Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לתפעל ישירות קולטני אזור tegmental גחוני ללמוד את תרומתם לשחרור דופמין תת שנייה.
Abstract
שחרור דופמין פאסיק (DA) מהאזור הטגמנטלי הגחוני (VTA) לגרעין האקומבנס ממלא תפקיד מרכזי בעיבוד תגמול ולמידה חיזוק. הבנת האופן שבו התשומות העצביות המגוונות לתוך שחרור DA פאזי של בקרת VTA יכולה לספק תמונה טובה יותר של המעגלים השולטים בעיבוד תגמול ולמידת חיזוק. כאן, אנו מתארים שיטה המשלבת חליטות צינוריות פנים-VTA של אגוניסטים ואנטגוניסטים רוקח עם שחרור DA פאזי מעורר גירוי (עירוי וגירוי משולב, או CIS) כפי שנמדד על ידי voltammetry מחזורי סריקה מהירה (FSCV). באמצעות CIS-FSCV בחולדות מרדים, תגובת DAphasic יכול להיות מעורר על ידי גירוי חשמלי VTA עם אלקטרודה דו קוטבית מצוידת צינורית תוך הקלטה בליבת גרעין האקומבנס. אגוניסטים רוקח או אנטגוניסטים ניתן להחדיר ישירות באתר הגירוי כדי לחקור תפקידים ספציפיים של קולטני VTA בנהיגה שחרור DAphasic. היתרון העיקרי של CIS-FSCV הוא כי תפקוד קולטן VTA ניתן ללמוד ב vivo, בניית מחקרים במבחנה.
Introduction
שחרור דופמין פאסיק (DA) מהאזור הטגמנטלי הגחוני (VTA) לגרעין האקומבנס (NAc) ממלא תפקיד חיוני בהתנהגויות הקשורות לתגמול. נוירונים VTA DA לעבור מירי דמוי טוניק (3-8 הרץ) לירי דמוי פרץ (>14 הרץ)1, אשר מייצר שחרור DA פאזי ב- NAc. VTA מבטא מגוון של קולטנים סומטונדריטיים הממוקמים היטב כדי לשלוט על המתג מטוניק לפרץירי 2,3,4,5. זיהוי אילו קולטנים אלה, והתשומות המתאימות להם, שחרור DA פאזי שליטה יעמיקו את הבנתנו כיצד מאורגנים המעגלים הקשורים לתגמול. מטרת המתודולוגיה המתוארת כאן, עירוי וגירוי משולבים עם וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (CIS-FSCV), היא להעריך במהירות ובחזקה את הפונקציונליות של קולטני VTA בנהיגה שחרור DAphasic.
המונח עירוי וגירוי משולבים (CIS) מתייחס קולטנים מניפולציה פרמקולוגית על קבוצה של נוירונים (כאן VTA) וממריץ נוירונים אלה ללמוד את תפקוד הקולטן. בחולדה המרדים, אנו מעוררים חשמלית את ה- VTA לעורר אות DA פאזי גדול (1-2 מיקרומטר) בליבת NAc, כפי שנמדד על ידי וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (FSCV). חליטות של תרופות פרמקולוגיות (כלומר, אגוניסטים קולטן/אנטגוניסטים) באתר הגירוי ניתן להשתמש כדי למדוד את הפונקציה של קולטני VTA על ידי התבוננות בשינוי הבא בשחרור DA פאזי מעורר. FSCV היא גישה אלקטרוכימית הנהנית הן מרחבית גבוהה (50-100 מיקרומטר) והן רזולוציה זמנית (10 הרץ), ומתאימה היטב למדוד אירועי DA פאזיים הקשורים לתגמול6,7. רזולוציה זו עדינה יותר ממדידות נוירוכימיות אחרות של vivo, כגון מיקרודיאליזה. לכן, יחד, CIS-FSCV מתאים היטב כדי להעריך ויסות קולטן VTA של שחרור דופמין פאזי.
דרך נפוצה אחת לחקור את תפקוד קולטן VTA היא באמצעות שילוב של גישות אלקטרופיזיולוגיות המטפלות באופן שבו קולטנים אלה משנים את קצב הירי של נוירונים1,8. מחקרים אלה הם בעלי ערך רב בהבנת מה קולטנים מעורבים בהנעת DA ירי בעת ההפעלה. עם זאת, מחקרים אלה יכולים רק להציע מה עלול לקרות במורד הזרם במסוף אקסון (כלומר, שחרור של נוירוטרנסמיטר). CIS-FSCV בונה על מחקרים אלקטרופיזיולוגיים אלה על ידי מענה כיצד הפלט של VTA פרץ ירי, שחרור DA פאזי, מוסדר על ידי קולטנים הממוקמים על דנדריטים VTA וגופי תאים. לכן, CIS-FSCV מתאים היטב לבנות על מחקרים אלקטרופיזיולוגיים אלה. כדוגמה, הפעלת קולטן nicotinic יכול לגרום יריפרץב VTA 9 , ו CIS-FSCV בחולדה מרדים שימש כדי להראות כי קולטן אצטילכולין nicotinic (nAChR) הפעלת VTA גם שולט שחרור DA פאזי ב NAc10,11.
בדיקה מכנית של רגולציה DAphasic נלמד גם בדרך כלל באמצעות תכשירי פרוסה יחד עם יישום אמבטיה של תרופות. מחקרים אלה מתמקדים לעתים קרובות ברגולציה presynaptic של שחרור DAphasic מסופי דופמין, כמו גופי התא מוסרים לעתים קרובות מן הפרוסה12. תכשירים אלה הם בעלי ערך לחקר השפעות קולטן presynaptic על מסופי דופמין, בעוד CIS-FSCV מתאים יותר ללמוד השפעות קולטן סומטונדריטי על נוירונים דופמין, כמו גם תשומות presynaptic ל- VTA. הבחנה זו חשובה, כי הפעלת קולטן somatodendritic ב- VTA עשוי להיות השפעה שונה מאשר הפעלת קולטן פרסינפטי NAc. ואכן, חסימת דופאמין presynaptic nAChRs ב NAc יכול להעלות את שחרור דופמין פאזי במהלך פרץ ירי13, ואילו ההפך נכון VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV היא גישה אידיאלית לחקר היכולת של קולטני VTA לווסת את שחרור DA פאזי. חשוב לציין, גישה זו יכולה להתבצע בחולדה שלמה, או מרדים או לנוע חופשי. גישה זו מתאימה למחקרים חריפים, כדי לחקור את תפקוד הקולטן במצב הבסיסי שלה10,14, כמו גם מחקרים ארוכי טווח שיכולים להעריך שינויים תפקודיים קולטן לאחר חשיפה לסמים או מניפולציה התנהגותית11,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים נערכו על פי מדריך המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו הן על ידי מכללת אליזבתטאון והן על ידי אוניברסיטת ייל מוסדית לטיפול בבעלי חיים והוועדה לטיפול בבעלי חיים (IACUC). פרוטוקול זה הוא ספציפי להכנת חולדה מרדים של ניצול CIS-FSCV.
1. הכנות פרסוקרתיות
- הכנת פתרון אלקטרודה
- כדי להפוך את פתרון מילוי גב אלקטרודה, להכין פתרון של 4 M אשלגן אצטט עם 140 mM אשלגן כלורי16.
- הכנת אלקטרודה
- באמצעות שאיבה ואקום, הכנס סיבי פחמן T-650 (7 מיקרומטר קוטר) לתוך נימי זכוכית בורוסיליקט (אורך = 100 מ"מ, קוטר = 1.0 מ"מ, קוטר פנימי = 0.5 מ"מ).
- לאחר סיבי הפחמן הונח בתוך נימי הזכוכית, מניחים את נימי הזכוכית לתוך פולר אלקטרודה אנכי, עם אלמנט החום בערך באמצע הנימי. הגדר את התנור ל 55 עם המגנט כבוי.
- לאחר הנימי נמשך, בזהירות להעלות את מחזיק נימי העליון, כך קצה האלקטרודה אינו מוקף גוף חימום.
- בעזרת מספריים חדים, חותכים את סיבי הפחמן שעדיין מחברים בין שתי חתיכות הנימי. התוצאה תהיה שני מיקרואלקטרודים נפרדים של סיבי פחמן.
- תחת מיקרוסקופ קל, לחתוך בזהירות את סיבי הפחמן החשופים עם אזמל חד, כך סיבי הפחמן משתרע כ 75-100 מיקרומטר מעבר לסוף הזכוכית.
- באמצעות מיקרוסקופ אור, ודא כי האלקטרודה היא ללא סדקים לאורך נימי. כמו כן, להבטיח כי החותם, שבו סיבי הפחמן יוצא נימי, קשה להבחין ללא סדקים.
הערה: חותם טוב יעזור להפחית רעש במהלך ההקלטות. ראה מחקרים שפורסמו17,18,19 לפרוטוקול מפורט יותר.
- ייצור אלקטרודה ייחוס
- הלחמה סיכת זהב לחוט כסף 5 ס"מ.
- חבר את האנודה למהדק נייר ממתכת או למוליך אחר, הקתודה לסיכה, והחל מתח (~ 2 V) בעוד מהדק הנייר וחוט הכסף שקועים ב- 0.1 M HCl.
- הפסק את המתח ברגע שציפוי לבן (AgCl) מופיע על חוט הכסף.
- הכנת אלקטרודה להשתלת
- הלחמה סיכת זהב לחוט מבודד דק (אורך ~ 10 ס"מ, קוטר <0.50 מ"מ).
- הסר ~ 5 ס"מ של בידוד מן החוט מול סיכת הזהב.
- מלא את האלקטרודה בערך באמצע הדרך עם פתרון אלקטרודה.
- הכנס חוט מבודד לתוך האלקטרודה.
הערה: החוט צריך ליצור קשר עם סיבי הפחמן בתוך האלקטרודה.
2. השתלות אלקטרודה
- תן לחולדות בוגרות, זכריות, ספראג דולי (250−450 גרם) הזרקה תוך-איטרא-איטרציונלית (1.5 גרם/ק"ג או נפח של 1 מ"ל/ק"ג) של 0.5 גרם/מ"ל אורתאן מומס בתמיסת מלח סטרילית. התחל עם מינון הurethane הראשוני של 1.0−1.2 גרם/ק"ג. אם החיה עדיין מגיבה לבדיקת הגירוי הרעיל (צביטת זנב) 20 דקות לאחר מתן השופכה, יש צורך במנה כוללת נוספת של 0.3−0.5 גרם/ק"ג עבור מנה כוללת של 1.5 גרם/ק"ג.
הערה: להכנת פתרון אורתאן 0.5 גרם / מ"ל, להוסיף 10 גרם של אורתאן כדי 10 גרם (~ 10 מ"ל) של מלוחים. אורתאן הוא מסרטן ויש לטפל בו בזהירות. אורתאן הוא הרדמה חשובה, כפי שהוא אינו משנה את רמות הדופמין, כמו גם הרדמה אחרת כגון קטמין / קסילאסין וכלורל הידרציה20,21. - ברגע שהחיה היא מרדימה עמוקה ואינה מגיבה לגירויים מזיקים (למשל, צביטת בוהן), מניחים אותה במסגרת הסטריאוטקסית. יש למרוח חומר סיכה עיניים על כל עין של החולדה.
הערה: זהו ניתוח שאינו הישרדות, אך מעודדים טכניקה אספטית טובה. - נקה את הקרקפת של החולדה באמצעות קרצוף דו-שלבי (כלומר, קרצוף iodopovidone ואחריו קרצוף אתנול 70%; לבצע עם חזרה 3 מחזור).
- חותכים את רקמת הקרקפת באמצעות פינצטה של האף מחט מעוקר ומספריים כירורגיות. הסר כמות משמעותית של רקמה כדי לפנות מקום להשתלות השונות המתוארות להלן.
- יש לנקות בעדינות את משטח הגולגולת באמצעות אפליקטורים מעוקרים של קצה כותנה. לאחר מכן להחיל 2−3 טיפות של 3% מי חמצן כדי לעזור לזהות את lambda ו bregma.
- באמצעות מקדחה סטריאוטקסית או ידנית (1.0 מ"מ, כ-20,000 סל"ד), מקדחים חור בקוטר 1.5 מ"מ בקוטר 2.5 מ"מ, 2.5 מ"מ, לרוחב ברגמה. חלקית (בערך באמצע הדרך, עד שהוא יציב במקום) להשתיל בורג (1.59 מ"מ O.D., 3.2 מ"מ ארוך) בחור זה. מומלץ להשתמש מלוחים סטריליים להשקיה בעת הקידוח כדי למנוע פגיעה תרמית.
- עבור אלקטרודה הייחוס, לקדוח חור בקוטר 1.0 מ"מ 1.5 מ"מ קדמי ו 3.5 מ"מ לרוחב ברגמה, בחצי הכדור השמאלי.
- ביד, להכניס ~ 2 מ"מ של חוט התייחסות לתוך החור הזה, תוך גלישת חוט הייחוס סביב ומתחת לראשו של הבורג המושתל.
- להשתיל את הבורג באופן מלא, מצמיד את אלקטרודה הייחוס במקום.
- בחצי הכדור הימני, לקדוח חור בקוטר 1.5 מ"מ 1.2 מ"מ קדמי ו 1.4 מ"מ לרוחב ברגמה.
- הסר בעדינות את הדורה באמצעות פינצטה.
- עבור האלקטרודה הממריצה, לקדוח חור מרובע (2 מ"מ הקדמי-אחורי, 5 מ"מ מ"מ מנדל-לרוחב) מרוכז 5.2 מ"מ אחורי ו 1.0 מ"מ לרוחב ברגמה.
- באמצעות מוטות הזרוע הסטריאו-פקטיים, הורידו את הצינורית המעוררת/מדריך הדו-קוטבית 5 מ"מ מתחת לדורה. במקרה של דימום במהלך ההשתלה של האלקטרודה, להשתמש צמר גפן סטרילי גזה כדי למזער את הדימום.
הערה: האלקטרודה הממריצה הדו קוטבית המשמשת בשיטה זו מותאמת מראש עם צינורית מדריך(טבלת חומרים). הצינורית הפנימית המשמשת עם פריט זה צריך להיות סמוק עם ניחני האלקטרודה מגרה דו קוטבי כאשר מוכנס במלואו לתוך צינורית המדריך. זה יאפשר את הצינורית הפנימית לשבת ישירות בין שני חוד החנית של הממריץ, אשר יושבים על 1 מ"מ זה מזה. פרוטוקול דומה מתואר במקום אחר14. - באמצעות מוטות הזרוע הסטריאו-טסטרואטקטיים, הורידו את מיקרו-המיקרו-קטרוד של סיבי הפחמן 4 מ"מ מתחת לדורה. מיקום זה נמצא בחלק החלק החלקי ביותר של הסטריאטום.
- חבר את חוט הייחוס וסיבי הפחמן לפוטנציוסטט.
- החל צורת גל משולשת (-0.4−1.3 V, 400 V/s) למשך 15 דקות ב-60 הרץ, ושוב למשך 10 דקות ב-10 הרץ.
הערה: בדרך כלל, בעת החלת צורות גל על מיקרו-ectrodes סיבי פחמן במוח, קבוצות תחמוצת מתווספות לפני השטח של סיבי הפחמן. יש להגיע לשיווי משקל של תגובה זו לפני ההקלטה; אחרת סחיפה משמעותיתתתרחש 19. רכיבה על אופניים האלקטרודה בתדרים גבוהים יותר (60 הרץ) מאפשר סיבי הפחמן להשיג שיווי משקל מהר יותר.
3. אופטימיזציה של סיבי פחמן וממריץ מיקומי צינוריות אלקטרודה/מדריך
- הגדר את הממריץ כדי לייצר צורת גל חשמלית דו קוטבית, עם תדר של 60 הרץ, 24 פולסים, זרם 300 μA ורוחב דופק של 2 אלפיות שניים / פאזה.
- הוריד בעדינות את הממריץ במרווחים של 0.2 מ"מ מ-5 מ"מ ל-7.8 מ"מ מתחת לדורה. בכל תוספת, לעורר את VTA.
הערה: בעומקים יותר של עור (5−6 מ"מ), גירוי המוח בדרך כלל (~ 80% מהזמן) לגרום לשפם של החולדה להתעוות. בעומקים נוספים, השפם יפסיק עוויתות, אשר מתרחשת בין 7.5−8.2 מ"מ מתחת לדורה. כאשר השפם מפסיק להתעוות, האלקטרודה הממריצה תהיה קרובה או ב- VTA. זה לא יקרה בכל חולדה, וחוסר עוויתות שפם לא צריך להיחשב כסימן כי צינורית אלקטרודה / עירוי מגרה דו קוטבי אינו במקומו. עוויתות שפם לא יכול להתרחש עבור כל ההרדמה (למשל, איזופלוראן). - המשך להוריד את הצינורית האלקטרודה/מדריך המעוררת הדו-קוטבית עד שגירוי מייצר שחרור DA פאזי במיקרו-קטרודת סיבי הפחמן (שנמצאת כיום בסטריאטום גב).
הערה: שחרור DA בסטריאטום גב לא תמיד יתרחש אם האלקטרודה הדו קוטבית מושתלת ב- VTA, אבל התבוננות בשחרור DA בסטריאטום גב על גירוי VTA הוא בדרך כלל סימן טוב כי אות טוב יהיה נצפה בליבת NAc. - מנמיכים את סיבי הפחמן מיקרו-קטרוד עד שהוא לפחות 6.0 מ"מ מתחת לדורה. זהו החלק הכי גדול של ליבת NAc.
- לעורר את VTA ולתעד את משרעת השיא של שיא DA.
- להנמיך או להעלות את microelectrode סיבי פחמן באתר המייצר את שחרור DA הגדול ביותר.
- ודא כי שיא התגובה DA הוא שיא חמצון ברור ב 0.6 V ושיא הפחתה ב -0.2 V. פסגות אלה מעידות על DA.
4. שילוב עירוי וגירוי FSCV הקלטה
הערה: איור 1 מציג את ציר הזמן להקלטה לפני ואחרי מיקרו-fusion VTA.
- לאחר סיבי פחמן ומיקום צינורית אלקטרודה / מדריך מגרה כבר אופטימיזציה, לעורר במשך ~ 20−30 דקות.
הערה: תחת הפרמטרים הגירוי הנוכחי, לא לעורר יותר מפעם אחת בכל 3 דקות, כדי לאפשר טעינה מחדש של כלי רכב22. - לאחר השגת בסיס יציב (<20% וריאציה על פני חמישה גירויים), בעדינות להוריד את הצינורית הפנימית ביד לתוך צינורית המדריך כי הוא prefitted לתוך ממריץ דו קוטבי.
- קח הקלטות בסיסיות נוספות של 2−3 כדי להבטיח שהכנסת הצינורית עצמה לא גרמה לשינוי באות המעורר. במקרים מסוימים, החדרה והסרה של הצינורית הפנימית יכול לגרום נזק VTA. אם האות משתנה באופן דרסטי במהלך תקופת בסיס זו (>20%), יש לבצע הקלטות נוספות של 3−4 עד לשחזור הבסיס.
- באמצעות משאבת מזרק ומיקרו-מזרק, להחדיר 0.5 μL של פתרון (למשל, 0.9% מלוחים, N-מתיל-D-אספרטט [NMDA], (2R)-אמינו-5-חומצה פוספונובלרית [AP5]) לתוך VTA על פני תקופה של 2 דקות.
- לאחר ההדבקה, להשאיר את הצינורית הפנימית לפחות 1 דקות לפני ההסרה.
הערה: תרופות מסוימות עשויות לדרוש עזיבת הצינורית הפנימית במשך זמן רב יותר בהתבסס על קינטיקה סמים, והסרת הצינורית הפנימית עלולה לגרום לתרופה לנסוע בחזרה דרך הצינורית הפנימית. אם יש חשש, אפשר להשאיר את הצינורית הפנימית ב צינורית המדריך במהלך כל ההקלטה. אחרת, ההקלטה יכולה להתחיל לאחר מרווח זמן של דקה אחת. - המשך להקליט כל 3 דקות כדי למדוד אפקטים לאחר ההנפצה.
הערה: אם מחדיר פתרון בקרה, ולא נצפתה השפעה, ניתן להחדיר בפעם השנייה10. אם יש שחרור DA שונה הנגרמת על ידי החדרת צינורית פנימית או עירוי מלוחים, האות בדרך כלל מתאושש לקו הבסיס בתוך 30 דקות.
5. אימות היסתולוגי של מיקום אלקטרודה
- בסוף הניסוי, ליצור נגע קטן באתר ההקלטה באמצעות microelectrode סיבי פחמן.
- אם יש לשמר את האלקטרודה לכיול לאחר הניסיון, השתמש בחוט טונגסטן המוצב בני נימי זכוכית הבולט ~ 100 מיקרומטר מעבר לקצה הנימי. במקרה זה, להעלות את האלקטרודה מהמוח, להחליף את אלקטרודה ההקלטה עם אלקטרודה טונגסטן, ולהוריד אותו לאותה קואורדינטות דורסוונטרליות.
הערה: סיבי הפחמן עשויים לשמש נגע גם למוח ויספקו ייצוג מדויק יותר של המיקום של אתר ההקלטה; עם זאת, הנסיין יאבד את היכולת לכייל אלקטרודות אלה.
- אם יש לשמר את האלקטרודה לכיול לאחר הניסיון, השתמש בחוט טונגסטן המוצב בני נימי זכוכית הבולט ~ 100 מיקרומטר מעבר לקצה הנימי. במקרה זה, להעלות את האלקטרודה מהמוח, להחליף את אלקטרודה ההקלטה עם אלקטרודה טונגסטן, ולהוריד אותו לאותה קואורדינטות דורסוונטרליות.
- כדי לצל את אתר ההקלטה, להחיל מתח באמצעות ספק כוח. התחל ב- 1 V והגדל ב- 1 V כל 10 s עד 10 V.
- המתת חסד החיה באמצעות זריקה תוך-איפריטונית קטלנית של פנטוברביטל (150 מ"ג/ק"ג).
- לנטרל את החולדה באמצעות פתרון פורמלין 4%.
- הסר את הראש מן החולדה באמצעות גיליוטינה מחודדת.
- באמצעות rongeurs, להסיר את רקמת החיבור ואת הגולגולת המקיפה את המוח, בעדינות להוציא את המוח מכל רקמה שנותרה.
- לאחסן את המוח ב 4% פורמלין ליום אחד ולאחר מכן להעביר אותו ל 30% סוכרוז.
הערה: זלוף עם 4% פורמלין אין צורך לראות את אתר הנגע, אם כי כתרגול הטוב ביותר זה ישפר את השחזור של אתר הנגע. - צור 30 פרוסות מיקרומטר של המוח באמצעות cryostat.
- הרנו את הפרוסות על שקופיות וכסו במכתר כיסוי.
- ציין את המיקום של נגע microelectrode סיבי פחמן ומעורר דו קוטבי / צינורית עירוי באמצעות מיקרוסקופ אור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CIS-FSCV שימש כדי ללמוד את הפונקציה של קולטני VTA N-מתיל-D-אספרטט (NMDAR), קולטני אצטילכולין nicotinic (nAChRs), וקולטנים אצטילכולין muscarinic (mAChRs) בנהיגה שחרור DA פאזי בליבת NAc. איור 2 מציג נתונים מייצגים לשליטה שלילית, עירוי של 0.9% תמיסת מלח, לפני (בסיסי) ו-9 דקות לאחר התפוגגות (מלוחים). איור 2 מציג התוויית צבע עם פוטנציאל בציר ה-y, זמן בציר ה-x וזרם (המיוצג כצבע כוזב) בציר z, עקבות נוכחיות לעומת זמן (IvT), וכן וולטמוגרמה מחזורית שנלקחה בשיא התגובה המעוררת כדי להדגים שהניתוח שנמדד תואם ל- DA. כצפוי, עירוי מלוחים לא שינה את שחרור DA פאזי מגורה.
כדי להדגים כי CIS-FSCV יכול לייצר אפקטים דו כיווניים בעת שימוש אגוניסטים ואנטגוניסטים, השווינו את ההשפעות של עירוי של אגוניסט NMDAR, NMDA (500 ננוגרם; איור 3A) לאנטגוניסט NMDAR, AP5 (1 מיקרוגרם; איור 3B). עירוי של NMDA הניב עלייה חזקה בשחרור DA פאזי מגורה (איור 3A, 9 דקות לאחר עירוי) בעוד היריב התחרותי NMDAR, AP5 (1 מיקרוגרם), הפיק ירידה חזקה(איור 3B, 9 דקות לאחר עירוי). כדי להדגים את התועלת של CIS-FSCV באמצעות אנטגוניסטים המתמקדים סוגים שונים של קולטני אצטילכולין, השווינו את ההשפעות של עירוי של מקאמילאמין אנטגוניסט nAChR לא נבחר ולא תחרותי (3 מיקרוגרם; איור 4A) והסקופולמין האנטגוניסט mAChR (67 מיקרוגרם) הלא-נבחר, אנטגוניסט mAChR (67 מיקרוגרם; איור 4ב'). שתי התרופות יצרו ירידות חזקות בשחרור DA פאזי מגורה(איור 4, 9דקות לאחר ההנפקה). סיכום התוצאות מאיור 2, איור 3 ואיור 4 נטען מחדש באיור 5, שבו תקופת הבסיס היא ממוצעת של חמישה גירויים ותקופת התרופה מוצגת כאחוז מהממוצע הבסיסי.
איור 1: ציר זמן להקלטה לפני ואחרי מיקרו-fusion VTA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: צבע מייצג וחלקות IvT של עירוי בסיסי (משמאל) ומלוח (רכב) (מימין) על שחרור DA פאזי מגורה בליבת NAc בחולדה זכר יחיד ספראג דולי. פס כחול מייצג גירוי. ההקלטה הבסיסית מתרחשת ב t = 0, לפני הצינורית הפנימית הונחה ב צינורית המדריך ממריץ דו קוטבי. הקלטת התמיסת מלח צולמה 9 דקות (t = 9) לאחר ההנפצה. נכנסתי וולטמוגרם מחזוריים תואמים את שיא חלקות ה- IvT, המציגות חמצון שיא ב- 0.6 V והפחתת שיא ב- -0.2 V, מה שמעיד על DA. אין שינוי בשחרור מעורר מגורה יש לראות לאחר עירוי VTA מלוחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ההשפעות של עירוי של אגוניסט NMDAR (NMDA) ואנטגוניסט (AP5). (A)חלקות צבע מייצגות ו- IvT של בסיס בסיסי (משמאל) ו - 500 ננוגרם של עירוי אגוניסט NMDAR (מימין) על שחרור DA פאזי מגורה בליבת NAc בחולדה זכר אחד ספראג דולי. עירוי NMDA מוגבר מגרה שחרור DA פאזי (הקלטה נלקחה 9 דקות לאחר ההדבקה). (B)חלקות צבע מייצגות ו- IvT של בסיס בסיסי (משמאל) ו 1 מיקרוגרם של אנטגוניסט NMDAR (2R)-אמינו-5-פוספונובלרית (AP5) עירוי (מימין) על שחרור DA פאזי מגורה בליבת NAc בחולדה זכר אחד Sprague Dawley. AP5 עירוי מופחת גירוי phasic שחרור DA (הקלטה נלקחה 9 דקות לאחר ההנפצה). ההקלטות הבסיסיות התרחשו ב- t = 0, לפני שהכנסית הפנימית הונחה ב צינורית המדריך במעורר הדו קוטבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ההשפעות של עירוי של מקמילאמין וסקופולמין. (A)צבע מייצג וחלקות IvT של בסיס בסיסי (משמאל) ו 3 מיקרוגרם של קולטן ניקוטיני אצטילכולין לא אלקטיבי אנטגוניסט מקמילאמין (MEC) עירוי (מימין) על שחרור DA פאזי מגורה בליבת NAc בחולדה זכר אחד Sprague Dawley. (B)צבע מייצג וחלקות IvT של בסיס בסיסי (משמאל) ו 67 מיקרוגרם של קולטן אצטילכולין אצטילכולין אנטגוניסט אנטגוניסט (SCOP) עירוי (מימין) על שחרור DA פאזי מגורה בליבת NAc בחולדת Sprague Dawley זכר יחיד. ההקלטה הבסיסית התרחשה ב t = 0, לפני הצינורית הפנימית הונחה ב צינורית המדריך ממריץ דו קוטבי. הקלטות MEC ו SCOP צולמו 9 דקות לאחר ההנפקוזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: סיכום נתונים המציג השפעות סמים לאורך זמן. תקופת טרום עירוי (בסיסי) היה ממוצע על פני חמישה גירויים, ותקופת לאחר ההנפצה (החל מ t = 3) מוצגת כאחוז מקו הבסיס. ב 9 דקות לאחר ההנפצה, ראינו כי אות DA מעורר היה 103% של בסיס לאחר עירוי מלוחים, 196% לאחר עירוי NMDA, 18% לאחר עירוי AP5, 49% לאחר עירוי MEC, ו 43% לאחר עירוי SCOP. n = 1 לכל תנאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CIS-FSCV מספק הזדמנות ייחודית לחקור מנגנוני קולטן VTA שבבסיס שחרור DA פאזי. ישנם שני שלבים קריטיים על מנת להבטיח הקלטה נכונה. ראשית, יש להשיג הקלטה בסיסית יציבה, עם מעט סחיפה באות DA המעורר. דרך חשובה להגדיל את הסבירות להקמת הקלטה יציבה היא להבטיח כי האלקטרודה היה מספיק זמן מחזור הן 60 הרץ ו 10 הרץ (בדרך כלל 15 דקות ב 60 הרץ, ו 10 דקות ב 10 הרץ). כמו סיבי הפחמן הוא להיות רכב על אופניים, סיבי הפחמן עצמו מתחמצן, הופך חרוט, הפחתת שטח הפנים אבל לייצר משטח חדש עבור דופמין ספיחה23. זה יכול להוביל לעלייה ברגישות ל DA. לכן, ניתן לראות עלייה קלה בשחרור דופמין מגורה לאורך זמן בניסוי בשל תחריט מוגבר זה, ולא כל מניפולציה פרמקולוגית. בנוסף, התחלת הקלטה בתוך 90 עד 120 דקות של הרדמה ראשונית תגדיל את הסבירות להקלטה יציבה לאורך פרקי זמן ארוכים. ככזה, כמו החולדה מתקרב מוות מהרדמה, זה אופייני לשחרור DA מעורר לרדת לאט.
השלב הקריטי השני בהליך זה הוא להבטיח כי צינורית עירוי מוכנס בעדינות לתוך אלקטרודה מגרה דו קוטבי. מוטות הזרוע הסטריאוטקסיים יכולים לזוז אם מופעל לחץ רב מדי בעת החדרת הצינורית הפנימית, וכתוצאה מכך, אות הדופמין עשוי להגדיל או להקטין באופן מלאכותי, שכן אתר הגירוי עשוי להיות שונה. אם יש שינוי משמעותי אות מעורר לאחר החדרת צינורית, יש לקבוע תקופה בסיסית חדשה. יתר על כן, אם יש שחרור DA שונה הנגרמת על ידי החדרת צינורית פנימית או עירוי רכב, האות בדרך כלל מתאושש לקו הבסיס בתוך 30 דקות. אם יהיו שינויים נרחבים בשחרור DA לעירוי רכב, קצב עירוי או נפח יכול להיות מופחת. החוקרים עשויים גם לבצע הקלטה נוספת לאחר החדרת הצינורית הפנימית לפני העירוי כדי להעריך אם החדרת הצינורית עצמה יכולה לשנות את השחרור. בהקשר זה, חשוב לוודא כי העירוי התרחש, וכי אין מצור של הצינורית הפנימית. דרך אחת לעשות זאת היא לעשות בועה קטנה צינורות עירוי, ולסמן את זה עם עט או סמן. הבועה צריכה להיות רחוקה יותר מהסמן לאחר עירוי. דרך נוספת להבטיח כי עירוי התרחש כראוי היא להפעיל את משאבת עירוי לאחר הצינורית הפנימית הוסרה מהמוח, ואם יש עדיין פתרון להרכיב בקצה, אז עירוי מוצלח סביר התרחש.
CIS-FSCV יכול להיות מותאם כדי ללמוד קולטני VTA הן בעלי חיים נאיביים מבחינה התנהגותית ומאומנים ללמוד שינויים בתפקוד הקולטן לאורך זמן11. CIS-FSCV ניתן גם לשנות כדי למדוד 5-HT ונוראפינפרין (NE)24,25. CIS-FSCV מתאים מאוד גם לניסויים ערים, התנהגותיים וניתן לשלב אותו עם גישות אופטוגנטיות26,27. חשוב לציין כי אירועי שחרור מעוררים חשמלית נבדלים מאירועי שחרור ארעיים שנצפו לעתים קרובות במחקרים נעים חופשיים, ולעתים רחוקות יותר בהכנה המרדים. אירועי שחרור חולפים, למשל, לא בהכרח מונעים על ידי depolarization ישיר של נוירונים דופמין שלא כמו אירועי שחרור מעוררים חשמלית28. ככזה, פעילות עצבית פאזית עשויה להיות מנותקת מאירועי שחרור הדופמין שזוהו באמצעות FSCV. יתר על כן, שחרור DA מעורר אופטי הוכח שונה מאירועי שחרור DA מעוררים חשמלית. השוואה שנערכה לאחרונה בין גירוי אופטי וחשמלי חשפה כי גירוי מעורר חשמלית מייצר ויסות רב-סינפטי של שחרור DA פאזי, ואילו גירוי מעורר אופטית יכול להגביל את הגירוי למעגלים ספציפיים יותר29.
כמה גישות אחרונות השתמשו בשיטות אופטוגנטיות ופלואורסצנטיות כדי לחקור את המעגלים שבביד דינמיקת הדופמין המהירה ב- vivo30. לדוגמה, עבודה אחרונה של שמש ועמיתיו הראו כי גירוי אופטוגנטי של נוירונים דופמין בסובסטנציה ניגרה מייצר גבהים מהירים של DA בסטריאטום, כפי שנמדד באמצעות ביטוי של G-חלבון בשילוב קולטן מבוסס הפעלה DA (GRABDA)חיישנים 30. גישות אופטוגנטיות ופלואורסצנטיות משולבות יכולות לשמש כדי לעורר או לעכב תשומות afferent ספציפיות ל- VTA תוך מדידת שחרור DA ב- NAc. CIS-FSCV לא יכול לעורר את afferents במיוחד כמו גירוי אופטוגנטי, אבל יש לו יתרון בכך שהוא יכול לענות על שאלות על קולטנים presynaptic ופוסטינפטי בתוך VTA. בעוד הן גישות פלואורסצנטי ו- FSCV יש רזולוציה זמנית מספקת (subsecond) ורגישות DA (1-10 nM) כדי למדוד שינויים באופן דומה שחרור DAphasic30,31, יתרון אחד FSCV עשוי להיות על ניטור פלואורסצנטי של DA פאזי ב vivo הוא כי אין מניפולציות גנטיות נדרשות להקלטה. ואכן, ניסוי CIS-FSCV ניתן להשלים בתוך שעות, בעוד גישות אופטוגנטיות פלואורסצנטיות משולבות דורשות מספיק זמן (שבועות) לביטוי מספיק באמצעות מבנים ויראליים.
יתרון מרכזי של CIS-FSCV הוא כי ויסות קולטן VTA ספציפי של שחרור DAphasic ניתן ללמוד במוח שלם, בהתבסס על מחקרים אחרים vivo כי גם למדוד את המאפיינים האלקטרופיזיולוגיים של נוירונים VTA או אין ויטרו מחקרים המעריכים את הרגולציה presynaptic של שחרור DA פאזי3,12. אזהרה אחת של CIS-FSCV היא שההקלטות האלה חייבות להיעשות באזור עשיר יחסית ב- DA. זה משתי סיבות: ראשית, יש כמה מגבלות לרגישות FSCV, אשר יכול לזהות רק ריכוזי DA בטווח nanomolar ומעל6,19. שנית, FSCV מתקשה לנתק נוראדרנלין מ DA, כי וולטמוגרמות מחזוריות שלהם הם כמעט זהים. לכן, מחקרים אלה עשויים להיות מוגבלים להערכת אזורים עם DA גבוה, כגון חלקים מסוימים של קליפת המוח הקדם מצחית המודילית המודילית, NAc, סטריאטום, ואת שחפת הריח32. מחקרים עתידיים עשויים להיות מסוגלים להעסיק כמה מהגישות FSCV המתקדמות המאפשרות אפליה טובה יותר בין DA ו- NE, כמו גם נוירוטרנסמיטורים אלקטרואקטיביים אחרים כגון אדנוסין33 וסרוטונין12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
העבודה נתמכה על ידי מכללת אליזבתטאון (R.J.W, M.L., ו- L.M.), על ידי מלגת בוגרי NSF (R.J.W. ) ועל ידי בית הספר לרפואה של ייל (N.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | - | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
References
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).
- Lester, D. B., et al. Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamine release. Neuroreport. 19 (9), 991-995 (2008).
- Lodge, D. J., Grace, A. A. The laterodorsal tegmentum is essential for burst firing of ventral tegmental area dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5167-5172 (2006).
- Li, C., et al. Mu Opioid Receptor Modulation of Dopamine Neurons in the Periaqueductal Gray/Dorsal Raphe: A Role in Regulation of Pain. Neuropsychopharmacology. 41 (8), 2122-2132 (2016).
- Zhang, H. Y., et al. Expression of functional cannabinoid CB2 receptor in VTA dopamine neurons in rats. Addiction Biology. 22 (3), 752-765 (2017).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Frontiers in Bioscience. 5, 982-999 (2013).
- Wightman, R. M., et al. Monitoring of transmitter metabolites by voltammetry in cerebrospinal fluid following neural pathway stimulation. Nature. 262 (5564), 145-146 (1976).
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: single spike firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2866-2876 (1984).
- Mameli-Engvall, M., et al. Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors. Neuron. 50 (6), 911-921 (2006).
- Wickham, R., et al. Ventral tegmental area alpha6beta2 nicotinic acetylcholine receptors modulate phasic dopamine release in the nucleus accumbens core. Psychopharmacology. 229 (1), 73-82 (2013).
- Solecki, W., et al. Differential role of ventral tegmental area acetylcholine and N-methyl-D-aspartate receptors in cocaine-seeking. Neuropharmacology. 75, 9-18 (2013).
- John, C. E., Jones, S. R. Fast Scan Cyclic Voltammetry of Dopamine and Serotonin in Mouse Brain Slices. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nature Neuroscience. 7 (6), 583-584 (2004).
- Espana, R. A., et al. Hypocretin 1/orexin A in the ventral tegmental area enhances dopamine responses to cocaine and promotes cocaine self-administration. Psychopharmacology. 214 (2), 415-426 (2011).
- Addy, N. A., et al. The L-type calcium channel blocker, isradipine, attenuates cue-induced cocaine-seeking by enhancing dopaminergic activity in the ventral tegmental area to nucleus accumbens pathway. Neuropsychopharmacology. 43 (12), 2361-2372 (2018).
- Hermans, A., Wightman, R. M. Conical tungsten tips as substrates for the preparation of ultramicroelectrodes. Langmuir. 22 (25), 10348-10353 (2006).
- Borland, L. M., Michael, A. C. An Introduction to Electrochemical Methods in Neuroscience. Electrochemical Methods for Neuroscience. Borland, L. M., Michael, A. C. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Mundroff, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Current Protocols in Neuroscience. 6 (6), 14 (2002).
- Rodeberg, N. T., et al. Hitchhiker's Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for in vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
- Sabeti, J., Gerhardt, G. A., Zahniser, N. R. Chloral hydrate and ethanol, but not urethane, alter the clearance of exogenous dopamine recorded by chronoamperometry in striatum of unrestrained rats. Neuroscience Letters. 343 (1), 9-12 (2003).
- Masuzawa, M., et al. Pentobarbital inhibits ketamine-induced dopamine release in the rat nucleus accumbens: a microdialysis study. Anesthesia & Analgesia. 96 (1), 148-152 (2003).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Keithley, R. B., et al. Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry. Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).
- Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M. Fast-scan cyclic voltammetry of 5-hydroxytryptamine. Analytical Chemistry. 67 (6), 1115-1120 (1995).
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
- Wenzel, J. M., et al. Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain. Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).
- Spanos, M., et al. NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).
- Cheer, J. F., et al. Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats. Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).
- Melchior, J. R., et al. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Robinson, D. L., et al. Monitoring rapid chemical communication in the brain. Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).
- Park, J., et al. Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).
- Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PLoS One. 13 (5), e0196932 (2018).
