Summary
Målet med detta protokoll är att direkt manipulera ventrala tegmentala områdesreceptorer för att studera deras bidrag till subsekund dopamin frisättning.
Abstract
Phasic dopamin (DA) frigörare från ventrala tegmental området (VTA) till kärnan accumbens spelar en avgörande roll i belöning bearbetning och förstärkning lärande. Att förstå hur de olika neuronala ingångarna i VTA-kontrollens fasa DA-utgåva kan ge en bättre bild av kretsarna som styr belöningsbehandling och förstärkningsinlärning. Här beskriver vi en metod som kombinerar intra-VTA cannula infusioner av farmakologiska agonister och antagonister med stimulering-framkallad fasa DA release (kombinerad infusion och stimulering, eller CIS) mätt med in vivo snabb-scan cyklisk voltammetry (FSCV). Med hjälp av CIS-FSCV hos sövda råttor kan ett fasiskt DA-svar framkallas genom att elektriskt stimulera VTA med en bipolär elektrod utrustad med en kanyl medan du registrerar i kärnan accumbens kärna. Farmakologiska agonister eller antagonister kan infunderas direkt på stimuleringsstället för att undersöka specifika VTA-receptorers roller för att driva fasisk DA-frisättning. En stor fördel med CIS-FSCV är att VTA-receptorfunktionen kan studeras in vivo, med utgångspunkt i in vitro-studier.
Introduction
Phasic dopamin (DA) frigörare från ventrala tegmental området (VTA) till kärnan accumbens (NAc) spelar en viktig roll i belöningsrelaterade beteenden. VTA DA-nervceller växlar från en tonic-liknande avfyrning (3-8 Hz) till en burst-liknande bränning (>14 Hz)1, som producerar fasisk DA-utgåva i NAc. VTA uttrycker en mängd somatodendritiska receptorer som är väl positionerade för att kontrollera övergången från tonic till burst-firing2,3,4,5. Att identifiera vilka av dessa receptorer, och deras respektive ingångar, kontrollfasisk DA-frisättning kommer att fördjupa vår förståelse för hur de belöningsrelaterade kretsarna är organiserade. Syftet med den metod som beskrivs här, kombinerad infusion och stimulering med snabbskanning cyklisk voltammetri (CIS-FSCV), är att snabbt och robust bedöma funktionaliteten hos VTA-receptorer vid körning av fasisk DA-frisättning.
Termen kombinerad infusion och stimulering (CIS) avser farmakologiskt manipulerande receptorer på en grupp neuroner (här VTA) och stimulera dessa nervceller att studera receptorns funktion. I den sövda råttan stimulerar vi elektriskt VTA att framkalla en stor fasisk DA-signal (1-2 μM) i NAc-kärnan, mätt med snabbskanning cyklisk voltammetri (FSCV). Infusioner av farmakologiska läkemedel (dvs. receptoragonister/antagonister) vid stimuleringsstället kan användas för att mäta funktionen hos VTA-receptorer genom att observera den efterföljande förändringen i framkallad fasisk DA-frisättning. FSCV är ett elektrokemiskt tillvägagångssätt som har både hög rumslig (50-100 μm) och temporal (10 Hz) upplösning, och är väl lämpad för att mäta belöningsrelaterade, fasa DA-händelser6,7. Denna upplösning är finare än andra in vivo neurokemiska mätningar, såsom mikrodialys. Således, tillsammans, CIS-FSCV är väl lämpad att bedöma VTA receptor reglering av fasa dopamin release.
Ett vanligt sätt att undersöka VTA-receptorfunktionen är genom att använda en kombination av elektrofysiologiska metoder som adresserar hur dessa receptorer ändrar avfyrningshastigheten för nervceller1,8. Dessa studier är mycket värdefulla för att förstå vilka receptorer som är involverade i att driva DA-avfyrning vid aktivering. Dessa studier kan dock bara föreslå vad som kan hända nedströms vid axonterminalen (dvs. frisättning av en neurotransmittor). CIS-FSCV bygger på dessa elektrofysiologiska studier genom att svara på hur effekten av VTA burst-firing, fasisk DA-frisättning, regleras av receptorer som finns på VTA-dendriter och cellkroppar. Cis-FSCV är således väl lämpad att bygga vidare på dessa elektrofysiologiska studier. Som ett exempel kan nikotinisk receptoraktivering inducera burst-firing i VTA9, och CIS-FSCV i den sövda råttan användes för att visa att nikotin acetylkolinreceptor (nAChR) aktivering i VTA också kontrollerar fasisk DA-frisättning i NAc10,11.
Mekanistisk undersökning av phasic DA reglering studeras också ofta med hjälp av skiva preparat tillsammans med bad tillämpning av droger. Dessa studier fokuserar ofta på den presynaptiska regleringen av phasic DA-frisättning från dopaminterminaler, eftersom cellkropparna ofta avlägsnas från skiva12. Dessa preparat är värdefulla för att studera presynaptiska receptoreffekter på dopaminterminaler, medan CIS-FSCV är bättre lämpad att studera somatodendritiska receptoreffekter på dopaminneuroner, liksom presynaptiska ingångar till VTA. Denna skillnad är viktig, eftersom somatodendritisk receptor aktivering i VTA kan ha en annan effekt än NAc presynaptisk receptor aktivering. Faktum är att blockering av dopaminerg presynaptiska nAChRs i NAc kan höja fasasisk dopaminfrisättning under burst-firing13, medan motsatsen gäller vid VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV är ett idealiskt tillvägagångssätt för att studera VTA-receptorernas förmåga att reglera fasisk DA-frisättning. Viktigt är att detta tillvägagångssätt kan utföras i en intakt råtta, antingen sövd eller fri rörelse. Detta tillvägagångssätt är lämpligt för akuta studier, för att studera receptorfunktionen i dess utgångstillstånd10,14 samt långsiktiga studier som kan bedöma funktionella förändringar i en receptor efter läkemedelsexponering eller beteendemanipulation11,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes enligt National Institutes of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och godkändes av både Elizabethtown College och Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Detta protokoll är specifikt för den sövda råtta beredningen av att använda CIS-FSCV.
1. Presurgical preparat
- Beredning av elektrodlösning
- För att göra elektrodfyllningslösningen, förbered en lösning av 4 M kaliumacetat med 140 mM kaliumklorid16.
- Elektrodberedning
- Använd vakuumsugning och för in en T-650 kolfiber (7 μm i diameter) i en borosilikatglaskapillär (längd = 100 mm, diameter = 1,0 mm, innerdiameter = 0,5 mm).
- När kolfibern har placerats inuti glaskapillären, placera glaskapillären i en vertikal elektroddragare, med värmeelementet ungefär i mitten av kapillären. Ställ in värmaren på 55 med magneten avstängd.
- När kapillären har dragits, höj försiktigt den övre kapillärhållaren så att elektrodens spets inte är omgiven av värmeelementet.
- Med hjälp av vass sax, skär kolfibern som fortfarande förbinder de två delarna av kapillären. Detta resulterar i två separata kolfibermikroelektroder.
- Under ett lätt mikroskop skär du försiktigt den exponerade kolfibern med en skarp skalpell, så att kolfibern sträcker sig cirka 75-100 μm bortom glasets ände.
- Se till att elektroden är fri från sprickor längs kapillären med hjälp av ett lätt mikroskop. Se också till att tätningen, där kolfibern lämnar kapillären, är svår att märka och fri från sprickor.
OBS: En bra tätning hjälper till att minska bruset under inspelningar. Se publicerade studier17,18,19 för ett mer detaljerat protokoll.
- Referenselektrodtillverkning
- Löd en guldstift till en 5 cm silvertråd.
- Fäst anoden på ett metall gem eller annan ledare, katoden på en stift och applicera en spänning (~ 2 V) medan gemen och silvertråden är nedsänkt i 0,1 M HCl.
- Upphör med spänningen när en vit beläggning (AgCl) visas på silvertråden.
- Förbereda elektrod för implantation
- Löd en guldstift till en tunn isolerad tråd (~ 10 cm lång, <0,50 mm diameter).
- Ta bort ~5 cm isolering från tråden mittemot guldstiftet.
- Fyll elektroden ungefär halvvägs med elektrodlösning.
- Sätt in isolerad tråd i elektroden.
OBS: Tråden ska komma i kontakt med kolfibern inuti elektroden.
2. Elektrodimplantationer
- Ge vuxna, manliga, Sprague Dawley råttor (250−450 g) en intraperitoneal injektion (1,5 g/kg eller 1 ml/kg volym) på 0,5 g/ml uretan upplöst i steril koksaltlösning. Börja med en första uretandos på 1, 0−1,2 g/kg. Om djuret fortfarande reagerar på det skadliga stimulanstestet (svansnypa) 20 min efter uretanadministration, administrera ytterligare 0, 3−0, 5 g/kg uretan för en total dos på 1,5 g/kg.
OBS: För beredning av 0,5 g/mL uretanlösning, tillsätt 10 g uretan till 10 g (~10 ml) saltlösning. Uretan är cancerframkallande och måste hanteras varsamt. Uretan är ett viktigt bedövningsmedel, eftersom det inte förändrar nivåerna av dopamin, liksom andra anestetika som ketamin / xylazin och klorhydrat20,21. - När djuret är djupt bedövt och inte reagerar på skadliga stimuli (t.ex. tånypa), placera det i den stereotaxiska ramen. Applicera oftalmiskt smörjmedel på varje öga på råttan.
OBS: Detta är en icke-överlevnad kirurgi, men bra aseptisk teknik uppmuntras. - Rengör råttans hårbotten med en tvåstegsskrubb (dvs. en jodivilonskrubb följt av en 70% etanolskrubb; utför med en 3-cykelsrepetition).
- Skär bort hårbotten med steriliserade nålnästwecett och kirurgisk sax. Ta bort en betydande mängd vävnad för att göra plats för de olika implantationerna som beskrivs nedan.
- Rengör försiktigt skallytan med steriliserade bomullsspetsapplikatorer. Applicera sedan 2−3 droppar 3% väteperoxid för att identifiera lambda och bregma.
- Använd en stereotaxisk eller handborr (1,0 mm, ~ 20 000 varv/min), borra ett hål med diametern 1,5 mm 2,5 mm i anslutning till bregma och 3,5 mm i sidled till bregma. Delvis (ungefär halvvägs, tills den är ordentligt på plats) implantera en skruv (1,59 mm O.D., 3,2 mm lång) i detta hål. Det rekommenderas att steril saltlösning används för att bevattna vid borrning för att förhindra värmeskador.
- För referenselektroden, borra ett hål med 1,0 mm diameter 1,5 mm främre och 3,5 mm i sidled till bregma, på vänster halvklot.
- För hand, sätt in ~ 2 mm referenstråd i detta hål, samtidigt som du lindar referenstråden runt och under huvudet på den implanterade skruven.
- Implantera skruven helt och fäst referenselektroden på plats.
- Borra ett hål med 1,5 mm diameter på 1,2 mm i diameter 1,2 mm och 1,4 mm i sidled till bregma.
- Ta försiktigt bort duran med pincett.
- För den stimulerande elektroden, borra ett fyrkantigt hål (2 mm främre bakre, 5 mm mediala-lateral) centrerat vid 5,2 mm bakre och 1,0 mm lateralt till bregma.
- Sänk den bipolära stimulerande elektroden/styrkanylen 5 mm under duran med hjälp av de stereotaktiska armstängerna. Vid blödning under implantationen av elektroden, använd sterila bomullspinne och gasväv för att minimera blödning.
OBS: Den bipolära stimulerande elektroden som används i denna metod är förinstallerad med en guide cannula (Tabell av material). Den inre kanylen som används med denna punkt ska spolas med spetsarna på den bipolära stimulerande elektroden när den är helt insatt i styrkantyn. Detta gör att den inre kanylen kan sitta direkt mellan stimulatorns två spetsar, som sitter ca 1 mm från varandra. Ett liknande protokoll beskrivs någon annanstans14. - Sänk kolfibermikroelektroden 4 mm under duran med hjälp av de stereotaktiska armstängerna. Denna plats är den mest dorsala delen av striatum.
- Anslut referenstråden och kolfibern till en potentiostat.
- Applicera en triangulär vågform (-0,4−1,3 V, 400 V/s) i 15 min vid 60 Hz och igen i 10 min vid 10 Hz.
OBS: Vanligtvis, när vågformer appliceras på kolfibermikroelektroder i hjärnan, tillsätts oxidgrupper till kolfiberns yta. Jämvikten i denna reaktion skall uppnås före registrering. annars kommer betydande drift att inträffa19. Genom att cykla elektroden vid högre frekvenser (60 Hz) kan kolfibern uppnå jämvikt snabbare.
3. Optimera kolfiber och stimulera elektrod / guide cannula platser
- Ställ in stimulatorn på att producera en bipolär elektrisk vågform, med en frekvens på 60 Hz, 24 pulser, 300 μA ström och pulsbredd på 2 ms/fas.
- Sänk försiktigt stimulatorn i steg om 0,2 mm från 5 mm till 7,8 mm under duran. Stimulera VTA i varje steg.
OBS: Vid mer dorsala djup (5−6 mm) kommer stimulering av hjärnan vanligtvis (~ 80% av tiden) att orsaka råttans morrhår att rycka. Vid ytterligare djup kommer whiskersna att sluta rycka, vilket inträffar mellan 7,5−8,2 mm under duran. När morrhåren upphör att rycka kommer den stimulerande elektroden att vara nära eller vid VTA. Detta kommer inte att inträffa i varje råtta, och brist på whisker ryckningar bör inte tas som ett tecken på att den bipolära stimulerande elektroden / infusions canylen är felplacerad. Whisker ryckningar kanske inte förekommer för alla bedövningsmedel (t.ex. isofluran). - Fortsätt att sänka den bipolära stimulerande elektroden/styra kanylen tills en stimulering ger fasisk DA-frisättning vid kolfibermikroelektrod (för närvarande i dorsala striatum).
OBS: DA-frisättning i dorsala striatum kommer inte alltid att uppstå om den bipolära elektroden implanteras i VTA, men observation av DA-frisättning i dorsala striatum vid VTA-stimulering är vanligtvis ett gott tecken på att en bra signal kommer att observeras i NAc-kärnan. - Sänk kolfibermikroelektroden tills den är minst 6,0 mm under duran. Detta är den mest dorsala delen av NAc-kärnan.
- Stimulera VTA och registrera toppamplituden för DA-toppen.
- Sänk eller höj kolfibermikroelektroden på den plats som ger den största DA-utgåvan.
- Se till att toppen av DA-svaret är en tydlig oxidationstopp vid 0,6 V och en reduktionstopp på -0,2 V. Dessa toppar är vägledande för DA.
4. Kombinationsinfusion och stimulering FSCV-inspelning
OBS: Bild 1 visar tidslinjen för inspelning före och efter VTA-mikroinfusion.
- När kolfibern och den stimulerande elektrod-/styr canylplatsen har optimerats, stimulera i ~20−30 min.
OBS: Under de aktuella stimuleringsparametrarna, stimulera inte mer än en gång var 3: e minut, för att möjliggöra vesikulär omladdning22. - Efter att ha uppnått en stabil baslinje (<20% variation över fem stimuleringar), sänk försiktigt den inre kanylen för hand i styrkantylen som är förinstallerad i den bipolära stimulatorn.
- Ta ytterligare 2−3 baslinjeinspelningar för att säkerställa att kanylinsättningen i sig inte orsakade en förändring i den framkallade signalen. I vissa fall kan införandet och avlägsnandet av den inre kanylen orsaka skador på VTA. Om signalen ändras drastiskt under den här baslinjeperioden (>20%), ta ytterligare 3−4 inspelningar tills baslinjen är omstart.
- Använd en sprutpump och mikrosyring, infusera 0,5 μL lösning (t.ex. 0,9% saltlösning, N-metyl-D-aspartat [NMDA], (2R)-amino-5-fosfonovalersyra [AP5]) i VTA under en 2 min period.
- Postinfusion, lämna den inre kanylen i minst 1 min innan du avlägsnas.
OBS: Vissa läkemedel kan kräva att lämna den inre kanylen under en längre tid baserat på läkemedlet kinetik, och avlägsnande av den inre kanylen kan orsaka att läkemedlet reser upp genom den inre kanylen igen. Om det finns oro kan man lämna den inre kanylen i guide cannula under hela inspelningen. Annars kan inspelningen börja efter detta 1 min-intervall. - Fortsätt spela in var tredje minut för att mäta postinfusionseffekter.
OBS: Om infundering av en kontrolllösning, och ingen effekt observeras, är det möjligt att infusera en andra gång10. Om da-frisättningen ändras på grund av att den inre kanylen eller saltinfusionen sätts in, återställs signalen vanligtvis till baslinjen inom 30 minuter.
5. Histologisk verifiering av elektrodplacering
- I slutet av experimentet, skapa en liten lesion på inspelningsplatsen med hjälp av kolfibermikroelektrod.
- Om elektroden måste bevaras för kalibrering efter utgående, använd sedan en volframtråd placerad i en kapillär av glas som sticker ut ~100 μm bortom kapillärspetsen. I det här fallet höj elektroden från hjärnan, byt ut inspelningselektroden med volframelektroden och sänk den till samma dorsoventralkoordinat.
OBS: Kolfibern kan också användas för att skada hjärnan och ger en mer exakt representation av platsen för inspelningsplatsen; Experimenteraren kommer dock att förlora förmågan att kalibrera dessa elektroder.
- Om elektroden måste bevaras för kalibrering efter utgående, använd sedan en volframtråd placerad i en kapillär av glas som sticker ut ~100 μm bortom kapillärspetsen. I det här fallet höj elektroden från hjärnan, byt ut inspelningselektroden med volframelektroden och sänk den till samma dorsoventralkoordinat.
- För att skada inspelningsplatsen, applicera spänning med hjälp av en strömförsörjning. Börja vid 1 V och öka med 1 V var 10:e s tills 10 V uppnås.
- Avliva djuret med en dödlig intraperitoneal injektion av pentobarbital (150 mg/kg).
- Perfusera råttan med en 4% formalinlösning.
- Ta bort huvudet från råttan med en slipad giljotin.
- Använd rongeurer, ta bort bindväven och skallen som omger hjärnan och försiktigt lossa hjärnan från eventuell återstående vävnad.
- Lagra hjärnan i 4% formalin i 1 dag och överför den sedan till 30% sackaros.
OBS: Perfusion med 4% formalin är inte nödvändigt att se lesion webbplats, även om det som bästa praxis kommer att förbättra återuppbyggnaden av lesion webbplats. - Skapa 30 μm skivor av hjärnan med hjälp av en kryostat.
- Montera skivorna på diabilder och täck med en täcklapp.
- Ange platsen för kolfiber mikroelektrod lesion och bipolär stimulator/infusion cannula plats med hjälp av ett ljusmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CIS-FSCV användes för att studera funktionen hos VTA N-metyl-D-aspartatreceptorer (NMDAR), nikotinacetylkolinreceptorer (nAChRs) och muscariniska acetylkolinreceptorer (mAChRs) för att driva fasisk DA-frisättning i NAc-kärnan. Figur 2 visar representativa data för en negativ kontroll, infusion av 0, 9% saltlösning, före (baslinje) och 9 min postinfusion (saltlösning). Figur 2 visar en färgplotter med potential på y-axeln, tid på x-axeln och ström (representerad som falsk färg) på z-axeln, ström kontra tidsspår (IvT), samt ett cykliskt voltammogram taget vid toppen framkallat svar för att visa att analyten som mäts motsvarar DA. Som förväntat ändrade saltlösning infusion inte den stimulerade fasa da release.
För att visa att CIS-FSCV kan ge dubbelriktade effekter vid användning av agonister och antagonister jämförde vi effekterna av infusion av NMDAR-agonisten NMDA (500 ng; Figur 3A) till NMDAR-antagonisten AP5 (1 μg; Figur 3B). Infusion av NMDA gav en kraftig ökning av stimulerad fasisk DA-frisättning(figur 3A, 9 min efter infusion) medan NMDAR-antagonisten, AP5 (1 μg), gav en kraftig minskning (figur 3B,9 min efter infusion). För att demonstrera nyttan av CIS-FSCV med hjälp av antagonister som riktar sig mot olika klasser av acetylkolinreceptorer jämförde vi effekterna av infusion av den icke-selektiva, konkurrensfria nAChR-antagonisten mecamylamin (3 μg; Figur 4A) och det icke-selektiva, konkurrenskraftiga mAChR-antagonistsscopolamin (67 μg; Figur 4B). Båda läkemedlen gav kraftiga minskningar av stimulerad phasic DA release (Figur 4,9 min postinfusion). En sammanfattning av resultaten från figur 2, figur 3och figur 4 omräknas i figur 5, där baslinjeperioden är genomsnittlig över fem stimuleringar och läkemedelsperioden visas som en procentandel av baslinjegenomsnittet.
Bild 1: Tidslinje för inspelning före och efter VTA-mikroinfusion. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativ färg och IVT-diagram av baslinje (vänster) och saltlösning (fordon) infusion (höger) på stimulerad fasisk DA-frisättning i NAc-kärnan i en enda manlig Sprague Dawley råtta. Blå stapel representerar stimulering. Baslinjeinspelningen sker vid t = 0, innan den inre kanylen placerades i styrburken i den bipolära stimulatorn. Saltlösningsinspelningen togs 9 min (t = 9) postinfusion. Cykliska voltammogram insets motsvarar toppen av IVT-tomterna, visar en topp oxidation vid 0,6 V och topp minskning på -0,2 V, vilket indikerar DA. Ingen förändring i stimulerad framkallad frisättning ska observeras efter saltlösning VTA infusion. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Effekter av infusion av NMDAR-agonisten (NMDA) och antagonisten (AP5). ( A) Representativ färg och IVT-diagram av baslinjen (vänster) och 500 ng av NMDAR-agonistinfusionen (höger) på stimulerad fasisk DA-frisättning i NAc-kärnan i en enda manlig Sprague Dawley-råtta. NMDA infusion ökade stimulerad phasic DA release (inspelning tagen 9 min postinfusion). (B) Representativ färg och IVT-diagram för baslinjen (vänster) och 1 μg nmdarantagonisten (2R)-amino-5-fosfonilsyra (AP5) infusion (höger) på stimulerad fasisk DA-frisättning i NAc-kärnan i en enda hane Sprague Dawley råtta. AP5 infusion minskade stimulerad phasic DA release (inspelning tagen 9 min postinfusion). Baslinjeinspelningarna inträffade vid t = 0, innan den inre kanylen placerades i styrburylen i den bipolära stimulatorn. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Effekter av infusion av mecamylamin och skopolamin. ( A) Representativ färg och IVT-diagram för baslinjen (vänster) och 3 μg av den icke-selektiva nikotinacetylcholinreceptorantagonisten mecamylamin (MEC) infusion (höger) på stimulerad fasisk DA-frisättning i NAc-kärnan i en enda manlig Sprague Dawley-råtta. (B)Representativ färg och IVT-diagram för baslinjen (vänster) och 67 μg av den icke-selektiva muscariniska acetylkolinreceptorantagonistalen (höger) på stimulerad fasisk DA-frisättning i NAc-kärnan i en enda manlig Sprague Dawley råtta. Baslinjeinspelningen inträffade vid t = 0, innan den inre kanylen placerades i styrburylen i den bipolära stimulatorn. MEC och SCOP inspelningar togs 9 min postinfusion. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Datasammanfattning som visar läkemedelseffekter över tid. Perioden före infusionen (baslinjen) var i genomsnitt över fem stimuleringar, och postinfusionsperioden (med början vid t = 3) presenteras som en procentandel av baslinjen. Vid 9 min postinfusion observerade vi att den framkallade DA-signalen var 103% av baslinjen efter saltlösning infusion, 196% efter NMDA infusion, 18% efter AP5 infusion, 49% efter MEC infusion och 43% efter SCOP infusion. n = 1 per villkor. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CIS-FSCV ger en unik möjlighet att undersöka VTA-receptormekanismer som ligger till grund för fasisk DA-frisättning. Det finns två kritiska steg för att säkerställa en korrekt inspelning. För det första måste en stabil baslinjeinspelning uppnås, med liten drift i den framkallade DA-signalen. Ett viktigt sätt att öka sannolikheten för att etablera en stabil inspelning är att se till att elektroden har haft gott om tid att cykla vid både 60 Hz och 10 Hz (vanligtvis 15 min vid 60 Hz och 10 min vid 10 Hz). När kolfibern cyklas oxiderar själva kolfibern och etsar sig, vilket minskar ytan men producerar ny yta för dopaminadsorption23. Detta kan leda till en ökning av känsligheten för DA. Således kan man se en liten ökning av stimulerad dopamin frisättning över tid i experimentet på grund av denna ökade etsning, snarare än någon farmakologisk manipulation. Dessutom, att starta en inspelning inom 90 till 120 min av initial anestesi kommer att öka sannolikheten för en stabil registrering under långa tidsperioder. Som sådan, när råttan närmar sig döden från anestesi, är det typiskt för den framkallade DA-utgåvan att minska långsamt.
Det andra kritiska steget i denna procedur är att se till att infusions cannula försiktigt sätts in i den bipolära stimulerande elektroden. De stereotaxiska armstängerna kan röra sig om för mycket tryck placeras medan du sätter in den inre kanylen, och som ett resultat kan dopaminsignalen artificiellt öka eller minska, eftersom stimuleringsstället kan vara annorlunda. Om det sker en betydande förändring i framkallad signal efter kanyl insättning, bör en ny baslinje period fastställas. Om det dessutom sker en förändrad DA-frisättning orsakad av insättning av den inre kanylen eller fordonsinfusionen, återhämtar sig signalen vanligtvis till baslinjen inom 30 minuter. Om det sker omfattande förändringar i DA-frisättningen av infusion av fordon kan infusionshastigheten eller volymen minskas. Utredarna kan också utföra en ytterligare registrering efter att ha satt in den inre kanylen före infusionen för att bedöma om införandet av kanylen själv kan ändra frisättningen. Relaterat är det viktigt att verifiera att infusionen inträffade och att det inte finns någon blockad av den inre kanylen. Ett sätt att göra detta är att göra en liten bubbla i infusionsslangen och markera detta med en penna eller markör. Bubblan ska vara längre bort från markören efter infusionen. Ett annat sätt att säkerställa att infusionen inträffade korrekt är att slå på infusionspumpen efter att den inre kanylen har tagits bort från hjärnan, och om det fortfarande bildas en lösning vid spetsen, har en framgångsrik infusion sannolikt inträffat.
CIS-FSCV kan anpassas för att studera VTA-receptorer hos både beteendemässigt naiva och tränade djur för att studera förändringar i receptorfunktionen över tid11. CIS-FSCV kan också ändras för att mäta 5-HT och noradrenalin (NE)24,25. CIS-FSCV är också mycket lämplig för vakna, beteendeexperiment och kan integreras med optogenetiska metoder26,27. Det är viktigt att notera att elektriskt framkallade release händelser skiljer sig från transienta release händelser som ofta observeras i fria studier, och mindre ofta i den sövda förberedelsen. Transienta frisättningshändelser, till exempel, kan inte nödvändigtvis drivas av direkt depolarisering av dopaminneuroner till skillnad från elektriskt framkallade frisättningshändelser28. Som sådan, fasa neural aktivitet kan vara dissociable från dopamin release händelser upptäckt via FSCV. Dessutom har optiskt framkallad DA-utgåva visat sig skilja sig från elektriskt framkallade DA-releasehändelser. En nyligen jämförd mellan optiskt och elektriskt framkallad stimulering har visat att elektriskt framkallad stimulering ger multisynaptisk reglering av fasisk DA-frisättning, medan optiskt framkallad stimulering kan begränsa stimulering till mer specifika kretsar29.
Några nya metoder har använt optogenetiska och fluorescerande metoder för att undersöka kretsarna bakom snabb dopamindynamik in vivo30. Till exempel visade nyligen arbete av Sun och kollegor att optogenetisk stimulering av dopaminneuroner i substantia nigra producerar snabba höjder av DA i striatum, mätt via uttryck av G-proteinkopplade receptoraktiveringsbaserade DA (GRABDA)sensorer30. Kombinerade optogenetiska metoder och fluorescensmetoder kan användas för att stimulera eller hämma specifika afferentaingångar till VTA vid mätning av DA-frisättning i NAc. CIS-FSCV kan inte stimulera afferenterna så specifikt som optogenetisk stimulering, men det har en fördel genom att det kan ta itu med frågor om presynaptiska och postsynaptiska receptorer inom VTA. Medan både fluorescerande och FSCV-metoder har tillräcklig temporal upplösning (subsekund) och känslighet för DA (1-10 nM) för att jämförelsevis mäta förändringar i fasisk DA-utgåva30,31, är en fördel FSCV kan ha över fluorescerande övervakning av fasisk DA in vivo att inga genetiska manipuleringar krävs för registrering. Ett CIS-FSCV-experiment kan faktiskt slutföras inom några timmar, medan kombinerade optogenetiska metoder och fluorescensmetoder kräver tillräckligt med tid (veckor) för att använda viruskonstruktioner.
En viktig fördel med CIS-FSCV är att specifik VTA-receptorreglering av fasisk DA-frisättning kan studeras i den intakta hjärnan, baserat på andra in vivo-studier som antingen mäter de elektrofysiologiska egenskaperna hos VTA-neuroner eller in vitro-studier som utvärderar den presynaptiska regleringen av phasic DA-frisättning3,12. En varning för CIS-FSCV är att dessa inspelningar måste göras i ett relativt DA-rikt område. Detta är av två skäl: För det första finns det vissa gränser för FSCV-känslighet, som bara kan upptäcka DA-koncentrationer i nanomolarområdet och över6,19. För det andra har FSCV problem med att skilja noradrenalin från DA, eftersom deras cykliska voltammogram är nästan identiska. Således kan dessa studier begränsas till att bedöma områden med hög DA, såsom vissa delar av den mediala prefrontala cortex, NAc, striatum och luktknölen32. Framtida studier kanske kan använda några av de framsteg FSCV metoder som möjliggör bättre diskriminering mellan DA och NE, liksom andra elektroaktiva signalsubstanser såsom adenosin33 och serotonin12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av Elizabethtown College (R.J.W, M.L., och L.M.), av en NSF Graduate Fellowship (R.J.W.) och av Yale School of Medicine (N.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | - | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
References
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).
- Lester, D. B., et al. Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamine release. Neuroreport. 19 (9), 991-995 (2008).
- Lodge, D. J., Grace, A. A. The laterodorsal tegmentum is essential for burst firing of ventral tegmental area dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5167-5172 (2006).
- Li, C., et al. Mu Opioid Receptor Modulation of Dopamine Neurons in the Periaqueductal Gray/Dorsal Raphe: A Role in Regulation of Pain. Neuropsychopharmacology. 41 (8), 2122-2132 (2016).
- Zhang, H. Y., et al. Expression of functional cannabinoid CB2 receptor in VTA dopamine neurons in rats. Addiction Biology. 22 (3), 752-765 (2017).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Frontiers in Bioscience. 5, 982-999 (2013).
- Wightman, R. M., et al. Monitoring of transmitter metabolites by voltammetry in cerebrospinal fluid following neural pathway stimulation. Nature. 262 (5564), 145-146 (1976).
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: single spike firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2866-2876 (1984).
- Mameli-Engvall, M., et al. Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors. Neuron. 50 (6), 911-921 (2006).
- Wickham, R., et al. Ventral tegmental area alpha6beta2 nicotinic acetylcholine receptors modulate phasic dopamine release in the nucleus accumbens core. Psychopharmacology. 229 (1), 73-82 (2013).
- Solecki, W., et al. Differential role of ventral tegmental area acetylcholine and N-methyl-D-aspartate receptors in cocaine-seeking. Neuropharmacology. 75, 9-18 (2013).
- John, C. E., Jones, S. R. Fast Scan Cyclic Voltammetry of Dopamine and Serotonin in Mouse Brain Slices. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nature Neuroscience. 7 (6), 583-584 (2004).
- Espana, R. A., et al. Hypocretin 1/orexin A in the ventral tegmental area enhances dopamine responses to cocaine and promotes cocaine self-administration. Psychopharmacology. 214 (2), 415-426 (2011).
- Addy, N. A., et al. The L-type calcium channel blocker, isradipine, attenuates cue-induced cocaine-seeking by enhancing dopaminergic activity in the ventral tegmental area to nucleus accumbens pathway. Neuropsychopharmacology. 43 (12), 2361-2372 (2018).
- Hermans, A., Wightman, R. M. Conical tungsten tips as substrates for the preparation of ultramicroelectrodes. Langmuir. 22 (25), 10348-10353 (2006).
- Borland, L. M., Michael, A. C. An Introduction to Electrochemical Methods in Neuroscience. Electrochemical Methods for Neuroscience. Borland, L. M., Michael, A. C. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Mundroff, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Current Protocols in Neuroscience. 6 (6), 14 (2002).
- Rodeberg, N. T., et al. Hitchhiker's Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for in vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
- Sabeti, J., Gerhardt, G. A., Zahniser, N. R. Chloral hydrate and ethanol, but not urethane, alter the clearance of exogenous dopamine recorded by chronoamperometry in striatum of unrestrained rats. Neuroscience Letters. 343 (1), 9-12 (2003).
- Masuzawa, M., et al. Pentobarbital inhibits ketamine-induced dopamine release in the rat nucleus accumbens: a microdialysis study. Anesthesia & Analgesia. 96 (1), 148-152 (2003).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Keithley, R. B., et al. Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry. Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).
- Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M.
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
- Wenzel, J. M., et al. Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain. Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).
- Spanos, M., et al. NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).
- Cheer, J. F., et al. Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats. Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).
- Melchior, J. R., et al. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Robinson, D. L., et al. Monitoring rapid chemical communication in the brain. Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).
- Park, J., et al. Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).
- Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PLoS One. 13 (5), e0196932 (2018).
