Summary
Bu protokolün amacı, ventral tegmental alan reseptörlerini, alt bölüm dopamin salınımı için katkılarını incelemek için doğrudan manipüle etmektir.
Abstract
Ventral tegmental alandan (VTA) çekirdek akumbens'e phasic dopamin (DA) salınımı, ödül işleme ve pekiştirme öğreniminde önemli bir rol oynar. VTA kontrol fazsik DA sürümüne gelen çeşitli nöronal girdilerin, ödül işleme ve pekiştirme öğrenimini kontrol eden devrenin daha iyi bir resmini nasıl sağlayabileceğini anlamak. Burada, farmakolojik agonistlerin ve antagonistlerin VTA içi kanül infüzyonlarını, in vivo hızlı tarama siklik voltammetri (FSCV) ile ölçülen stimülasyon çağrılı fazik DA salınımı (kombine infüzyon ve stimülasyon veya BDT) ile birleştiren bir yöntemi açıklıyoruz. Uyuşturulmuş sıçanlarda CIS-FSCV kullanılarak, nükleus akumbens çekirdeğinde kayıt yaparken VTA'yı bir kavunla donatılmış bipolar bir elektrotla elektriksel olarak uyararak fazik bir DA yanıtı çağrılabilir. Farmakolojik agonistler veya antagonistler, belirli VTA reseptörlerinin faik DA salınımını yönlendirmedeki rollerini araştırmak için doğrudan stimülasyon bölgesinde aşılanabilir. CIS-FSCV'nin önemli bir yararı, VTA reseptör fonksiyonunun in vitro çalışmalara dayanarak in vivo olarak çalışılabilmesidir.
Introduction
Ventral tegmental bölgeden (VTA) çekirdeğe (NAc) phasic dopamin (DA) salınımı ödülle ilgili davranışlarda hayati bir rol oynar. VTA DA nöronları tonik benzeri bir ateşlemeden (3-8 Hz) patlama benzeri bir ateşlemeye (>14 Hz)1'e geçer ve bu da NAc'ta vurgulu DA salınımı üretir. VTA, tonikten patlama ateşlemeye geçişi kontrol etmek için iyi konumlandırılmış çeşitli somatodendritik reseptörleri ifade eder2,3,4,5. Bu reseptörlerden hangisinin ve ilgili girdilerinin belirlenmesi, fazik DA salınımını kontrol etmek, ödülle ilgili devrelerin nasıl düzenlendiği konusundaki anlayışımızı derinleştirmeyecektir. Burada açıklanan metodolojinin amacı, hızlı tarama siklik voltammetri (CIS-FSCV) ile kombine infüzyon ve stimülasyon, VTA reseptörlerinin fazik DA salınımını sürüşteki işlevselliğini hızlı ve sağlam bir şekilde değerlendirmektir.
Kombine infüzyon ve stimülasyon (BDT) terimi, bir grup nöron üzerindeki reseptörleri farmakolojik olarak manipüle etmeyi (burada VTA) ve bu nöronları reseptörün işlevini incelemek için uyarmayı ifade eder. Uyuşturulmuş sıçanda, VTA'yı hızlı tarama siklik voltammetrisi (FSCV) ile ölçülen NAc çekirdeğinde büyük bir fazik DA sinyali (1-2 μM) uyandırmak için elektriksel olarak uyarırız. Stimülasyon yerindeki farmakolojik ilaçların (yani reseptör agonistlerinin/antagonistlerinin) infüzyonları, uyandırılan fazik DA salınımındaki sonraki değişimi gözlemleyerek VTA reseptörlerinin işlevini ölçmek için kullanılabilir. FSCV, hem yüksek uzamsal (50-100 μm) hem de zamansal (10 Hz) çözünürlüğe sahip elektrokimyasal bir yaklaşımdır ve ödülle ilgili, vurgulu DA etkinliklerini ölçmek için çok uygundur6,7. Bu çözünürlük, mikrodiyaliz gibi diğer in vivo nörokimyasal ölçümlerden daha incedir. Bu nedenle, CIS-FSCV birlikte, fazik dopamin salınımının VTA reseptör regülasyonunun değerlendirilmesi için çok uygundur.
VTA reseptör fonksiyonunu araştırmanın yaygın bir yolu, bu reseptörlerin nöronların atış hızını nasıl değiştirdiğini ele alan elektrofizyolojik yaklaşımların bir kombinasyonunu kullanmaktır1,8. Bu çalışmalar, aktivasyon üzerine DA ateşlemesinde hangi reseptörlerin yer aldığını anlamada oldukça değerlidir. Bununla birlikte, bu çalışmalar sadece akson terminalde (yani bir nörotransmitterin salınmasında) aşağı akışta neler olabileceğini önerebilir. CIS-FSCV, VTA patlama-ateşleme, fazik DA salınımının VTA dendritleri ve hücre gövdeleri üzerinde bulunan reseptörler tarafından nasıl düzenlendiğini cevaplayarak bu elektrofizyolojik çalışmalar üzerine inşa edilir. Bu nedenle, CIS-FSCV bu elektrofizyoloji çalışmaları üzerine inşa etmek için çok uygundur. Örnek olarak, nikotinik reseptör aktivasyonu VTA9'dapatlama ateşlenmesine neden olabilir ve anestezik sıçandaki CIS-FSCV, VTA'daki nikotinik asetilkolin reseptörü (nAChR) aktivasyonunun NAc10 , 11'dekifalizIK DA salınımını da kontrol ettiğini göstermek için kullanılmıştır.
Phasic DA regülasyonunun mekanistik incelemesi de yaygın olarak ilaçların banyo uygulaması ile birlikte dilim preparatları kullanılarak incelenir. Bu çalışmalar genellikle hücre gövdeleri genellikle dilimden çıkarıldığı için dopamin terminallerinden phasic DA salınımının presynaptik düzenlemesine odaklanır12. Bu preparatlar dopamin terminalleri üzerindeki presinaptik reseptör etkilerini incelemek için değerlidir, cis-FSCV ise dopamin nöronları üzerindeki somatodendritik reseptör etkilerini ve VTA'ya presynaptik girdileri incelemek için daha uygundur. Bu ayrım önemlidir, çünkü VTA'daki somatodendritik reseptör aktivasyonu NAc presynaptik reseptör aktivasyonundan farklı bir etkiye sahip olabilir. Gerçekten de, NAc'de dopaminerjik presynaptik nAChR'leri bloke etmek, patlama ateşlemesi sırasında phasic dopamin salınımını yükseltebilir13, tam tersi ise VTA somatodendritc nAChRs10,11'de geçerlidir.
CIS-FSCV, VTA reseptörlerinin faik DA salınımını düzenleme yeteneğini incelemek için ideal bir yaklaşımdır. Daha da önemlisi, bu yaklaşım anestezi veya serbest hareket ile bozulmamış bir sıçanda gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım akut çalışmalar için uygundur, temel durumunda reseptör fonksiyonunu incelemek için10,14 ve ilaç maruziyeti veya davranışsal manipülasyondan sonra bir reseptördeki fonksiyonel değişiklikleri değerlendirebilen uzun vadeli çalışmalar11,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre yapıldı ve hem Elizabethtown College hem de Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Bu protokol CIS-FSCV kullanımının uyuşturulmuş sıçan hazırlığına özgüdür.
1. Presurgical hazırlıklar
- Elektrot çözeltisi hazırlama
- Elektrot dolum çözeltisini yapmak için, 140 mM potasyum klorür16ile 4 M potasyum asetat çözeltisi hazırlayın.
- Elektrot hazırlama
- Vakum emiş kullanarak, bir borosilikat cam kılcal damara (uzunluk = 100 mm, çap = 1,0 mm, iç çap = 0,5 mm) bir T-650 karbon fiber (7 μm çapında) yerleştirin.
- Karbon fiber cam kılcal damarın içine yerleştirildikten sonra, cam kılcal damarı, ısı elemanı kabaca kılcal damarın ortasına olacak şekilde dikey bir elektrot çekeceği içine yerleştirin. Mıknatıs kapalıyken ısıtıcıyı 55'e ayarlayın.
- Kılcal damar çekildikten sonra, elektrot ucunun ısıtma elemanı ile çevrelenmeyecek şekilde üst kılcal tutucuyu dikkatlice kaldırın.
- Keskin makas kullanarak, kılcal damarın iki parçasını hala bağlayan karbon fiberi kesin. Bu iki ayrı karbon fiber mikroelekrod ile sonuçlanacaktır.
- Hafif bir mikroskop altında, maruz kalan karbon fiberi keskin bir neşterle dikkatlice kesin, böylece karbon fiber camın ucunun yaklaşık 75-100 μm ötesine uzanır.
- Hafif bir mikroskop kullanarak, elektrotunun kılcal damar boyunca çatlaklardan arındırılmasını sağlayın. Ayrıca karbon fiberin kılcal damardan çıktığı contanın fark etmesinin zor ve çatlaklardan arındırılmış olduğundan emin olun.
NOT: İyi bir conta, kayıtlar sırasında gürültüyü azaltmaya yardımcı olacaktır. Daha ayrıntılı bir protokol için yayınlanan çalışmalar17,18,19'a bakın.
- Referans elektrot imalatı
- 5 cm'lik gümüş bir tel için altın bir pim lehim.
- Anotları metal bir ataşa veya başka bir iletkene, katot bir pime takın ve ataş ve gümüş tel 0,1 M HCl'ye batırılırken bir voltaj (~2 V) uygulayın.
- Gümüş tel üzerinde beyaz bir kaplama (AgCl) göründüğünde voltajı durdurun.
- İmplant için elektrot hazırlama
- Altın bir pim ince bir yalıtımlı tel (~10 cm uzunluğunda, <0,50 mm çapında) lehimleme.
- Altın pimin karşısındaki telden ~5 cm yalıtımı çıkarın.
- Elektrot çözeltisi ile elektrot yaklaşık yarıya kadar doldurun.
- Elektrota yalıtımlı tel yerleştirin.
NOT: Tel elektrot içindeki karbon fiber ile temas etmelidir.
2. Elektrot implantasyonları
- Yetişkin, erkek, Sprague Dawley sıçanlarına (250−450 g) steril salinde çözünmüş 0,5 g/mL üretan intraperitoneal enjeksiyon (1,5 g/kg veya 1 mL/kg hacim) verin. 1.0−1.2 g/kg'lık ilk üretan dozu ile başlayın. Hayvan, üretan uygulandıktan 20 dakika sonra zararlı uyaran testine (kuyruk sıkışması) hala yanıt veriyorsa, 1,5 g/kg toplam doz için ek 0,3−0,5 g/kg üretan verin.
NOT: 0,5 g/mL üretan çözeltisinin hazırlanması için 10 g 'a (~10 mL) tuzlu su ekleyin. Üretan bir kanserojendir ve özenle ele alınmalıdır. Üretan, dopamin seviyelerini değiştirmediği için, ketamin / kslazin ve klor hidrat gibi diğer anestezikler gibi önemli bir anesteziktir20,21. - Hayvan derinden uyuşturulduktan ve zararlı uyaranlara (örneğin, parmak sıkışması) yanıt vermedikten sonra, stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Sıçanın her gözüne oftalmik yağlayıcı uygulayın.
NOT: Bu sağkalımsız bir ameliyattır, ancak iyi bir aseptik teknik teşvik edilir. - Farenin kafa derisini iki aşamalı bir ovma kullanarak temizleyin (yani, bir iodopovidone ovma ve ardından% 70 etanol ovma; 3 döngü tekrarı ile gerçekleştirin).
- Sterilize iğne burun cımbızı ve cerrahi makas kullanarak kafa derisi dokusunu kesin. Aşağıda özetlenen çeşitli implantasyonlara yer açmak için önemli miktarda dokuyu çıkarın.
- Sterilize edilmiş pamuk ucu aplikatörleri kullanarak kafatası yüzeyini hafifçe temizleyin. Daha sonra lambda ve bregma'yı tanımlamaya yardımcı olmak için 2−3 damla% 3 hidrojen peroksit uygulayın.
- Stereotaksik veya el matkabı (1,0 mm, ~20,000 rpm) kullanarak, bregma'ya 2,5 mm ön ve bregmaya 3,5 mm yanal 1,5 mm çapında bir delik açın. Kısmen (yaklaşık yarı yolda, sıkıca yerine geçene kadar) bu deliğe bir vida (1,59 mm O.D., 3,2 mm uzunluğunda) yerleştirin. Termal yaralanmayı önlemek için sondaj yaparken sulamak için steril salin kullanılması önerilir.
- Referans elektrot için, sol yarımkürede bregma için 1,5 mm ön ve 3,5 mm yanal 1,0 mm çapında bir delik açın.
- Elle, referans teli implante vidanın etrafına ve altına sararken bu deliğe ~2 mm referans teli yerleştirin.
- Referans elektrodu yerine sabitleyerek vidayı tamamen yerleştirin.
- Sağ yarımkürede, bregma için 1,5 mm çapında 1,2 mm ön ve 1,4 mm yanal delik açın.
- Cımbız kullanarak durayı yavaşça çıkarın.
- Uyarıcı elektrot için, bregma'ya 5,2 mm arka ve 1,0 mm yanal merkezli kare bir delik (2 mm ön-arka, 5 mm medial-yanal) delin.
- Stereotaktik kol çubuklarını kullanarak, bipolar uyarıcı elektrot/ kılavuz kanülini duranın 5 mm altına diraklayın. Elektrodun implantasyonu sırasında kanama olması durumunda, kanamayı en aza indirmek için steril pamuklu çubuklar ve gazlı bez kullanın.
NOT: Bu yöntemde kullanılan bipolar uyarıcı elektrot, kılavuz bir kolayla(Malzeme Masası)önceden donatılmıştır. Bu madde ile kullanılan iç doğrul, kılavuz damara tam olarak yerleştirildiğinde bipolar uyarıcı elektrot üzerindeki uçlarla yıkanmalıdır. Bu, iç canüllerin yaklaşık 1 mm aralıklarla oturan uyarıcının iki çatalı arasında doğrudan oturmasını sağlayacaktır. Benzer bir protokol başka bir yerde açıklanmıştır14. - Stereotaktik kol çubuklarını kullanarak karbon fiber mikroelektodu dura'nın 4 mm altına 2007'den 2007'den aşağı 2007'den bulabilirsiniz. Bu konum striatumun en dorsal kısmındadır.
- Referans telini ve karbon fiberi bir potentiostat'a bağlayın.
- 60 Hz'de 15 dakika ve yine 10 Hz'de 10 dakika boyunca üçgen dalga formu (-0,4−1,3 V, 400 V/s) uygulayın.
NOT: Tipik olarak, beyindeki karbon fiber mikroelekrodlara dalga formları uygulanırken, karbon fiberin yüzeyine oksit grupları eklenir. Bu reaksiyonun dengesine kayıt öncesinde ulaşılmalıdır; aksi takdirde önemli sürüklenme19meydana gelecektir. Elektrotu daha yüksek frekanslarda (60 Hz) bisiklete bindirmek, karbon fiberin dengeyi daha hızlı elde etmesini sağlar.
3. Karbon fiberin optimize edilmesi ve elektrot/kılavuz kolay konumlarının uyarılması
- Uyarıcıyı, 60 Hz frekans, 24 darbe, 300 μA akım ve 2 ms/ faz darbe genişliğine sahip iki kutuplu bir elektrik dalga formu üretecek şekilde ayarlayın.
- Uyarıcıyı 0,2 mm'lik artışlarla 5 mm'den 7,8 mm'ye düşürelim. Her artışta VTA'yı uyarın.
NOT: Daha fazla sırt derinliğinde (5−6 mm), beynin uyarılması tipik olarak (~%80) sıçanın bıyıklarının seğirmesine neden olur. Daha derinlerde, bıyıklar seğirmeyi durdurur ve bu da dura'nın 7,5−8,2 mm altında gerçekleşir. Bıyıklar seğirmeyi bıraktığında, uyarıcı elektrot VTA'nın yakınında veya yakınında olacaktır. Bu her sıçanda oluşmaz ve bıyık seğirmesi eksikliği, bipolar uyarıcı elektrot / infüzyon kanülinin yanlış yerleştirildiğinin bir işareti olarak alınmamalıdır. Bıyık seğirmesi tüm anestezikler için (örneğin, izofluran) gerçekleşmeyebilir. - Bir stimülasyon karbon fiber mikroelekrodda (şu anda dorsal striatumda) fazik DA salınımı üretene kadar bipolar uyarıcı elektrot / kılavuz kanül düşürmeye devam edin.
NOT: Bipolar elektrot VTA'ya yerleştirilirse, dorsal striatumdaki DA salınımı her zaman oluşmaz, ancak VTA stimülasyonu üzerine dorsal striatumda DA salınımının gözlemlenmesi genellikle NAc çekirdeğinde iyi bir sinyal gözlemlanacağının iyi bir işaretidir. - Karbon fiber mikroelekrod'u dura'nın en az 6,0 mm altına indirin. Bu, NAc çekirdeğinin en dorsal kısmıdır.
- VTA'yı uyarın ve DA zirvesinin tepe genliğini kaydedin.
- En büyük DA sürümünü üreten sahada karbon fiber mikroelekrod'u diriltin veya yükseltin.
- DA yanıtının zirvesinin 0,6 V'ta net bir oksidasyon zirvesi ve -0,2 V'ta bir azaltma zirvesi olduğundan emin olun. Bu zirveler savcının göstergesidir.
4. Kombinasyon infüzyon ve stimülasyon FSCV kaydı
NOT: Şekil 1, VTA mikroenfüzyondan önce ve sonra kayıt için zaman çizelgesini gösterir.
- Karbon fiber ve uyarıcı elektrot/kılavuz kanül konumu optimize edildikten sonra ~ 20−30 dakika boyunca uyarın.
NOT: Mevcut stimülasyon parametreleri altında, veziküler yeniden yüklemeye izin vermek için her 3 dakikada bir birden fazla uyarmayın22. - Kararlı bir taban çizgisi elde ettikten sonra (beş stimülasyon üzerinde % <20 varyasyon), iç kanülleri iki kutuplu stimülatöre önceden uygun kılavuz kanüle elle hafifçe küçümser.
- Cannula eklemenin çağrıştırılan sinyalde bir değişikliğe neden olmadığından emin olmak için ek 2−3 temel kayıt alın. Bazı durumlarda, iç kanüllerin yerleştirilmesi ve çıkarılması VTA'ya zarar verebilir. Sinyal bu taban çizgisi süresi boyunca büyük ölçüde değişirse (%>20), taban çizgisi yeniden dengelenine kadar ek bir 3−4 kayıt alın.
- Şırınga pompası ve mikrosire kullanarak VTA'ya 2 dakika boyunca 0,5 μL çözelti (örneğin, %0,9 salin, N-metil-D-aspartat [NMDA], (2R)-amino-5-fosfonovaleric asit [AP5]) aşıleyin.
- Postinfüzyon, çıkarmadan önce iç kanülü en az 1 dakika bekletin.
NOT: Bazı ilaçlar ilaç kinetiğine dayanarak iç kanülden daha uzun süre ayrılmayı gerektirebilir ve iç kanüllerin çıkarılması ilacın iç kanülden tekrar geçmesine neden olabilir. Endişe varsa, kaydın tamamı sırasında iç canül kılavuzda bırakılabilir. Aksi takdirde, kayıt bu 1 dakikalık aralıktan sonra başlayabilir. - Postenfüzyon etkilerini ölçmek için her 3 dakikada bir kaydetmeye devam edin.
NOT: Bir kontrol çözeltisi aşılıyorsanız ve herhangi bir etki gözlenmezse, ikinci kez demlenmesi mümkündür10. İç kanül veya tuzlu su infüzyonun yerleştirilmesinin neden olduğu değiştirilmiş DA salınımı varsa, sinyal genellikle 30 dakika içinde taban çizgisine geri yüklenir.
5. Elektrot yerleşiminin histolojik doğrulaması
- Deneyin sonunda, karbon fiber mikroelekrod kullanarak kayıt alanında küçük bir lezyon oluşturun.
- Elektrot deneyim sonrası kalibrasyon için korunmalıdır, daha sonra kılcal ucun ötesinde ~ 100 μm çıkıntılı bir cam kılcal damar içine yerleştirilmiş bir tungsten teli kullanın. Bu durumda, elektrot beyinden yükseltin, kayıt elektrodünü tungsten elektrot ile değiştirin ve aynı dorsoventral koordinata 2007 yılından bunlarda değiştirin.
NOT: Karbon fiber, beyni lezyonlamak için de kullanılabilir ve kayıt alanının konumunun daha doğru bir şekilde temsilini sağlayacaktır; ancak, deneyci bu elektrotları kalibre etme yeteneğini kaybedecektir.
- Elektrot deneyim sonrası kalibrasyon için korunmalıdır, daha sonra kılcal ucun ötesinde ~ 100 μm çıkıntılı bir cam kılcal damar içine yerleştirilmiş bir tungsten teli kullanın. Bu durumda, elektrot beyinden yükseltin, kayıt elektrodünü tungsten elektrot ile değiştirin ve aynı dorsoventral koordinata 2007 yılından bunlarda değiştirin.
- Kayıt alanını lezyonlamak için bir güç kaynağı kullanarak voltaj uygulayın. 1 V'dan başlayın ve 10 V'a ulaşılana kadar her 10 sn'de 1 V artırın.
- Ölümcül bir intraperitoneal pentobarbital enjeksiyonu (150 mg / kg) kullanarak hayvanı ötenazi edin.
- % 4 formalin çözeltisi kullanarak sıçanı perfuse edin.
- Keskinleştirilmiş bir giyotin kullanarak başı sıçandan çıkarın.
- Rongeurs kullanarak, beyni çevreleyen bağ dokusunu ve kafatasını çıkarın ve beyni kalan herhangi bir dokudan hafifçe çıkarın.
- Beyni 1 gün boyunca% 4 formalin içinde saklayın ve ardından% 30 sakkaroza aktarın.
NOT: % 4 formalin ile perfüzyon lezyon bölgesini görmek için gerekli değildir, ancak en iyi uygulama olarak lezyon bölgesinin yeniden inşasını iyileştirecektir. - Kriyostat kullanarak beynin 30 μm dilimini oluşturun.
- Dilimleri slaytlara monte edin ve bir kapak kayması ile örtün.
- Hafif bir mikroskop kullanarak karbon fiber mikroelektod lezyonunun ve bipolar stimülatör/infüzyon kanülasyon konumunun yerini gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CIS-FSCV, VTA N-metil-D-aspartat reseptörlerinin (NMDAR), nikotinik asetilkolin reseptörlerinin (nAChRs) ve NAc çekirdeğinde fazik DA salınımının yönlendirilmesinde miskarinik asetilkolin reseptörlerinin (mAChRs) işlevini incelemek için kullanılmıştır. Şekil 2 negatif kontrol için temsili verileri gösterir, %0,9 salin infüzyonu, öncesi (taban çizgisi) ve 9 dk postenfüzyon (salin). Şekil 2, y ekseninde potansiyel, x ekseninde zaman ve z ekseninde akım (yanlış renk olarak temsil edilir), akım ve zaman izleri (IVT) üzerinde potansiyele sahip bir renk grafiğinin yanı sıra, ölçülen analitin DA'ya karşılık geldiğini göstermek için tepeye çağrıştırılan yanıtta alınan döngüsel bir voltamogram gösterir. Beklendiği gibi, tuzlu infüzyon uyarılmış fazik DA salınımını değiştirmedi.
CIS-FSCV'nin agonistleri ve antagonistleri kullanırken çift yönlü etkiler yaratabileceğini göstermek için, NMDAR agonisti NMDA'nın (500 ng; Şekil 3A) NMDAR antagonistine, AP5'e (1 μg; Şekil 3B). NMDA infüzyonu uyarılmış phasic DA salınımında(Şekil 3A, infüzyondan 9 dakika sonra) sağlam bir artış üretirken, NMDAR rekabetçi antagonisti AP5 (1 μg), sağlam bir düşüş üretti(Şekil 3B, infüzyondan 9 dk sonra). Farklı asetilkolin reseptör sınıflarını hedefleyen antagonistleri kullanarak CIS-FSCV'nin yararını göstermek için, seçimsiz, rekabetsiz nAChR antagonist mecamylamin (3 μg; Şekil 4A) ve seçimsiz, rekabetçi mAChR antagonist skopolamin (67 μg); Şekil 4B). Her iki ilaç da uyarılmış fazik DA salınımında sağlam düşüşler üretti(Şekil 4, 9 dk postenfüzyon). Şekil 2 , Şekil 3ve Şekil 4'ten elde edilen sonuçların bir özeti Şekil 5'te yeniden doldurularak, temel dönem beş stimülasyon üzerinden ortalamaya sahip olur ve ilaç dönemi temel ortalamanın yüzdesi olarak görüntülenir.
Şekil 1: VTA mikroenfüzyondan önce ve sonra kayıt için zaman çizelgesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tek bir erkek Sprague Dawley sıçanında NAc çekirdeğinde uyarılmış fazik DA salınımı üzerinde taban çizgisi (sol) ve salin (araç) infüzyonunun (sağda) temsili rengi ve IvT çizimleri. Mavi çubuk stimülasyonu temsil eder. Taban çizgisi kaydı, iç canül bipolar stimülatördeki kılavuz canüle yerlendirilmadan önce t = 0'da gerçekleşir. Tuzlu su kaydı 9 dk (t = 9) postenfüzyon alındı. Döngüsel voltamogram insets, IVT arazilerinin zirvesine karşılık gelir ve 0.6 V'ta bir tepe oksidasyonu ve -0.2 V'ta tepe azaltma gösterir, da göstergesidir. Salin VTA infüzyondan sonra uyarılmış uyarılmış salınımda bir değişiklik gözlenmemelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: NMDAR agonisti (NMDA) ve antagonistinin (AP5) infüzyonunun etkileri. (A) Tek bir erkek Sprague Dawley sıçanında NAc çekirdeğinde uyarılmış fazik DA salınımı üzerinde temel (solda) ve 500 ng NMDAR agonist infüzyonunun (sağda) temsili rengi ve IvT çizimleri. NMDA infüzyonu uyarılmış fazik DA salınımı artırdı (kayıt 9 dakika postinfüzyon aldı). (B) Tek bir erkek Sprague Dawley sıçanında NAc çekirdeğinde uyarılmış phasic DA salınımı üzerinde NMDAR antagonistinin (2R)-amino-5-fosfonovaleric asit (AP5) infüzyonunun (sağda) taban çizgisinin (solda) ve 1 μg'nin temsili rengi ve IvT çizimleri. AP5 infüzyonu uyarılmış fazik DA salınımı azalttı (kayıt 9 dakika postinfüzyon alındı). Taban çizgisi kayıtları, iç canül bipolar stimülatördeki kılavuz canüle yerlendirilmadan önce t = 0'da gerçekleşti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mecamylamin ve skopolamin infüzyonunun etkileri. (A) Tek bir erkek Sprague Dawley sıçanında NAc çekirdeğinde uyarılmış phasic DA salınımı üzerinde baz çizginin (solda) temsili rengi ve IvT çizimleri ve seçimsiz nikotinik asetilkolin reseptör antagonist mecamylamin (MEC) infüzyonu (sağda). (B) Tek bir erkek Sprague Dawley sıçanında NAc çekirdeğinde uyarılmış fazik DA salınımı üzerinde taban çizgisinin (solda) temsili rengi ve IvT çizimleri ve seçimsiz miskarinik asetilkolin reseptör antagonist skopolamin (SCOP) infüzyonu (sağda) 67 μg. Taban çizgisi kaydı, iç canül bipolar stimülatördeki kılavuz canüle yerlendirilmadan önce t = 0'da gerçekleşti. MEC ve SCOP kayıtları 9 dk postenfüzyon alındı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Zaman içinde ilaç etkilerini gösteren veri özeti. Ön infüzyon dönemi (taban çizgisi) beş stimülasyon üzerinden ortalamaya alındı ve postinfüzyon süresi (t = 3'ten başlayarak) taban çizgisinin yüzdesi olarak sunulmaktadır. 9 dk postenfüzyonda, uyandırılan DA sinyalinin salin infüzyondan sonra taban çizgisinin% 103'ü, NMDA infüzyondan sonra% 196, AP5 infüzyondan sonra% 18, MEC infüzyondan sonra% 49 ve SCOP infüzyondan sonra% 43 olduğunu gözlemledik. n = Koşul başına 1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CIS-FSCV, phasic DA salınımı altında kalan VTA reseptör mekanizmalarını araştırmak için benzersiz bir fırsat sağlar. Doğru bir kayıt sağlamak için iki kritik adım vardır. İlk olarak, uyarılan DA sinyalinde çok az sürüklenme ile kararlı bir taban çizgisi kaydı elde edilmelidir. Kararlı bir kayıt oluşturma olasılığını artırmanın önemli bir yolu, elektrodun hem 60 Hz hem de 10 Hz'de (tipik olarak 60 Hz'de 15 dakika ve 10 Hz'de 10 dakika) döngü yapmak için bolca zamanı olduğundan emin olmaktır. Karbon fiber döngüye alınırken, karbon fiberin kendisi oksitlenir ve kazınır, yüzey alanını azaltır, ancak dopamin adsorpsiyon için yeni yüzey üretir23. Bu, savcıya duyarlılığın artmasına neden olabilir. Bu nedenle, herhangi bir farmakolojik manipülasyon yerine, bu artan gravür nedeniyle deneyde zaman içinde uyarılmış dopamin salınımında hafif bir artış görebiliriz. Ek olarak, bir kaydın ilk anesteziden 90 ila 120 dakika içinde başlaması, uzun süreler boyunca istikrarlı bir kayıt olasılığını artıracaktır. Bu nedenle, sıçan anesteziden ölüme yaklaştığından, uyarılan DA salınımın yavaşça azalması tipiktir.
Bu prosedürdeki ikinci kritik adım, infüzyon kanüllerinin bipolar uyarıcı elektrota nazikçe yerleştirilmesini sağlamaktır. İç kanamayı yerleştirirken çok fazla basınç yerleştirilirse stereotaksik kol çubukları hareket edebilir ve sonuç olarak, stimülasyon bölgesi farklı olabileceğinden dopamin sinyali yapay olarak artabilir veya azalabilir. Kanül takılması sonrası uyarılan sinyalde önemli bir değişiklik varsa, yeni bir taban çizgisi dönemi oluşturulmalıdır. Ayrıca, iç kanül veya araç infüzyonunu yerleştirmenin neden olduğu değiştirilmiş DA salınımı varsa, sinyal genellikle 30 dakika içinde taban çizgisine geri yüklenir. Araç infüzyonunda DA sürümünde kapsamlı değişiklikler olması durumunda, infüzyon oranı veya hacmi azaltılabilir. Araştırmacılar ayrıca, kanülün eklenmesinin salınımı değiştirip değiştirmeyeceğini değerlendirmek için infüzyondan önce dahili kanül taktıktan sonra ek bir kayıt gerçekleştirebilirler. İlgili olarak, infüzyonun meydana geldiğini ve iç kanül ablukası olmadığını doğrulamak önemlidir. Bunu yapmanın bir yolu, infüzyon tüpünde küçük bir kabarcık yapmak ve bunu bir kalem veya işaretleyici ile işaretlemektir. Kabarcık infüzyondan sonra işaretleyiciden daha uzakta olmalıdır. infüzyonun düzgün bir şekilde gerçekleşmesini sağlamanın bir başka yolu, iç kanül beyinden çıkarıldıktan sonra infüzyon pompasını açmaktır ve uçta hala bir çözelti oluşuyorsa, başarılı bir infüzyon meydana gelmiştir.
CIS-FSCV, zaman içinde reseptör fonksiyonundaki değişiklikleri incelemek için hem davranışsal olarak naif hem de eğitimli hayvanlarda VTA reseptörlerini incelemek için uyarlanabilir11. CIS-FSCV ayrıca 5-HT ve norepinefrin (NE)24,25'i ölçmek için de değiştirilebilir. CIS-FSCV ayrıca uyanık, davranış deneyleri için son derece uygundur ve optogenetik yaklaşımlarla entegre edilebilir26,27. Elektriksel olarak çağrıştırılan salınım olaylarının, serbest hareket eden çalışmalarda sıklıkla gözlenen geçici salınım olaylarından ve daha az sıklıkla uyuşturulmuş preparattan farklı olduğunu belirtmek önemlidir. Geçici salınım olayları, örneğin, elektriksel olarak çağrıştırılan serbest bırakma olaylarının aksine dopamin nöronlarının doğrudan depolarizasyonu ile yönlendirilmeyebilir28. Bu nedenle, phasic sinirsel aktivite FSCV ile tespit edilen dopamin salınım olaylarından ayrışabilir. Ayrıca, optik olarak çağrıştırılan DA sürümünün elektriksel olarak çağrıştırılan DA sürüm olaylarından farklı olduğu gösterilmiştir. Optik ve elektriksel olarak çağrıştırılan stimülasyon arasındaki yeni bir karşılaştırma, elektriksel olarak çağrıştırılan stimülasyonun phasic DA salınımının multisinaptik regülasyonunu ürettiğini, optik olarak uyarılan stimülasyonun ise stimülasyonu daha spesifik devrelerle sınırlandırabileceğini ortaya koydu29.
Bazı son yaklaşımlar, vivo 30'da hızlı dopamin dinamiklerinin altında kalan devreleri araştırmak için optogenetik ve floresan yöntemlerdiri. Örneğin, Sun ve meslektaşları tarafından yapılan son çalışmalar, substantia nigradaki dopamin nöronlarının optogenetik stimülasyonunun, G-protein bağlantılı reseptör aktivasyon tabanlı DA (GRABDA)sensörlerinin ifadesiyle ölçüldüğü gibi, striatumda hızlı DA yükselmeleri ürettiğini göstermiştir30. Kombine optogenetik ve floresan yaklaşımları, NAc'deki DA salınımını ölçerken VTA'ya belirli afferent girişleri uyarmak veya inhibe etmek için kullanılabilir. CIS-FSCV, özellikle optogenetik stimülasyon kadar afferentleri uyaramaz, ancak VTA içindeki presynaptik ve postynaptik reseptörler hakkındaki soruları ele alabilmesi açısından bir avantaja sahiptir. Hem floresan hem de FSCV yaklaşımları, phasic DA sürümü30, 31'deki değişiklikleri nispeten ölçmek için yeterli zamansal çözünürlüğe (altsaniye) ve DA'ya(1-10nM) hassasiyete sahip olsada,FSCV'nin phasic DA in vivo floresan izlenmesine göre sahip olabileceği bir avantaj, kayıt için genetik manipülasyon gerekmemiş olmasıdır. Gerçekten de, bir CIS-FSCV deneyi saatler içinde tamamlanabilirken, kombine optogenetik ve floresan yaklaşımları viral yapılar kullanılarak yeterli ifade için yeterli zaman (hafta) gerektirir.
CIS-FSCV'nin önemli bir yararı, phasic DA salınımının spesifik VTA reseptör regülasyonunun bozulmamış beyinde çalışılabilmesi, VTA nöronlarının elektrofizyolojik özelliklerini ölçen diğer in vivo çalışmalar veya phasic DA salınımının presynaptik regülasyonunun değerlendirildiği in vitro çalışmalar üzerine inşa edilebilmesidir3,12. CIS-FSCV'nin bir uyarısı, bu kayıtların nispeten DA bakımından zengin bir alanda yapılması gerektiğidir. Bunun iki nedeni vardır: birincisi, FSCV duyarlılığının bazı sınırları vardır, bu da sadece nanomolar aralıktaki ve6,19'unüzerindeki DA konsantrasyonlarını tespit edebilir. İkincisi, FSCV norepinefrini DA'dan ayırmada sorun yaşıyor, çünkü döngüsel voltamogramları neredeyse aynı. Bu nedenle, bu çalışmalar medial prefrontal korteks, NAc, striatum ve koku alma tüberkül 32 gibi yüksekDA'lıalanları değerlendirmekle sınırlı olabilir. Gelecekteki çalışmalar, DA ve NE arasında daha iyi ayrımcılığa izin veren bazı ilerleme FSCV yaklaşımlarının yanı sıra adenozin33 ve serotonin12gibi diğer elektroaktif nörotransmitterleri de kullanabilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Çalışmalar Elizabethtown College (R.J.W, M.L. ve L.M.), NSF Graduate Fellowship (R.J.W.) ve Yale School of Medicine (N.A.) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | - | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
References
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).
- Lester, D. B., et al. Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamine release. Neuroreport. 19 (9), 991-995 (2008).
- Lodge, D. J., Grace, A. A. The laterodorsal tegmentum is essential for burst firing of ventral tegmental area dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5167-5172 (2006).
- Li, C., et al. Mu Opioid Receptor Modulation of Dopamine Neurons in the Periaqueductal Gray/Dorsal Raphe: A Role in Regulation of Pain. Neuropsychopharmacology. 41 (8), 2122-2132 (2016).
- Zhang, H. Y., et al. Expression of functional cannabinoid CB2 receptor in VTA dopamine neurons in rats. Addiction Biology. 22 (3), 752-765 (2017).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Frontiers in Bioscience. 5, 982-999 (2013).
- Wightman, R. M., et al. Monitoring of transmitter metabolites by voltammetry in cerebrospinal fluid following neural pathway stimulation. Nature. 262 (5564), 145-146 (1976).
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: single spike firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2866-2876 (1984).
- Mameli-Engvall, M., et al. Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors. Neuron. 50 (6), 911-921 (2006).
- Wickham, R., et al. Ventral tegmental area alpha6beta2 nicotinic acetylcholine receptors modulate phasic dopamine release in the nucleus accumbens core. Psychopharmacology. 229 (1), 73-82 (2013).
- Solecki, W., et al. Differential role of ventral tegmental area acetylcholine and N-methyl-D-aspartate receptors in cocaine-seeking. Neuropharmacology. 75, 9-18 (2013).
- John, C. E., Jones, S. R. Fast Scan Cyclic Voltammetry of Dopamine and Serotonin in Mouse Brain Slices. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nature Neuroscience. 7 (6), 583-584 (2004).
- Espana, R. A., et al. Hypocretin 1/orexin A in the ventral tegmental area enhances dopamine responses to cocaine and promotes cocaine self-administration. Psychopharmacology. 214 (2), 415-426 (2011).
- Addy, N. A., et al. The L-type calcium channel blocker, isradipine, attenuates cue-induced cocaine-seeking by enhancing dopaminergic activity in the ventral tegmental area to nucleus accumbens pathway. Neuropsychopharmacology. 43 (12), 2361-2372 (2018).
- Hermans, A., Wightman, R. M. Conical tungsten tips as substrates for the preparation of ultramicroelectrodes. Langmuir. 22 (25), 10348-10353 (2006).
- Borland, L. M., Michael, A. C. An Introduction to Electrochemical Methods in Neuroscience. Electrochemical Methods for Neuroscience. Borland, L. M., Michael, A. C. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Mundroff, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Current Protocols in Neuroscience. 6 (6), 14 (2002).
- Rodeberg, N. T., et al. Hitchhiker's Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for in vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
- Sabeti, J., Gerhardt, G. A., Zahniser, N. R. Chloral hydrate and ethanol, but not urethane, alter the clearance of exogenous dopamine recorded by chronoamperometry in striatum of unrestrained rats. Neuroscience Letters. 343 (1), 9-12 (2003).
- Masuzawa, M., et al. Pentobarbital inhibits ketamine-induced dopamine release in the rat nucleus accumbens: a microdialysis study. Anesthesia & Analgesia. 96 (1), 148-152 (2003).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Keithley, R. B., et al. Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry. Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).
- Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M.
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
- Wenzel, J. M., et al. Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain. Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).
- Spanos, M., et al. NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).
- Cheer, J. F., et al. Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats. Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).
- Melchior, J. R., et al. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Robinson, D. L., et al. Monitoring rapid chemical communication in the brain. Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).
- Park, J., et al. Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).
- Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PLoS One. 13 (5), e0196932 (2018).
