meisten Makrophagen, einschließlich RAW 264.7-Zellen, empfindlich gegenüber dem Milzbrand-Tödlichtoxin, das vom lebenden Erreger31produziert wird, was die Verwendung von lebenden Blautmitteln von Natur aus problematischmacht.
Die Verwendung von RAW 264.7-Zellen erleichterte auch die Standardisierung. Wir verwendeten zunächst eine häufig verwendete Zelllinie in OPKA, HL-60 Zellen. Wir fanden jedoch Schwierigkeiten bei der Unterscheidung mit Granulozyten mit Dimethylformamid, wie von anderen28,32berichtet. RAW 264.7-Zellen haben den Vorteil, dass sie nicht chemisch differenziert werden müssen und haftbar und damit für mikroskopiebasierte OAA zugänglicher sind. Diese Zelllinie wurde in zahlreichen Phagozytose-Studien mit intrazellulären Erregern33,34, sowie B. anthracis31verwendet. Die Verwendung von RAW 264.7-Zellen, die von der Maus abgeleitet sind, ist auch deshalb von Vorteil, weil Maus-Fc-Rezeptoren in ihrer Bindungsspezifität für IgG aus anderen Arten35promiscuous sind. Dies ermöglichte es uns, die Anti-Kapsel-Antikörper von NHPs mit einer murinen Zelllinie zu bewerten.
Anthrax ist zwar selten, aber in einigen Regionen der Welt und den USA endemisch. Eine Sorge ist, dass die FBS verwendet, aus den USA, kann bereits Anti-Kapsel-Antikörper als Folge der Tier ausgesetzt B. Anthracis Sporen oder andere PGGA-produzierende Mikroben im Boden. Um dieses Problem zu beheben, wurde das FBS-Los, das wir verwendet haben, vorgetestet. Wir stellten fest, dass die Zugabe von wärmeinaktiviertem FBS die Einhaltung im Vergleich zu DMEM allein erhöht hat (Daten nicht gezeigt). Jedoch, Es erhöht nicht die Einhaltung im Vergleich zu Hitze inaktiviert normalen Seren von Meerschweinchen, Affe, Maus oder Mensch (Daten nicht gezeigt). Daher enthielt das FBS-Los, das wir verwendeten, keine Anti-Kapsel-Antikörper als Folge der Exposition. Darüber hinaus würde es auch keine Anti-Kapsel-Antikörper enthalten, da das Tier mit dem ungekapselten B. anthracis Sterne geimpft wird, einem Stamm, dem das für die Kapselproduktion notwendige PXO2-Plasmid fehlt. Das getestete FBS-Los wurde für alle nachfolgenden OAA verwendet.
Eine Einschränkung der Technik ist die Aufgabe, Bacilli und Zellen durch Laborpersonal zu zählen, was enorm viel Zeit und Mühe in Gemenge zu fall. Dies kann mit der Verwendung von Software behoben werden, die diese Art von Analyse hat; Diese Software war uns zu diesem Zeitpunkt nicht verfügbar. Da jedoch manuelles Zählen notwendig war, war ein kritischer Schritt die Entfernung oder Abwaschung von fremden und ungebundenen Bazillen, um die Aufgabe zu erleichtern. Es war auch notwendig, Reagenzien zu testen, die zu einem geringeren Hintergrundrauschen führten. OAA erfordert eine Quelle der Ergänzung, weil es die Opsonisierungverbessert 36. Daher haben wir eine Vielzahl von Komplementquellen getestet, darunter Meerschweinchen, Menschliche und Babykaninchen Komplement. Wir wählten Baby Kaninchen Ergänzung für unseren Test, weil wir festgestellt, dass es keine schwachen, multi-spezifische Aktivitäten gegen heterophile Antigene hat, es wird häufig in OPKA Studien14,15,37, und es ist leicht kommerziell erhältlich.
Wir halten die OAA für quantitativ und hochreproduzierbar. Wir verwenden es, um Studien mit Ligandenbindungstests wie ELISAs zu ergänzen, die nur den gesamten IgG-Spiegel quantifizieren, aber nicht zwischen funktionellen und nicht-funktionellen Antikörpern unterscheiden. OAA kann verwendet werden, um andere funktionelle Assays (z. B. serumbakterizide Aktivität und Toxinneutralisationstests) zu ergänzen, um die unterschiedliche Funktionalität von impfstofferzeugten Antikörpern16,38zu zeigen. Die Entwicklung von OAA hat unser Repertoire an Immunogenitätsstudien zur Bewertung von Impfstoffen und Therapeutika erweitert.
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Disclosures
Die Autoren haben keine kommerzielle oder andere Assoziation, die einen Interessenkonflikt darstellen könnte.
Acknowledgments
J. Chua, D. Chabot und A. Friedlander entwarfen die im Manuskript beschriebenen Verfahren. J. Chua und T. Putmon-Taylor führten die Experimente durch. D. Chabot führte eine Datenanalyse durch. J. Chua schrieb das Manuskript.
Die Autoren danken Kyle J. Fitts für die hervorragende technische Unterstützung.
Die Arbeit wurde von der Defense Threat Reduction Agency unterstützt. VAXBT.03.10.RD.015, Plannummer 921175.
Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die der Autoren und werden nicht unbedingt von der US-Armee unterstützt. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Verteidigungsministeriums wider, noch impliziert die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen eine Billigung durch die US-Regierung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
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