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Bioengineering

लाइसोलिपिड युक्त तापमान-संवेदनशील लिपोसोम्स का माइक्रोफ्लूइडिक उत्पादन

Published: March 3, 2020 doi: 10.3791/60907
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Pharmacy, Queen's University Belfast

Summary

प्रोटोकॉल कंपित हेरिंगबोन माइक्रोमिडर माइक्रोफ्लूइडिक्स डिवाइस का उपयोग करके थर्मोसेंसिटिव लिपोसोम तैयार करने के लिए अनुकूलित मापदंडों को प्रस्तुत करता है। यह लिपोसोम्स में डोक्सोरुबिसिन और इंडोसाइनाइन ग्रीन के सह-एन्कैप्सुलेशन और नियंत्रित/ट्रिगर दवा रिलीज के लिए डोक्सोरुबिसिन की फोटोथर्मल-ट्रिगर रिलीज की अनुमति देता है ।

Abstract

प्रस्तुत प्रोटोकॉल कम तापमान-संवेदनशील लिपोसोम (एलटीएसएल) की उच्च-थ्रूपुट निरंतर तैयारी को सक्षम बनाता है, जो डोक्सोरुबिसिन (डॉक्स) जैसी कीमोथेरेपी दवाओं को लोड करने में सक्षम हैं। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, एक इथेनॉल लिपिड मिश्रण और अमोनियम सल्फेट समाधान को एक कंपित हेरिंगबोन माइक्रोमिक्सर (एसएचएम) माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस में इंजेक्ट किया जाता है। समाधान तेजी से एसएचएम द्वारा मिश्रित कर रहे हैं, liposomes स्वयं विधानसभा के लिए एक सजातीय विलायक वातावरण प्रदान करते हैं । एकत्र किए गए लिपोसोम पहले एनेल किए जाते हैं, फिर अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने के लिए डायलाइज़ किए जाते हैं। आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके बाहरी समाधान के बफर एक्सचेंज के माध्यम से अमोनियम सल्फेट पीएच-ग्रेडिएंट स्थापित किया जाता है। इसके बाद डॉक्स को उच्च एनकैप्सुलेशन दक्षता (>80%) के साथ लिपोसोम ्स में दूरस्थ रूप से लोड किया जाता है। प्राप्त किए गए लिपोसोम आकार में समरूप होते हैं, जिनका आकार 100 एनएम के जेड-औसत व्यास के साथ होता है। वे हल्के हाइपरथर्मिया (42 डिग्री सेल्सियस) की उपस्थिति में समझाए गए डॉक्स के तापमान-ट्रिगर फट रिलीज में सक्षम हैं। इंडोसाइनाइन ग्रीन (आईसीजी) को निकट अवरक्त लेजर-ट्रिगर डॉक्स रिलीज के लिए लिपोसोम में सह-लोड किया जा सकता है। माइक्रोफ्लूइडिक दृष्टिकोण एलटीएसएल की उच्च-थ्रूपुट, प्रजनन योग्य और स्केलेबल तैयारी सुनिश्चित करता है।

Introduction

एलटीएसएल फॉर्मूलेशन एक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक लिपोसोमल उत्पाद है जिसे कीमोथेरेपी दवा डोक्सोरुबिसिन (डीओएक्स) देने के लिए विकसित किया गया है और चिकित्सकीय रूप से प्राप्य हल्के हाइपरथर्मिया (T, 41 डिग्री सेल्सियस)1पर कुशल फट दवा रिलीज की अनुमति देता है। एलटीएसएल फॉर्मूलेशन में 1,2-डिपलपिटोल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (डीपीपीसी), लाइसोलिपिड 1-स्टीरॉयल-2-हाइड्रोक्सी- एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फेटिडिलचोलिन (एमएसपीसी; एम "मोनो") और PEGylated लिपिड 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[मेथोक्सी (पॉलीथीन ग्लाइकोल)- 2000] (DSPE-PEG2000)के लिए खड़ा है। चरण संक्रमण तापमान (टीएम 41 डिग्री सेल्सियस) तक पहुंचने पर, लिसोलिपिड और डीएसपीई-खूंटी2000 एक साथ झिल्ली छिद्रों के गठन की सुविधा प्रदान करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप दवा 2 की फट रिलीजहोतीहै। LTSLs की तैयारी मुख्य रूप से एक थोक शीर्ष नीचे दृष्टिकोण का उपयोग करता है, अर्थात् लिपिड फिल्म जलयोजन और निष्कासन । समान गुणों वाले बड़े बैचों को पुन: उत्पन्न करना और नैदानिकअनुप्रयोगोंके लिए पर्याप्त मात्रा में तैयार करना चुनौतीपूर्ण बना हुआ है ।

माइक्रोफ्लूइडिक्स लिपोसोम तैयार करने, tunable नैनोकण आकार, प्रजनन क्षमता, और स्केलेबिलिटी3की पेशकश के लिए एक उभरती हुई तकनीक है। एक बार विनिर्माण मापदंडों को अनुकूलित करने के बाद, थ्रूपुट को समानता द्वारा बढ़ाया जा सकता है, बेंच स्केल3,4,5पर तैयार संपत्तियों के समान गुण। पारंपरिक थोक तकनीकों पर माइक्रोफ्लूइडिक्स का एक प्रमुख लाभ लघुकरण के माध्यम से अंतरिक्ष और समय में उच्च नियंत्रणक्षमता के साथ छोटे तरल मात्रा को संभालने की क्षमता है, जो निरंतर और स्वचालिततरीकेसे काम करते हुए तेजी से अनुकूलन की अनुमति देता है। माइक्रोफ्लूइडिक उपकरणों के साथ लिपोसोम का उत्पादन एक बॉटम-अप नैनोप्रिमिटन दृष्टिकोण द्वारा प्राप्त किया जाता है, जो अधिक समय और ऊर्जा कुशल है क्योंकि एक्सट्रूजन और सोनिकेशन जैसी समरूपता प्रक्रियाएं अनावश्यक7हैं। आमतौर पर, लिपिड (और हाइड्रोफोबिक पेलोड) का एक कार्बनिक समाधान (जैसे इथेनॉल) को एक गलत गैर-सॉल्वेंट (जैसे पानी और हाइड्रोफिलिक पेलोड) के साथ मिलाया जाता है। जैसे-जैसे ऑर्गेनिक सॉल्वेंट नॉन सॉल्वेंट के साथ मिक्स होता है, वैसे-वैसे लिपिड के लिए घुलनशीलता कम हो जाती है। लिपिड एकाग्रता अंततः एक महत्वपूर्ण एकाग्रता तक पहुंच जाती है जिस पर वर्षा प्रक्रिया7शुरू हो जाती है । लिपिड के नैनोप्रिपिट अंततः आकार में बढ़ते हैं और एक लिपोसोम में बंद हो जाते हैं। लिपोसोम्स के आकार और एकरूपता को नियंत्रित करने वाले मुख्य कारक गैर-विलायक और विलायक (यानी जलीय-से-कार्बनिक प्रवाह दर अनुपात) के बीच अनुपात हैं; FRR) और लिपिड्स की आत्म-असेंबली के दौरान सॉल्वेंट वातावरण की एकरूपता8।

इसलिए सजातीय लिपोसोम तैयार करने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक्स में कुशल तरल पदार्थ मिश्रण आवश्यक है, और मिक्सर के विभिन्न डिजाइनों को विभिन्न अनुप्रयोगों9में नियोजित किया गया है। कंपित हेरिंगबोन माइक्रोमिक्सर (एसएचएम) निष्क्रिय मिक्सर की नई पीढ़ियों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है, जो कम कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ उच्च थ्रूपुट (एमएल/मिन की सीमा में) को सक्षम बनाता है। यह पारंपरिक माइक्रोफ्लूइडिक हाइड्रोडायनामिक मिक्सिंगउपकरण8,10से बेहतर है । एसएचएम ने हेरिंगबोन खांचे को पैटर्न किया है, जो अराजक अभिवृद्धि9,11द्वारा तरल पदार्थ ों को तेजी से मिलाते हैं। एसएचएम (< 5 एमएस, 10-100 एमएस के ठेठ एकत्रीकरण समय पैमाने से कम) का शॉर्ट मिक्सिंग टाइमस्केल लिपिड सेल्फ असेंबली को समरूप सॉल्वेंट वातावरण में होने की अनुमति देता है, जो एक समान आकार वितरण3,12के साथ नैनोकणों का उत्पादन करता है ।

हालांकि, माइक्रोफ्लूइडिक्स के साथ एलटीएसएल की तैयारी कोलेस्ट्रॉल8की कमी के कारण पारंपरिक लिपोसोमल फॉर्मूलों की तुलना में सीधी नहीं है, जिसके बिना लिपिड बाइलेयर इथेनॉल-प्रेरित इंटरडिजिशन13,14,15के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। अब तक, लिपोसोमके माइक्रोफ्लूइडिक उत्पादन के दौरान अवशिष्ट इथेनॉल प्रस्तुत करने का प्रभाव अच्छी तरह से नहीं समझा गया है। रिपोर्ट किए गए अधिकांश योग स्वाभाविक रूप से इंटरडिजिशन (कोलेस्ट्रॉल या असंतृप्त लिपिड युक्त)16के लिए प्रतिरोधी हैं, जो एलटीएसएल के विपरीत संतृप्त और कोलेस्ट्रॉल मुक्त दोनों हैं।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल तापमान ट्रिगर-रिलीज दवा वितरण के लिए LTSLs तैयार करने के लिए SHM का उपयोग करता है । प्रस्तुत विधि में, हमने यह सुनिश्चित किया कि माइक्रोफ्लूइडिक-तैयार एलटीएसएल नैनो आकार (100 एनएम) और गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) द्वारा एक समान (फैलाव और एलटी; 0.2) हैं। इसके अलावा, हमने एलटीएसएल लिपिड बाइलेयर की अखंडता के सत्यापन के रूप में ट्रांसमेम्ब्रेन अमोनियम सल्फेट ग्रेडिएंट विधि (जिसे रिमोट लोडिंग के रूप में भी जाना जाता है)का उपयोग करके डॉक्स को समझाया। डॉक्स के रिमोट लोडिंग के लिए उच्च एनकैप्सुलेशन दक्षता (ईई) प्राप्त करने के लिए पीएच-ग्रेडिएंट बनाए रखने के लिए लिपोसोम की आवश्यकता होती है, जो एक अक्षुण्ण लिपिड बाइलेयर के बिना होने की संभावना नहीं है। इस प्रस्तुत विधि में, विशिष्ट माइक्रोफ्लूइडिक लिपोसोम तैयारी प्रोटोकॉल से विशिष्ट, रिमोट लोडिंग क्षमता को सक्षम करने के लिए इथेनॉल को हटाने से पहले एक एनिंगिंग कदम की आवश्यकता होती है; यानी लिपिड बाइलेयर की अखंडता को बहाल करने के लिए।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, एलटीएसएलएस के गठन के दौरान पेलोड के एक साथ एन्कैप्सुलेशन के लिए हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक पेलोड को प्रारंभिक समाधानों के लिए भी पेश किया जा सकता है। एक सबूत के रूप में अवधारणा, इंडोसायनाइन ग्रीन (आईसीजी), एक एफडीए के पास अनुमोदित-अवरक्त फ्लोरोसेंट रंग, जो भी एक होनहार फोटोथर्मल एजेंट है, प्रारंभिक लिपिड मिश्रण के लिए पेश किया है और सफलतापूर्वक एलटीएसएलएस में सह लोड । एक ८०८ एनएम लेजर DOX/ICG-भरी हुई LTSLs किरणित करने के लिए प्रयोग किया जाता है और सफलतापूर्वक 5 मिनट के भीतर DOX के फोटोथर्मल हीटिंग ट्रिगर फट रिलीज प्रेरित ।

सभी उपकरण और सामग्री व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, तैयार-उपयोग के लिए, और अनुकूलन की आवश्यकता के बिना। चूंकि एलटीएसएल तैयार करने के लिए सभी मापदंडों को अनुकूलित किया गया है, इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, माइक्रोफ्लूइडिक्स की कोई पूर्व जानकारी वाले शोधकर्ता एलटीएसएल भी तैयार कर सकते हैं, जो थर्मोसेंसिटिव ड्रग डिलीवरी सिस्टम के आधार के रूप में कार्य करता है।

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Protocol

1. उपकरण सेटअप

  1. सिरिंज पंप और एसएचएम को इस प्रकार इकट्ठा करें।
    1. पंप नेटवर्क केबल(चित्रा 1,पीला)पंप का उपयोग करके मास्टर सिरिंज पंप (पंप 01, इथेनॉल लिपिड समाधान के लिए) के "टू नेटवर्क" बंदरगाह के लिए माध्यमिक सिरिंज पंप (पंप 02, जलीय समाधान के लिए) के "कंप्यूटर से कंप्यूटर" बंदरगाह से कनेक्ट करें।
    2. मास्टर पंप के "कंप्यूटर के लिए" बंदरगाह को कंप्यूटर के "RS232 सीरियल" बंदरगाह से कनेक्ट करें पीसी का उपयोग करके नेटवर्क केबल(चित्रा 1,नीला)पंप करें।
    3. एक अखरोट और ferrule का उपयोग कर एसएचएम के इनलेट और आउटलेट में से प्रत्येक के लिए टयूबिंग कनेक्ट करें। एक और अखरोट और ferrule और एक संघ विधानसभा का उपयोग कर महिला लूर के लिए दोनों inlets के लिए ट्यूबिंग के टर्मिनल परिवर्तित । इनलेट्स की लंबी ट्यूबिंग सीरिंज(चित्रा 2)के लिए आसान लगाव की अनुमति देता है ।
  2. पंप कंट्रोल सॉफ्टवेयर स्थापित करें।
    1. सिरिंज पंप के "सेटअप" बटन का उपयोग करके, क्रमशः "विज्ञापन:01" और "विज्ञापन:02" के लिए मास्टर सिरिंज पंप और माध्यमिक सिरिंज पंप का पता आवंटित करें। यह केवल पहली बार किए जाने की जरूरत है ।
    2. पंप कंट्रोल सॉफ्टवेयर को कंप्यूटर पर खोलें। दो सिरिंज पंपों का पता अपने आप लगा देना चाहिए, जिसके बाद बीप की आवाज आ नी चाहिए। अन्यथा, कनेक्शन अपडेट करने के लिए पंप ों पर क्लिक करें और पंपों की खोज करें। (चित्रा 3)।
    3. "एचएसडब्ल्यू नॉर्म-जेसीटी 5 सीसी (व्यास =12.45) का चयन करके व्यास को 12.45 (मिमी) आवंटित करें।
    4. पंप 01 (इथेनॉल लिपिड समाधान) के लिए 0.25 मीटर/मिन के लिए दर आवंटित करें और पंप 02 (जलीय समाधान) के लिए 0.75 mL/मिन। प्रवाह दर 1 एमएल/मिन की कुल प्रवाह दर (टीएफआर) और 3 के जलीय-से-इथेनॉल प्रवाह दर अनुपात (एफआरआर) के अनुरूप है ।
    5. 5 mL से ऊपर के किसी भी मूल्यों के लिए मात्रा आवंटित करें।
      नोट: लक्षित जलसेक मात्रा ट्यूबिंग की शून्य मात्रा को ध्यान में रखते हुए लोडेड तरल मात्रा से अधिक सेट की जाती है।
    6. दोनों पंपों के लिए आईएफ (जलसेक) मोड का चयन करें।
    7. सेटिंग्स की पुष्टि करने के लिए प्रेस सेट करें।

2. एलटीएसएल तैयार करें

  1. एक LTSL10 या LTSL10-ICG लिपिड मिश्रण तैयार (तालिका 1देखें) ।
  2. लिपिड मिश्रण के 1 मिलीएल और (एनएच4)2एसओ4 समाधान के कम से कम 3 मिलील दो 5 मिलीएल लूयर लॉक सिरिंज का उपयोग करके वापस लें।
  3. पंप के सिरिंज रिटेनर को सिरिंज के बैरल फ्लैंज को फिसलने से सीधे स्थिति में सिरिंज पंपों पर दो सिरिंज स्थापित करें, और पंप के पुशर ब्लॉक(चित्रा 4)के लिए सिरिंज के प्लंजर फ्लैंज।
  4. जलीय समाधान के साथ सिरिंज के लिए हीटिंग टेप के अंत लपेटें। लिपिड समाधान के साथ सिरिंज के चारों ओर थर्मोस्टेट के हीटिंग टेप और तापमान जांच के दूसरे छोर को लपेटें। विधानसभा प्रक्रिया(चित्रा 5ए)को कम करने के लिए खाली सीरिंज के साथ इस कदम का अभ्यास करना उपयोगी है।
  5. एसएचएम के संबंधित इनलेट्स की मादा लूयर एडाप्टर से दो सीरिंज कनेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि लिपिड मिश्रण और (एनएच4)2एसओ4 समाधानयुक्त सीरिंज क्रमशः इथेनॉल इनलेट और जलीय इनलेट से जुड़े हुए हैं। सीरिंज(चित्रा 5बी)से हवा के बुलबुले को हटाने के लिए प्लंजर स्थिति को समायोजित करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सिरिंज अभी भी पंपों के सिरिंज रिटेनर पर सुरक्षित रूप से तैनात हैं।
  6. 10 एस हीटिंग सत्र का उपयोग करके हीटिंग टेप का उपयोग करके सीरिंज को 51 डिग्री सेल्सियस से ऊपर गर्म करें। थर्मोस्टेट को सीरिंज के तापमान को अपडेट करने की अनुमति दें। जलसेक के दौरान तापमान को बनाए रखने के लिए निम्नलिखित चरणों में इस कदम को दोहराएं।
    सावधानी: तापमान ओवरशूट को रोकने के लिए 10 एस के बाद हीटिंग टेप बंद करें और थर्मोस्टेट को वास्तविक तापमान को अपडेट करने की अनुमति दें। हीटिंग टेप को भी देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए क्योंकि इसका तापमान बहुत जल्दी बढ़ जाता है। मापा तापमान को अद्यतन करने के लिए थर्मोस्टेट के समय देरी के कारण, लगातार हीटिंग उपकरण और सीरिंज को नुकसान पहुंचा सकता है।
  7. एक बार तापमान 51 डिग्री सेल्सियस से ऊपर हो जाने के बाद, पंप कंट्रोल सॉफ्टवेयर(चित्रा 3)में रन ऑल दबाकर सिरिंज पंप चलाएं।
  8. सुनिश्चित करें कि तरल पदार्थ का प्रवाह हवा के बुलबुले और किसी भी रिसाव से मुक्त है। कचरे के रूप में आउटलेट से तरल की प्रारंभिक मात्रा (लगभग 0.5 मिली) निपटानी।
    नोट: यह प्रारंभिक अपशिष्ट मात्रा निश्चित नहीं है और सेटअप की आंतरिक मात्रा पर निर्भर करता है, जो तरल पदार्थ के लिए ट्यूबिंग और एसएचएम के माध्यम से सीरिंज से आउटलेट तक यात्रा करने की मात्रा है।
  9. बाकी तरल को लिपोसोम नमूनों के रूप में माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब या बिजौ शीशी में एकत्र करें।
  10. जलसेक को रोकें/रोकें जब किसी भी सीरिंज में तरल लगभग खाली हो ।
    नोट: पंपों को मैन्युअल रूप से बंद कर दिया जाना चाहिए, क्योंकि सीरिंज खाली होने पर पंप स्थिति का सही पता नहीं लगा सकते हैं।
  11. एकत्र किए गए लिपोसोम समाधानों को 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 1.5 घंटे के लिए एनील में रखें।
    नोट: यह कदम लिपोसोम ्स में दवा लोडिंग को सक्षम करने में आवश्यक है।
  12. डायलिसिस ट्यूबों के समाधान स्थानांतरित करें। 240 एमएम (एनएच4)2एसओ4 के 1 एल के खिलाफ कम से कम 4 घंटे के लिए शुद्ध लिपोसोम प्राप्त करने के लिए समाधान ों को कम से कम 4 घंटे के लिए डायलकरें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । इस कदम पर Liposomes फॉस्फोलिपिड के 5 mM पर हैं । शुद्ध लिपोसोम 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  13. बार-बार उपयोग के लिए एसएचएम को साफ करने के लिए, एसएचएम को क्रमिक रूप से डिओनाइज्ड पानी, इथेनॉल और नाइट्रोजन गैस के साथ सूखने के साथ फ्लश करें।

3. ट्रांसमेम्ब्रेन पीएच ढाल द्वारा एलटीएसएल में डॉक्स का रिमोट लोडिंग

  1. एक ट्रांसमेम्ब्रेन पीएच ढाल स्थापित करने के लिए आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) का उपयोग करके एचईपी-बफर्ड लवण (एचबीएस) के लिए एलटीएसएल के बाहरी बफर का आदान-प्रदान करें।
    1. कॉलम तैयार करने के लिए एसईसी कॉलम के शीर्ष पर एचबीएस के कुल 25 mL जोड़ें। कॉलम के माध्यम से सभी एल्यूंट को एल्यूट करने और एल्यूएट को निपटाने की अनुमति दें।
    2. कॉलम में स्टेप 2.12 से तैयार डायलिज़्ड लिपोसोम्स का 1 मिलील जोड़ें और एल्यूट को निपटाएं।
    3. कॉलम में एचबीएस का 1.5 एमएल जोड़ें और एल्यूट को निपटाएं।
    4. कॉलम में एचबीएस के 3 एमएल जोड़ें और एल्ट के 3 एमएल को इकट्ठा करें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । लिपोसोम इस चरण में एकत्र किए जाते हैं और फॉस्फोलिपिड के 1.67 एमएम पर हैं। बफर एक्सचेंज किए गए लिपोसोम ्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. डॉक्सोरुबिसिन (डॉक्स) के साथ एलटीएसएलएस को इनक्यूबेट करें और एलटीएसएल को शुद्ध करें।
    1. एक बिजौ शीशी में निहित बफर-एक्सचेंज किए गए लिपोसोम्स सॉल्यूशन (1.67 एमओएल) के 1 मिलील में 1:20 डॉक्स-टू-फॉस्फोलिपिड मोलर अनुपात में DOX समाधान जोड़ें। यह 1 मिलीग्राम/mL DOX समाधान (83.4 μmol) के 48.4 μL जोड़कर प्राप्त किया जा सकता है।
    2. 1.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में बिजौ शीशी रखें ताकि डॉक्स को लिपोसोम में लोड होने की अनुमति दी जा सके।
    3. एक काले ९६-अच्छी तरह से थाली में एचबीएस के १७० μL और 1% (v/v) ट्राइटन एक्स-१०० समाधान के 20 μL के साथ लिपोसोम ्स के 10 μL मिलाएं । तीन कुओं के लिए दोहराएं। ये कुएं "शुद्धि से पहले" डॉक्स सामग्री के अनुरूप हैं।
    4. LTSL10-ICG तैयार करने के मामले में, एक स्पष्ट 96-अच्छी तरह से प्लेट में डीएमएसओ के 160 माइक्रोन के साथ लिपोसोम के 40 माइक्रोन मिलाएं। तीन कुओं के लिए दोहराएं। ये कुएं "शुद्धि से पहले" आईसीजी सामग्री के अनुरूप हैं।
    5. चरण 3.1 में वर्णित लिपोसोम समाधान को शुद्ध करें।
      नोट: भविष्य शुद्धिकरण के लिए कॉलम का पुन: उपयोग करने के लिए, चरण 3.1.1 प्रदर्शन करने से पहले पतला 0.5 एम NaOH समाधान के 1 mL जोड़कर मुक्त डॉक्स से कॉलम को साफ करें। लाल रंग में मुफ्त डॉक्स बैंगनी-नीले रंग की हो जाएगी और कॉलम के माध्यम से जल्दी से elute होगा।
    6. एक काले ९६-अच्छी तरह से थाली में एचबीएस के १५० μL और 1% (v/v) ट्राइटन एक्स-१०० समाधान के 20 μL के साथ शुद्ध लिपोसोमसमाधान के 30 μL मिलाएं । तीन कुओं के लिए दोहराएं। ये कुएं "शुद्धि के बाद" डॉक्स सामग्री के अनुरूप हैं।
    7. LTSL10-ICG के मामले में, एक स्पष्ट 96-अच्छी तरह से प्लेट में DMSO के 160 μL के साथ शुद्ध लिपोसोम समाधान के 40 μL मिश्रण। तीन कुओं के लिए दोहराएं। ये कुएं "शुद्धि के बाद" आईसीजी सामग्री के अनुरूप हैं।
    8. एक माइक्रोप्लेट रीडर (0000 0= 485 एनएम,उन्हें = 590 एनएम) का उपयोग करके (चरण 3.2.5) शुद्धिकरण से पहले कुओं की डॉक्स फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें।
    9. शुद्धि से पहले और बाद में फ्लोरेसेंस तीव्रता का अनुपात लेकर डॉक्स (डॉक्स ईई) की एनकैप्सुलेशन दक्षता की गणना करें।
      Equation 1
    10. एक माइक्रोप्लेट रीडर (600 से 1000 एनएम) का उपयोग करके, शुद्धि से पहले और बाद में कुओं के आईसीजी अवशोषण को मापें।
    11. शुद्धि के दौरान कमजोर पड़ने के कारक (3 बार) को ध्यान में रखते हुए शुद्धि से पहले और बाद में 792 एनएम पर अवशोषण का अनुपात लेकर आईसीजी (आईसीजी ईई) की एनकैप्सुलेशन दक्षता की गणना करें।
      Equation 2

4. डायनेमिक लाइट स्कैटरिंग (डीएलएस)

  1. डिओनाइज्ड वॉटर के 450 माइक्रोन में लिपोसोम्स सॉल्यूशन (स्टेप 2.12) के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  2. सीएलएस इंस्ट्रूमेंट के अंदर क्यूवेट रखें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार माप न करें।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए तीन मापों का मतलब जेड-औसत व्यास और फैलाव रिकॉर्ड करें।

5. अंतर स्कैनिंग कैलोरीमेट्री (डीएससी)

  1. लिपोसोम्स नमूनों का 1 एमएल (चरण 2.12) 0.5 मीटर (10 मीटर की अंतिम लिपिड एकाग्रता) के लिए एक अपकेंद्रित्र फिल्टर इकाई के साथ ध्यान केंद्रित करें। एक निश्चित कोण रोटर का उपयोग करना, लगभग 15 00 मीटर के लिए 7500 x ग्राम पर स्पिन करें।
  2. (एनएच4)2एसओ4 समाधान और लिपोसोम्स के नमूने दो संबंधित डीएससी पैन में स्थानांतरित करें। डीएससी नमूना प्रेस किट का उपयोग कर डीएससी हर्मेटिक लिड्स के साथ पैन सील करें।
  3. डिफरेंशियल स्कैनिंग कैलोरमीटर का इस्तेमाल कर1 डिग्री सेल्सियस/मिन की हीटिंग रेट पर 30 डिग्री सेल्सियस से 60 डिग्री सेल्सियस तक सैंपल को मापें।
  4. उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण करें। चरण संक्रमण संक्रमण (पिघलने वाली चोटी) की शुरुआत के रूप में चरण संक्रमण तापमान (टीएम)लें, जिसे अधिकतम ढलान के बिंदु के स्पर्शरेखा के एक्स-इंटरसेप्ट द्वारा मापा जाता है।

6. डोक्सोरुबिसिन रिलीज

  1. पानी के स्नान का उपयोग करके निर्धारित तापमान (37 या 42 डिग्री सेल्सियस) पर एचबीएस को प्रीहीट करें। नमूनों को बुझाने के लिए बर्फ के पानी का स्नान तैयार करें।
  2. एक माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में एचबीएस के 1.9 मिलील में शुद्ध डॉक्स-लोडेड लिपोसोम (चरण 3.2.5) के 100 माइक्रोन जोड़ें। ट्यूब को निर्धारित तापमान के पानी के स्नान में रखें।
  3. ट्यूब से नमूनों के तुरंत २०० μL वापस लें और जल्दी से यह बर्फ के पानी के स्नान में किसी भी बाद दवा रिलीज बुझाने के लिए जगह है । यह नमूना प्रारंभिक (टी = 0) समय बिंदु से मेल खाती है।
  4. बाद के समय बिंदुओं पर नमूनों के 200 μL वापस लें (टी = 5, 10, 15, 30, 60 min) और जल्दी से यह बर्फ के पानी के स्नान में जगह के लिए किसी भी दवा रिलीज बुझाने.
  5. एक काले 96-अच्छी तरह से प्लेट में एचबीएस के 150 माइक्रोन के साथ प्रत्येक समय बिंदु के नमूने के 50 μL मिलाएं। प्लेट रीडर का उपयोग करके डॉक्स फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें।
  6. चरण 6.5 में तैयार यादृच्छिक चयनित कुओं में 1% (v/v) ट्राइटन एक्स-100 के 20 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट रीडर का उपयोग करके इन कुओं की डॉक्स फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें। ये मूल्य पूरी तरह से जारी (टी = 100% रिलीज) टाइम पॉइंट के अनुरूप हैं।
  7. गणना और प्रत्येक समय अंक (मैं (टी)) की फ्लोरेसेंस तीव्रता interpolating द्वारा जारी DOX के प्रतिशत की गणना और साजिश, प्रारंभिक (मैं (0)), मूल्य की तुलना में ।
    Equation 3

7. लेजर हीटिंग और ट्रिगर रिलीज

  1. पानी के स्नान का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें और तापमान को स्थिर होने दें।
  2. एक स्पष्ट 96-अच्छी प्लेट में डीएक्स लोडेड LTSL10-ICG ([ICG] = 10 μg/mL) के 200 μL जोड़ें, फिर इसे पानी के स्नान में रखें, नीचे को पानी में डुबोए रखें।
  3. लेजर सिस्टम की धारा को 2.27 ए में सेट करें। 96-वेल प्लेट की सतह के ऊपर 5 सेमी पर लेजर सिस्टम के कोलिलेटर को रखें, जो 0.5 डब्ल्यू/सेमी2 [चित्रा 6]के ऊर्जा प्रवाह से मेल खाता है।
    सावधानी: लेजर प्रणाली प्रासंगिक लेजर सुरक्षा उपायों के अनुपालन में संचालित किया जाना चाहिए।
  4. लेजर पर स्विच करें और फाइबर ऑप्टिक तापमान जांच का उपयोग करके हर मिनट तापमान की निगरानी करें।
  5. 5 और 10 मिन में, स्पष्ट ९६-अच्छी तरह से थाली से लेजर-विकिरणित liposomes के 10 μL वापस लेने और एक काले ९६-अच्छी तरह से थाली में तीन कुओं के लिए एचबीएस के १९० μL के साथ मिश्रण ।
  6. एक काले ९६-अच्छी तरह की थाली में तीन कुओं के लिए 1% (v/v) ट्राइटन एक्स-१०० समाधान के 1% के साथ लिपोसोम ्स के 10 μL मिलाएं । ये कुएं "100% जारी" DOX सामग्री के अनुरूप हैं। DOX फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने और 6.7 कदम में वर्णित के रूप में DOX रिलीज की गणना।

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Representative Results

माइक्रोफ्लूइडिक्स द्वारा एलटीएसएल तैयार करने के लिए डीपीपीसी/एमएसपीसी/डीएसपीई-खूंटी2000 (80/10/10, मोलर अनुपात) की लिपिड संरचना की आवश्यकता होती है; LTSL10) । चित्रा 7ए (बाएं) एक स्पष्ट और गैर चिपचिपा तरल के रूप में, चरण 2.9 से तैयार LTSL10 की उपस्थिति को दर्शाता है। LTSL10 निर्माण पारंपरिक निर्माण, LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-खूंटी२०००,86/10/4, मोलर अनुपात) से विकसित किया गया है क्योंकि LTSL4 एक जेल की तरह चिपचिपा नमूना बनाता है, जैसा कि नमूने में फंसे हवा बुलबुले की बड़ी मात्रा से संकेत मिलता है(चित्रा 7ए;सही) ।

LTSL10(चित्रा 7बी,लाल) के डीएलएस मापन से पता चला है कि जेड-औसत व्यास और LTSL10 का फैलाव क्रमशः 95.28 ± 7.32 एनएम और 0.100 ± 0.022 था, जो प्रयोग की सफलता का संकेत है। चित्रा 7बी (ग्रे) एक उप-इष्टतम नमूना भी दिखाता है, जिसे 20 डिग्री सेल्सियस पर तैयार किया गया था, जहां बड़े और अधिक बिखरे हुए लिपोसोम प्राप्त किए गए थे।

चित्रा 7सी से पता चलता है कि LTSL10 के DOX EE । DOX EE आमतौर पर लगभग 80% होना चाहिए। एक्सट्रूजन (वामो) के साथ लिपिड फिल्म हाइड्रेशन की पारंपरिक विधि द्वारा तैयार एलटीएसएल को तुलना के लिए शामिल किया गया है, जैसा कि कहीं और वर्णित है18। LTSL4 (LF) और LTSL10 (LF) के DOX ईई ने क्रमशः लगभग 70% और 50% की सभ्य डॉक्स लोडिंग दिखाई। DOX लोडिंग को सक्षम करने के लिए तैयार एलटीएसएल10 (चरण 2.11) की एनियलिंग आवश्यक है। एनीलिंग स्टेप के अभाव में कम डॉक्स ईई (<20%) लगातार था, ऊष्मायन तापमान (20 डिग्री सेल्सियस से 42 डिग्री सेल्सियस) और अवधि (1 से 24 घंटे) की परवाह किए बिना। इसने एक ट्रांसमेम्ब्रेन पीएच ढाल बनाए रखने के लिए LTSL10 की विफलता का संकेत दिया, जहां DOX के बजाय निष्क्रिय या सोखने के बजाय लोड किया गया था। के रूप में तैयार LTSL10, DOX EE के रूप में तैयार 85% के एक मतलब करने के लिए काफी वृद्धि हुई है, DOX के रिमोट लोडिंग की सफलता और ट्रांसमेम्ब्रेन पीएच ढाल की उपस्थिति का संकेत है।

चित्रा 7डी LTSL10 के DOX रिलीज प्रोफाइल से पता चलता है । 37 डिग्री सेल्सियस पर, 60 मिन से अधिक समझाया DOX की रिहाई के बारे में 10% था. इसके विपरीत, 42 डिग्री सेल्सियस पर, सभी समझाया डॉक्स 5 मिनट के भीतर जारी किया गया था, जो LTSL10 की तापमान-संवेदनशीलता का प्रदर्शन करता है। इसी तरह के परिणाम एक नियंत्रण के रूप में LTSL10 (वामो) के साथ मनाया गया ।

चित्रा 8 में अंतर स्कैनिंग कैलोरीमेट्री (डीएससी) का उपयोग करके एलटीएसएल10 के चरण संक्रमण तापमान (टीएम)को दिखाया गया है। अधिकतम ढलान के बिंदु के स्पर्शरेखा के रूप में बिंदीदार लाइनों को शुरुआत चरण संक्रमण तापमान (स्पर्शरेखा के एक्स-इंटरसेप्ट) की दृश्य सहायता के रूप में जोड़ा जाता है। LTSL10 में 41.6 डिग्री सेल्सियस और 42.6 डिग्री सेल्सियस पर चोटी पर शुरुआत के साथ अपेक्षाकृत व्यापक चरण संक्रमण है। इसी तरह के परिणाम LTSL10 (वामो) के साथ मनाए गए, तैयारी तकनीकों के बीच एक मामूली अंतर का सुझाव दिया । एक तुलना के रूप में, LTSL4 (वामो) एक कम और तेज चरण संक्रमण है, साहित्य के साथ समझौते में1।

चित्रा 9 LTSL10-ICG के लक्षण वर्णन से पता चलता है । आकार पर प्रारंभिक आईसीजी एकाग्रता का प्रभाव(चित्रा 9ए)और डॉक्स और आईसीजी(चित्रा 9बी)की लोडिंग क्षमता को तीन एकाग्रता पर्वतमाला में वर्गीकृत किया गया है। कम आईसीजी एकाग्रता (आईसीजी-टू-लिपिड मोलर अनुपात 0.003; 60 माइक्रोएम आईसीजी और 20 एमएम लिपिड की प्रारंभिक एकाग्रता), जेड-औसत, फैलाव और डॉक्स ईई आईसीजी लोडिंग के बिना एलटीएसएल10 के समान थे; आईसीजी ईई 75% के आसपास था। एलटीएसएल10 में डीओएक्स और आईसीजी के कुशल सह-लोडिंग को इस आईसीजी एकाग्रता पर प्राप्त किया जा सकता है। मध्यवर्ती आईसीजी सांद्रता में, जबकि नमूनों का आकार और फैलाव संतोषजनक था, दोनों DOX और आईसीजी ईई कम थे । विशेष रूप से, डॉक्स ईई में कमी ने लिपोसोमल झिल्ली के व्यवधान का संकेत दिया और इस प्रकार, पीएच-ढाल। उच्च आईसीजी सांद्रता में, नमूनों को फिर से जेल किया गया; DOX और ICG ईई दोनों काफी कम थे ।

LTSL10-ICG के पास अवरक्त लेजर (धारा 7) के साथ किरणित किया गया था फोटोथर्मल हीटिंग प्रेरित करने के लिए और DOX(चित्रा 10)की रिहाई शुरू कर दिया । लेजर विकिरण पर, नमूना पहले तापमान की क्रमिक कमी के साथ 49.7 डिग्री सेल्सियस तक गर्म हो गया। इसके बाद लेजर विकिरण से तापमान बढ़कर 36.7 डिग्री सेल्सियस हो गया। जारी डॉक्स के परिमाणीकरण ने संकेत दिया कि पहले हीटिंग चक्र के बाद समझाया डॉक्स की एक पूरी फट रिलीज हासिल की गई थी। यह तापमान 42 डिग्री सेल्सियस से ऊपर पहुंचने के बाद से उम्मीद थी, चित्रा 7डीमें दिखाए गए डॉक्स रिलीज प्रोफाइल के साथ समझौते में। इसके विपरीत, आईसीजी के बिना LTSL10 फोटोथर्मल हीटिंग प्रदान नहीं कर सकता है, और इस प्रकार लेजर विकिरण पर DOX जारी नहीं किया।

Figure 1
चित्रा 1: सिरिंज पंप सेटअप की तस्वीर। मास्टर पंप (पंप 01) का "टू नेटवर्क" बंदरगाह माध्यमिक पंप (पंप 02; पीला) के "कंप्यूटर के लिए" से जुड़ा हुआ है; मास्टर पंप का "टू कंप्यूटर" पोर्ट कंप्यूटर (ब्लू) के आरएस-232 पोर्ट से जुड़ा हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एसएचएम सेटअप की तस्वीर। (ए)एसएचएम सेटअप का असेंबल व्यू । (ख)एसएचएम सेटअप का विस्फोट दृश्य । इनलेट्स और एसएचएम के आउटलेट अखरोट और फेरूल का उपयोग करके ट्यूबिंग से जुड़े हुए हैं। दोनों inlets के ट्यूबिंग प्रत्येक छोर पर अखरोट और ferrule के साथ एक लंबे समय तक टयूबिंग द्वारा बढ़ाया जाता है, एक महिला Luer एडाप्टर द्वारा समाप्त एक संघ विधानसभा का उपयोग कर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पंप नियंत्रण सॉफ्टवेयर का इंटरफेस। सॉफ्टवेयर शुरू करने पर दो सिरिंज पंपों का स्वचालित रूप से पता लगाया जाना चाहिए; अन्यथा, शीर्ष बाएं कोने पर पंपों पर क्लिक करें और पंपों के लिए खोजें . कॉन्फ़िगर किए जाने वाले मापदंडों को लाल बक्से में हाइलाइट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: सिरिंज पंपों की तस्वीर और एक सिरिंज की स्थापना। (A)सिरिंज रिटेनर ब्रैकेट और सिरिंज रिटेनर थंबस्क्रू (2, प्रत्येक तरफ एक) सिरिंज पंप (येलो बॉक्स) का। पुशर ब्लॉक, एडजस्टमेंट थंबस्क्रू, और ड्राइव-नट बटन (बाईं ओर सफेद बटन) सिरिंज पंप (ग्रीन बॉक्स) का। (ख)सिरिंज पंप पर एक स्थापित सिरिंज की स्थिति । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: सीरिंज, हीटिंग तत्व और एसएचएम की विधानसभा की तस्वीर। (A)सीरिंज, हीटिंग टेप और थर्मोस्टेट की असेंबली। (ख)सीरिंज, हीटिंग टेप, थर्मोस्टेट और एसएचएम की असेंबली । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: लेजर सेटअप की तस्वीर। (A)ऑपरेशन के दौरान फाइबर युग्मित लेजर सिस्टम की तस्वीर। (ख)96-वेल प्लेट के ऊपर कोलिमेटर 5 सेमी की स्थिति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: LTSL10 का लक्षण वर्णन। (A)डायलिसिस से पहले (बाएं) LTSL10 और (दाएं) LTSL4 की तस्वीर । LTSL10 स्पष्ट और गैर चिपचिपा तरल के रूप में दिखाई दिया, जबकि LTSL4 जेल की तरह और चिपचिपा था । }जेड-एवरेज व्यास और 20 और 51 डिग्री सेल्सियस पर तैयार एलटीएसएल10 के 10 एमएम का फैलाव। ठोस बार और खुले घेरे (()क्रमशः जेड-औसत व्यास और फैलाव का संकेत देते हैं। (C)एलटीएसएल4 (वामो; सफेद), एलटीएसएल10 (वामो; सफेद), और एलटीएसएल10 से पहले (ग्रे) और एनीलिंग (लाल) के बाद डीओएक्स ईई । (घ)37 डिग्री सेल्सियस (काला) और 42 डिग्री सेल्सियस (लाल) पर एलटीएसएल10 (सर्कल) और एलटीएसएल10 (वामो; क्रॉस) की डीएक्स रिलीज। डेटा कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब ± एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। पी एंड एलटी; 0.001; दो पूंछ वाले अनपेयर टी-टेस्ट । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: LTSL10 के थर्मल गुण। एलटीएसएल4 (एलएफ), एलटीएसएल10 (एलएफ) और एलटीएसएल10 के थर्मोग्राफ डीएससी द्वारा विशेषता है। बिंदीदार लाइनों शुरुआत चरण संक्रमण तापमान की एक दृश्य सहायता के रूप में जोड़ा जाता है । डेटा कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: LTSL10-ICG का लक्षण वर्णन। (A)आईसीजी-लोडेड एलटीएसएल10 का जेड-एवरेज व्यास (लाल) और फैलाव (नीला) । (ख)आईसीजी-लोडेड एलटीएसएल10 के डीओएक्स ईई (रेड) और आईसीजी ईई (ग्रीन) । डेटा कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब ± एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्रा 10: लेजर प्रेरित फोटोथर्मल हीटिंग DOX-भरी हुई LTSL10 और LTSL10-ICG की रिहाई शुरू कर दिया । (A)लेजर-प्रेरित फोटोथर्मल हीटिंग के दौरान विकिरणित नमूनों का तापमान और(बी)डॉक्स-लोडेड एलटीएसएल10 (नीला) और एलटीएसएल10-आईसीजी (लाल) का रिलीज । डेटा कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब ± एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: लिपिड मिश्रण, बफ़र्स और स्टॉक समाधान।

20 एमएम LTSL10 लिपिड मिश्रण
(डीपीपीसी/एमएसपीसी/डीएसपीई-PEG2000; 80/10/10, मोलर अनुपात)		 20 एमएम LTSL10 लिपिड मिश्रण के 1 mL के लिए:
एमएसपीसी इथेनॉल स्टॉक (5 मिलीग्राम/mL), 558 μL DSPE-PEG2000 इथेनॉल स्टॉक (10 मिलीग्राम/mL) और इथेनॉल के 232 माइक्रोन के साथ डीपीपीसी के 11.75 मिलीग्राम को भंग करें।
वैकल्पिक रूप से, एमएसपीसी (1.05 मिलीग्राम) और डीएसपीई-PEG2000 (5.58 मिलीग्राम) की बराबर राशि पाउडर के रूप में जोड़ी जा सकती है।
20 एमएम एलटीएसएल10-आईसीजी लिपिड मिश्रण
(डीपीपीसी/एमएसपीसी/डीएसपीई-खूंटी 2000; 80/10/10, मोलर अनुपात;
आईसीजी-टू-लिपिड मोलर अनुपात = 0.003)		 20 एमएम आईसीजी-लोडेड एलटीएसएल10 लिपिड मिश्रण के 1 mL के लिए:
एमएसपीसी इथेनॉल स्टॉक (5 मिलीग्राम/mL), 558 μL DSPE-PEG2000 इथेनॉल स्टॉक (10 मिलीग्राम/mL) के 210 माइक्रोन के साथ डीपीपीसी के 11.75 मिलीग्राम भंग करें, और आईसीजी इथेनॉल स्टॉक (1 मिलीग्राम/mL) और इथेनॉल के 185.5 माइक्रोन के 46.5 माइक्रोन।
वैकल्पिक रूप से, एमएसपीसी (1.05 मिलीग्राम) और डीएसपीई-PEG2000 (5.58 मिलीग्राम) की बराबर राशि पाउडर के रूप में जोड़ी जा सकती है।
इसमें आईसीजी के 60 माइक्रोएम और लिपिड का 20 एमएम शामिल है।
240 एमएम अमोनियम सल्फेट समाधान (एनएच4)2एसओ4,पीएच 5.4 31.71 ग्राम (एनएच4)2एसओ4 प्रति एल डिओनाइज्ड पानी को भंग करें।
समाधान का पीएच मूल रूप से 5.4 है, अतिरिक्त पीएच समायोजन की आवश्यकता नहीं है।
डॉक्सोरुबिसिन समाधान (DOX), 1 मिलीग्राम/ डिओनाइज्ड पानी के प्रति 1 मिलीग्राम डॉक्स को भंग करें।
DSPE-PEG2000 इथेनॉल स्टॉक, 10 मिलीग्राम/mL एथेनॉल के प्रति मिलीएम में 10 मिलीग्राम डीएसपीई-खूंटी 2000 को भंग करें।
HEPES-बफर खारा (एचबीएस), पीएच 7.4 नासीएल के 8.0 ग्राम और 4.766 ग्राम हेप्स प्रति एल डिओनाइज्ड पानी को भंग कर दें।
पीएच को 2.5 एम नाओएच समाधान के साथ 7.4 पर समायोजित करें।
आईसीजी इथेनॉल स्टॉक, 1 मिलीग्राम/mL इथेनॉल के प्रति मिलीग्राम आईसीजी के 1 मिलीग्राम भंग।
एमएसपीसी इथेनॉल स्टॉक, 5 मिलीग्राम/mL इथेनॉल के प्रति मिलीग्राम डीपीपीसी की 5 मिलीग्राम भंग।

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक कंपित हेरिंगबोन माइक्रोमिक्सर (एसएचएम) का उपयोग करके कम तापमान-संवेदनशील लिपोसोम (एलटीएसएल) की तैयारी का वर्णन करता है। LTSL10 फॉर्मूलेशन 42 डिग्री सेल्सियस के चिकित्सकीय प्राप्य हाइपरथर्मिक तापमान पर 5 मिनट के भीतर डोक्सोरुबिसिन के तापमान से शुरू फट ने जारी करने में सक्षम बनाता है। इंडोसाइनाइन ग्रीन (आईसीजी) को फोटोथर्मल हीटिंग के लिए सह-लोड किया जा सकता है, जिससे डॉक्स की रिहाई शुरू हो गई। विधि पर निर्भर करता है: (i) एसएचएम11में इथेनॉल और अमोनियम सल्फेट समाधान के तीव्र, अराजक मिश्रण और अमोनियम सल्फेट समाधान द्वारा प्रदान किए गए एक समरूप सॉल्वेंट वातावरण के तहत लिपोसोम में फॉस्फोलिपिड की आत्म-असेंबली; (ii) डॉक्स लोडिंग के लिए आवश्यक लिपिड बाइलेयर की अखंडता को संरक्षित करने के लिए लिपोसोम्स का एनियलिंग; और (iii) एक अमोनियम सल्फेट पीएच-ढाल17द्वारा एलटीएसएल में DOX के रिमोट लोडिंग । चूंकि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए उपकरण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऑफ-द-शेल्फ हैं और पैरामीटर अनुकूलित किए जाते हैं, इसलिए यह दृष्टिकोण पूर्व ज्ञान या माइक्रोफ्लूइडिक्स अनुभव के बिना उपयोगकर्ताओं के लिए प्रबंधनीय है।

प्रोटोकॉल के भीतर सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक यह सुनिश्चित करना है कि पूरी असेंबली ठीक से सुरक्षित हो और तरल पदार्थ का उचित संचार किया जा सके (चरण 2.5)। चूंकि लिपोसोम्स की आत्म-असेंबली की प्रजनन क्षमता एक समरूप विलायक वातावरण पर निर्भर करती है, इसलिए किसी भी अस्थिरता, जैसे कि सीरिंज का उखाड़ फेंकना या हवा के बुलबुले की शुरूआत, तरल पदार्थ के प्रवाह की स्थिरता को परेशान करेगी और परिणामस्वरूप उप-इष्टतम होगा लिपोसोम आकार और फैलाव। यह भी चरण २.८ के पीछे तर्क है, जहां मात्रा, शुरू में चैनल पर कब्जा तरल पदार्थ से मिलकर और एक स्थिर प्रवाह तक पहुंचने से पहले, का निपटारा किया जाना चाहिए ।

एक सफल प्रयोग के लिए एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम उच्च DOX EE (चरण 2.11) को सक्षम करने के लिए, annealing कदम है। कोलेस्ट्रॉल मुक्त लिपोसोम्स में, मिसेल-फॉर्मिंग झिल्ली घटक (यानी एमएसपीसी और डीएसपीई-खूंटी2000)उच्च झिल्ली वक्रता2को समायोजित करने के लिए उच्च डिग्री दोषों के साथ अनाज की सीमाओं पर जमा होंगे। ये व्यवस्थाएं थर्मोडायनामिक रूप से गठन का पक्ष लेते हैं और झिल्ली छिद्रों, खोले गए लिपोसोम, या बाइलेयर डिस्क को स्थिर करते हैं। एनियलिंग के बिना एलटीएसएल10 के कम डॉक्स ईई ने सुझाव दिया कि असुरक्षित संरचनाएं टीएम सेनीचे भी मौजूद हैं, जिसके परिणामस्वरूप डॉक्स लोडिंग(चित्रा 7सी)के लिए आवश्यक पीएच ग्रेडिएंट की अनुपस्थिति होती है। टीएम से नीचे के छिद्रों का समय से पहले गठन लिपिड फिल्म (एलटीएसएल4 (एलएफ) और एलटीएसएल10 (एलएफ) द्वारा तैयार एलटीएसएल के लिए नहीं देखा गया था, जहां एनीलिंग की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, माइक्रोफ्लूइडिक्स द्वारा तैयार कोलेस्ट्रॉल युक्त योगों को भी एनीलिंग8की आवश्यकता नहीं होती है। इसलिए, यह अनुमान लगाया गया है कि छिद्रों का समय से पहले गठन तैयारकरने के दौरान इथेनॉल की उपस्थिति और लिपिड बाइलेयर में कोलेस्ट्रॉल की कमी का संयुक्त प्रभाव है। बीलेयर झिल्ली के भीतर संरचनात्मक दोषों को टीएमसे ऊपर के लिपोसोम्स को एनीलिंग करके समाप्त किए जाने की सूचना दी गई है, जिससे लिपिड अणुसजातीय रूप से पुनर्वितरित हो सकते हैं और दोषों को ठीक किया जा सकता है। इसके अलावा, एनीलिंग प्रक्रिया एक अपरिवर्तनीय प्रक्रिया है जहां टीएम से नीचे तापमान पर लौटने वाले एनियल लिपोसोम ्सट वेसिकल्स19को एनेलेड एलटीएसएल10 के साथ समझौते में नहीं बनाते हैं।

लिपोसोम की माइक्रोफ्लूइड तैयारी की प्रकृति एक नैनोप्रिसिप्रिशन प्रक्रिया है, जिसके लिए लिपिड के लिए विशिष्ट घुलनशीलता के साथ दो गलत सॉल्वैंट्स की आवश्यकता होती है: आमतौर पर, इथेनॉल (लिपिड सॉल्वेंट के रूप में) और जलीय समाधान (लिपिड गैर-सॉल्वेंट के रूप में)। इस प्रकार, इथेनॉल की उपस्थिति अपरिहार्य है। इसलिए, ऐसे योगों को जो अल्कोहल-प्रेरित इंटरडिजिशन13से संवेदनशील या प्रवण हैं, जैसे कोलेस्ट्रॉल-मुक्त लिपोसोम्स20,प्रोटोकॉल के निर्माण या फिर से अनुकूलन के संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। जैसा कि LTSL4 की तैयारी के साथ प्रदर्शन किया गया था, अत्यधिक चिपचिपा जेल प्राप्त किया गया था,(चित्रा 7ए),जो एक इंटरडिजिटेड जेल चरण15के गठन के कारण होने की संभावना थी। दूसरी ओर, LTSL10, अपनी उच्च बहुलक एकाग्रता के साथ जो इंटरडिजिशन21को रोकता है, सफलतापूर्वक तैयार किया गया था। नतीजतन, इथेनॉल हटाने की प्रक्रिया भी की जानी चाहिए; यहां, इसे बस डायलिसिस द्वारा हटा दिया गया था। जबकि स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन (इथेनॉल हटाने और बफर एक्सचेंज दोनों में सक्षम) जैसी ऑन-चिप निरंतर शुद्धिकरण तकनीकों को22,23विकसित किया गया है, उनका कार्यान्वयन (एक चिप या मॉड्यूलर के रूप में) इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य से परे हैं। फिर भी, भविष्य में, हम उम्मीद करते हैं कि इन मॉड्यूलर या मानकीकृत डिजाइनों को अनुकूलित किया जाए और उपलब्धता में वृद्धि की जाए, जिससे माइक्रोफ्लूइडिक उत्पादन प्रक्रिया को सुव्यवस्थित किया जा सके।

प्रोटोकॉल की एक और सीमा तरल पदार्थ की यात्रा की दूरी के कारण नमूना हानि है, अर्थात् प्रारंभिक अपशिष्ट मात्रा (चरण 2.8) के साथ-साथ समाधानों का अंतिम अंश जो इंजेक्ट किया जाएगा लेकिन आउटलेट तक नहीं पहुंचेगा। ये नमूना नुकसान लगभग अपरिहार्य हैं और बेंच-स्केल उत्पादन में तैयारी की मात्रा के एक महत्वपूर्ण हिस्से में योगदान दे सकते हैं, खासकर जब एक छोटी मात्रा या कीमती नमूने तैयार किए जाने हैं। जब आवश्यक हो, लिपिड वसूली उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी-वाष्पीकरण प्रकाश बिखरने डिटेक्टर विधि है कि लिपिड सांद्रता24के तेजी से मात्राकरण सक्षम बनाता द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । हालांकि, एक बार प्रक्रिया को अनुकूलित और बढ़ादिया जाता है, जैसे कि एक बड़ी सिरिंज या द्रव जलाशय का उपयोग करके, थ्रूपुट को और बढ़ाया जा सकता है और नमूना नुकसान कम महत्वपूर्ण होगा।

इस विधि और मौजूदा तैयारी विधि के बीच मुख्य अंतर यह है कि लिपोसोम ्सकोप ्स को उच्च-थ्रूपुट, निरंतर तरीके से नियंत्रणीय विलायक वातावरण में स्वयं-असेंबल किया जाता है। लिपिड फिल्म विधि एक बैच विनिर्माण प्रक्रिया है और आकार समरूपता की आवश्यकता है। जबकि एक बेंच पैमाने पर बहुत संभव है, यह नैदानिक उत्पादन के लिए पैमाने पर चुनौतीपूर्ण बना हुआ है । उदाहरण के लिए, मौजूदा माइक्रोफ्लूइडिक तकनीकों के भीतर, माइक्रोफ्लूइडिक हाइड्रोडायनामिक फोकसिंग, एसएचएम कम कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ एक छोटा मिक्सिंग टाइमस्केल11 और एक बड़ा थ्रूपुट (एमएल/मिन की सीमा में) प्रदान करता है; एलटीएसएल की तैयारी के बावजूद अब तक अन्य माइक्रोफ्लूइडिक उपकरणों का उपयोग करके रिपोर्ट नहीं की गई है। हमारे दृष्टिकोण का प्रमुख लाभ थर्मोसेंसिटिव लिपोसोम्स का उच्च-थ्रूपुट, स्केलेबल उत्पादन है।

इस प्रकार अब तक, हमारा माइक्रोफ्लूइडिक प्रोटोकॉल दवा लोडिंग क्षमता के साथ LTSL10 का निरंतर उत्पादन प्रदान करता है। DOX और आईसीजी के अलावा अन्य पेलोड भी व्यवहार्य हैं। हालांकि, डायलिसिस द्वारा इथेनॉल हटाने, दवा रिमोट लोडिंग, और एसईसी कॉलम द्वारा शुद्धिकरण बैच प्रक्रियाओं के रूप में रहते हैं और समग्र निर्माण प्रक्रिया की बाधाएं हैं। भविष्य के विकास इन डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं के थ्रूपुट को बढ़ाने और प्रोटोकॉल की स्केलेबिलिटी को बढ़ाने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक दृष्टिकोण (जैसे स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन) का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम प्रोस्टेट कैंसर यूके (सीडीएफ-12-002 फैलोशिप) और इंजीनियरिंग एंड फिजिकल साइंसेज रिसर्च काउंसिल (ईपीएसआरसी) (ईपीएसआरसी) (EP/M008657/1) को फंडिंग के लिए धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Lipoid PC 16:0/16:0 (DPPC)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) Lipoid PE 18:0/18:0-PEG 2000
(MPEG 2000-DSPE)
1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) Avanti Polar Lipid 855775P-500MG Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC
(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375-100G
Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF IDEX Health & Science P-624 Requires 2 units. For the inlets
Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF IDEX Health & Science P-630 Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)
Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich 31119-1KG-M
Bijou vial VWR 216-0980 7 mL, clear, polystyrene vial
Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801008 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit
Centrifuge ThermoFisher Scientific Heraeus Megafuge 8R With HIGHConic III Fixed Angle Rotor
Cuvette Fisher Scientific 11602609 Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement
Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi Sigma-Aldrich PURX12015-1KT 12-14 kDa MWCO
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 34943-1L-M
DLS Instrument Malvern Panalytical Zetasizer Nano ZS90
Doxorubicin Hydrochloride (DOX) Apollo Scientific BID0120
DSC Instrument TA Instruments TA Q200 DSC
DSC Tzero Hermetic Lids TA Instruments 901684.901 For DSC measurement
DSC Tzero Pans TA Instruments 901683.901 For DSC measurement
DSC Tzero Sample Press Kit TA Instruments 901600.901 For DSC measurement
Ethanol VWR 20821.330 Absolute, ≥99.8%
FC-808 Fibre Coupled Laser System CNI Optoelectronics Tech FC-808-8W-181315 FOC-01-B Fiber Collimator included.
Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD IDEX Health & Science P-200 For the outlet
Fibre Optic Temperature Probe Osensa PRB-G40
Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) Darwin Microfluidics Herringbone Mixer - Glass Chip
Heating Tape Omega DHT052020LD Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models
Indocyanine Green Adooq A10473-100 Distributed by Bioquote Limited (U.K.)
Luer-lock Syringe, 5 mL VWR 613-2043 Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm
Microplate Reader BMG Labtech FLUOstar Omega Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters
Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom ThermoFisher Scientific 611F96BK For fluorescence measurement in microplate reader
Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom Grenier 655101 For absorbance measurement microplate reader
Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD IDEX Health & Science P-245 For the outlet
PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft World Precision Instruments NE-PC7 Optional: Syringe pumps can be operated manually
Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2 World Precision Instruments SYRINGE-PUMP-PRO-02 Optional: Syringe pumps can be operated manually
Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft World Precision Instruments NE-NET7 Optional: Syringe pumps can be operated manually
Size exclusion chromatography (SEC) column GE Life Science 17085101 Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 31434-1KG-M
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881-500G
Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) World Precision Instruments ALADDIN2-220/AL1000-220
Thermostat Temperature Controller Inkbird ITC-308 Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Tubing, ETFE (1/16" OD) IDEX Health & Science 1516
USB To RS-232 Converter World Precision Instruments CBL-USB-232 Optional: For computer without RS-232 port
Water Bath Grant Instruments Ltd. JB Nova 12

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References

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बायोइंजीनियरिंग इश्यू 157 माइक्रोफ्लूइडिक्स लिपोसोम्स थर्मोसेंसिटिव लाइसोलिपिड एलटीएसएल कंपित हेरिंगबोन माइक्रोमिक्सर कोलेस्ट्रॉल मुक्त इंडोसाइनिन ग्रीन (आईसीजी) डोक्सोरुबिसिन लोडिंग (DOX)
लाइसोलिपिड युक्त तापमान-संवेदनशील लिपोसोम्स का माइक्रोफ्लूइडिक उत्पादन
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Cheung, C. C. L., Ma, G., Ruiz, A., Al-Jamal, W. T. Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes. J. Vis. Exp. (157), e60907, doi:10.3791/60907 (2020).

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