Summary
Протокол представляет оптимизированные параметры для подготовки термочувствительных липосом с помощью ступенчатой елочка микромиксер microfluidics устройства. Это также позволяет совместно инкапсуляции доксорубицина и индоцианина зеленый в липосомы и фототермальных триггеров выпуска доксорубицина для контролируемого / триггерного выпуска препарата.
Abstract
Представленный протокол обеспечивает высокую пропускную способность непрерывной подготовки низкотемпературно чувствительных липосом (LTSL), которые способны загружать химиотерапевтические препараты, такие как доксорубицин (DOX). Для этого этаноличная липидная смесь и раствор сульфата аммония вводятся в пошатнувшийся микромиксер елочки (SHM). Решения быстро смешиваются SHM, обеспечивая однородную платежеспособную среду для самосборки липосом. Собранные липосомы сначала анзанываются, затем диализуются для удаления остаточного этанола. Аммоний сульфат рН-градиент устанавливается путем буферного обмена внешнего раствора с помощью хроматографии исключения размера. DOX затем удаленно загружается в липосомы с высокой эффективностью инкапсуляции (No gt; 80%). Полученные липосомы однородны по размеру с диаметром 100 нм. Они способны температурного всплеска высвобождение инкапсулированных DOX в присутствии легкой гипертермии (42 градусов по Цельсию). Индоцианин зеленый (ICG) также может быть совместно загружен в липосомы для ближнего инфракрасного лазерного триггера DOX релиз. Микрофлюидный подход обеспечивает высокую пропускную, воспроизводимую и масштабируемую подготовку LTSLs.
Introduction
LTSL формулировка является клинически значимым липосомным продуктом, который был разработан для доставки химиотерапевтического препарата доксорубицин (DOX) и позволяет эффективно ежефтом препарат высвобождение при клинически достижимой мягкой гипертермии (Т З 41 КК)1. Формулировка LTSL состоит из 1,2-дипалмитоила-сна -глицеро-3-фосфохолина (ДППК), лисолипида 1-стеароил-2-гидрокси -sn-glycero-3-фосфатидилхолин (MSPC; M означает "моно") и PEGylated липид 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-фосфоэтаноламин-N-метокси (полиэтиленгликоль)-2000" (DSPE-PEG2000). По достижении фазы переходной температуры (Tм З 41 КК), лисолипид и DSPE-PEG2000 вместе облегчить образование мембранных пор, в результате чего взрыв релиз препарата2. При подготовке LTSLs в основном используется объемный подход сверху вниз, а именно гидратация липидной пленки и экструзия. По-прежнему сложно подготовить большие партии с идентичными свойствами и в достаточном количестве для клинического применения3.
Microfluidics является новой техникой для подготовки липосом, предлагая tunable размер наночастиц, воспроизводимость, и масштабируемость3. После оптимизации производственных параметров пропускная часть может быть уменьшена путем параллелизации, при этом свойства идентичны тем, которые подготовлены на скамейке3,4,5. Основным преимуществом микрофлюитики по сравнению с обычными методами навалом является способность обрабатывать небольшие объемы жидкости с высокой управляемостью в пространстве и времени через миниатюризацию, что позволяет быстрее оптимизации, при работе в непрерывной и автоматизированной манере6. Производство липосом с микрофлюидными устройствами достигается за счет подхода нанопрейности снизу вверх, который является более эффективным временем и энергоэффективностью, поскольку гомогенизации процессов, таких как экструзия и sonication являются ненужными7. Как правило, органический раствор (например, этанол) липидов (и гидрофобной полезной нагрузки) смешивается с неверным нерастворимым (например, вода и гидрофильные полезные нагрузки). По мере того как органический растворитель смешивается с нерастворимым, растворимость липидов уменьшается. Концентрация липидов в конечном итоге достигает критической концентрации, при которой процесс осадков срабатывает7. Нанопромицираты липидов в конечном итоге растут в размерах и закрываются в липосому. Основными факторами, определяющими размер и однородность липосом, являются соотношение между неплатежеспособным и растворителем (т.е. соотношение скорости между органическим потоком; FRR) и однородность платежеспособной среды при самосборке липидов в липосомы8.
Эффективное смешивание жидкости в микрофлюитике поэтому имеет важное значение для подготовки однородных липосом, и различные конструкции смесителей были использованы в различных приложениях9. Затененный микромиксора елочки (SHM) представляет собой одно из новых поколений пассивных смесителей, что обеспечивает высокую пропускную мощность (в диапазоне мл/мин) с низким коэффициентом разбавления. Это превосходит традиционные микрофлюидные гидродинамические устройства смешивания8,10. SHM имеет узорчатые канавки из елочки, которые быстро смешивают жидкости хаотическим адвакцией9,11. Короткая шкала времени смешивания SHM (Злт; 5 мс, меньше, чем типичная шкала времени агрегации 10-100 мс) позволяет липидной самосборки происходит в однородной среде растворителя, производя наночастицы с равномерной распределения размера3,12.
Подготовка LTSLs с микрофлюитики, однако, не так просто по сравнению с обычными липосомными составами из-за отсутствия холестерина8, без которых липидные двуслойки восприимчивы к этанол индуцированной интерцифровки13,14,15. До сих пор эффект остаточного этанола, представленного при микрофлюидном производстве липосом, не был хорошо понят. Большинство заявленных составов по своей сути устойчивы к межцифровой (содержащий холестерин или ненасыщенные липиды)16, которые в отличие от LTSLs являются как насыщенными, так и без холестерина.
Протокол, представленный в этом проекте, использует SHM для подготовки LTSL для доставки препарата с книжками с книжки с книжкой. В представленном методе мы обеспечили микрофлюидные ПОДГОТОВЛЕННЫе LTSLs нано-размера (100 нм) и однородны (дисперсия злитрона; 0.2) динамическим рассеянием света (DLS). Кроме того, мы инкапсулировали DOX с помощью метода градиента сульфата аммемов transmembrane (также известного как удаленная загрузка)17 в качестве подтверждения целостности липидного двухслойного LTSL. Удаленная загрузка DOX требует липосомы для поддержания рН-градиента для достижения высокой эффективности инкапсуляции (EE), что вряд ли произойдет без нетронутого липидного двухслойного. В этом представленном методе, отличительном от типичных протоколов подготовки микрофлюидных липосом, требуется шаг аннулирования, прежде чем этанол удаляется, чтобы обеспечить возможность удаленной загрузки; т.е. для восстановления целостности липидного двухслойного.
Как упоминалось ранее, гидрофильные и гидрофобные полезные нагрузки могут также быть введены в первоначальные решения для одновременной инкапсуляции полезных нагрузок при формировании ЛТЛ. В качестве доказательства концепции, индоцианин зеленый (ICG), FDA утвержденных ближнего инфракрасного флуоресцентного красителя, который также является перспективным фототермальным агентом, вводится в начальную липидную смесь и успешно совместно загружены в LTSLs. Лазер 808 нм используется для облучения LTSLs, загруженных DOX/ICG, и успешно индуцировать фототермический разрыв, вызванный нагреванием, в течение 5 минут.
Все инструменты и материалы доступны на коммерческой основе, готовы к использованию и без необходимости настройки. Поскольку все параметры для формулирования LTSLs были оптимизированы, после этого протокола, исследователи без предварительного знания микрофлюитики могли бы также подготовить LTSLs, который служит основой термочувствительной системы доставки лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Установка оборудования
- Соберите шприц насосы и SHM следующим образом.
- Подключите порт "К компьютеру" вторичного шприца насоса (насос 02, для входиного решения) в "К сети" порт мастер шприц насос (насос 01, для этанола липидного раствора) с помощью насоса для насоса сетевого кабеля(рисунок 1, желтый).
- Подключите порт "К компьютеру" мастер насоса в "RS232 Серийный" порт компьютера с помощью ПК для насоса сетевого кабеля(рисунок 1, синий).
- Соедините трубку с каждым из входов и розеток SHM с помощью гайки и ферруле. Преобразуйте терминал труб для обоих входов в женский Luer с помощью другого ореха и ferrule и союзной сборки. Более длинные трубки входов позволяют легче прикрепиться к шприцы(рисунок 2).
- Настройка программного обеспечения для управления насосом.
- Присвоите адрес главного шприца насоса и вторичного шприца насоса "Ad:01" и "Ad:02", соответственно, используя кнопку "Настройка" шприца насоса. Это нужно сделать только в первый раз.
- Откройте программное обеспечение для управления насосом на компьютере. Два шприца насосы должны быть обнаружены автоматически, а затем звуковой сигнал. В противном случае, нажмите насосы и поиск насосов для обновления соединения. (Рисунок 3).
- Присвоить диаметр до 12,45 (мм) по выбору "HSW Норм-Джект 5 cc (Dia-12.45)".
- Присваивай скорость 0,25 мл/мин для насоса 01 (раствор липидов этанола) и 0,75 мл/мин для насоса 02 (вавный раствор). Скорость потока соответствует общей скорости потока (TFR) 1 мл/мин и соотношению скорости потока в результате вака к этанолу (FRR) 3.
- Назначайте объем любым значениям выше 5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Целевой объем инфузии устанавливается больше, чем загруженный объем жидкости с учетом пустого объема труб. - Выберите режим INF (инфузии) для обоих насосов.
- Набор нажатий для подтверждения настроек.
2. Подготовьте LTSL
- Подготовка липидной смеси LTSL10 или LTSL10-ICG (см. таблицу 1).
- Снимите 1 мл липидной смеси и не менее 3 мл (NH4)2SO4 раствора с использованием двух 5 мл Luer блокировки шприцев.
- Установите два шприца на шприц насосы в вертикальном положении, сдвинув баррель флангшку шприца на шприц фиксатор насоса, и поршень флангш шприц на толкач блок насоса (Рисунок 4).
- Заверните конец нагревательной ленты в шприц с помощью вавомного раствора. Оберните другой конец нагревательной ленты и температурный зонд термостата вокруг шприца липидным раствором. Полезно практиковать этот шаг с пустыми шприцев на месте для того, чтобы облегчить процесс сборки (Рисунок 5A).
- Соедините два шприца с женскими адаптерами Luer соответствующих входов SHM. Убедитесь, что шприцы, содержащие липидную смесь и (NH4)2SO4 решения подключены этанола входе и входе, соответственно. Отрегулируйте положение поршеня, чтобы удалить пузырьки воздуха из шприцев(рисунок 5B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что шприцы по-прежнему надежно расположены на шприц фиксатор насосов. - Нагрейте шприцы выше 51 градусов по Цельсию с помощью нагревательной ленты с помощью 10-ситопного сеанса. Разрешить термостат для обновления температуры шприцев. Повторите этот шаг в следующих шагах для поддержания температуры во время инфузии.
ВНИМАНИЕ: Выключите нагревательную ленту через 10 с, чтобы предотвратить превышение температуры и позволить термостату обновить фактическую температуру. Отопительная лента также должна быть обработана с осторожностью, как его температура поднимается очень быстро. Отопление непрерывно может повредить оборудование и шприцы, из-за задержки времени термостата для обновления измеренной температуры. - После того, как температура выше 51 градусов по Цельсию, запустить шприц насосы, нажав Run All в программное обеспечение управления насосом (Рисунок 3).
- Убедитесь, что поток жидкости свободен от пузырьков воздуха и любой утечки. Утилизировать первоначальный объем (около 0,5 мл) жидкости из розетки в качестве отходов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот первоначальный объем отходов не является определенным и зависит от внутреннего объема установки, которая является объем для жидкости для перемещения от шприцев через трубку и SHM в розетку. - Соберите остальную часть жидкости в виде липосомввв в микроцентрифугую трубку или бижу флакон.
- Пауза / остановить настой, когда жидкость в любом из шприцев почти пустой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Насосы должны быть остановлены вручную, так как насосы не могут точно определить положение, когда шприцы пусты. - Поместите собранные липосомы в водяную ванну 60 градусов по Цельсию до 1,5 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет важное значение в обеспечении загрузки наркотиков в липосомы. - Перенос растворов на диализные трубки. Диализ решения против 1 L 240 мМ (NH4)2SO4 при 37 градусах по Цельсию, по крайней мере 4 ч для получения очищенных липосом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Липосомы на этом этапе находятся на 5 мМ фосфолипидов. Очищенные липосомы могут храниться при 4 градусах Цельсия. - Для очистки SHM для повторного использования, промыть SHM последовательно с деионизированной водой, этанол и сухой с азотным газом.
3. Удаленная загрузка DOX в LTSLs трансмембранным градиентом рН
- Обмен внешним буфером LTSL на солен hePES-буфер (HBS) с помощью хроматографии исключения размера (SEC) для установления трансмембранного градиента рН.
- Добавьте в общей сложности 25 мл HBS в верхней части столбца SEC для подготовки столбца. Разрешить всем eluent elute через колонку и распоряжаться eluate.
- Добавьте 1 мл диализированных липосом, приготовленных со ступени 2.12, в колонку и распоряжайте элют.
- Добавьте 1,5 мл HBS в колонку и распоряжайте элют.
- Добавьте 3 мл HBS в колонку и соберите 3 мл elute.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Липосомы собираются на этом этапе и находятся на уровне 1,67 мМ фосфолипидов. Буфер ные обменливли липосомможно хранить при 4 градусах Цельсия.
- Инкубировать LTSLs с доксорубицином (DOX) и очистить LTSLs.
- Добавьте раствор DOX в 1:20 DOX-к-фосфолипидный молярный соотношение в 1 мл буферно-обменного раствора липосом (1,67 ммоль), содержащегося в бижу-флаконе. Этого можно достичь, добавив 48,4 л раствора DOX 1 мг/мл (83,4 мкм).
- Поместите флакон bijou в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 1,5 ч, чтобы позволить DOX нагрузки в липосомы.
- Смешайте 10 зл липосом с 170 зл HBS и 20 ЗЛ 1% (v/v) Раствор Triton X-100 в черной 96-хорошей пластине. Повторите для трех скважин. Эти скважины соответствуют содержанию DOX «до очистки».
- В случае приготовления LTSL10-ICG, смешать 40 л липосом с 160 Л Л ДМСО в прозрачной 96-хорошей пластине. Повторите для трех скважин. Эти скважины соответствуют содержанию ICG «до очистки».
- Очистите липосомный раствор, как описано в шаге 3.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы повторно использовать столбец для будущей очистки, очистите столбец от свободного DOX, сначала добавив 1 мл разбавленного раствора 0,5 M NaOH, прежде чем выполнить шаг 3.1.1. Бесплатный DOX в красном станет фиолетово-синий и elute через колонку быстро. - Смешайте 30 зл и раствор очищенных липосом с 150 зл и 20 ЗЛ 1% (v/v) Раствор triton X-100 в черной 96-хорошей пластине. Повторите для трех скважин. Эти скважины соответствуют содержанию DOX «после очистки».
- В случае LTSL10-ICG смешайте 40 зл очищенного раствора липосом с 160 Зл ДМСО в прозрачной 96-хорошей пластине. Повторите для трех скважин. Эти скважины соответствуют содержанию ICG «после очистки».
- Измерьте интенсивность флуоресценции DOX скважин до (шаг 3.2.3) и после (шаг 3.2.5) очистки, используя считыватель микроплит(no ex 485 nm,em - 590 nm).
- Рассчитайте эффективность инкапсуляции DOX (DOX EE), взяв соотношение интенсивности флуоресценции до и после очистки.
- Измерьте поглощение ICG скважин до и после очистки, используя микроплитный считыватель (от 600 до 1000 нм).
- Рассчитайте эффективность инкапсуляции ICG (ICG EE) с учетом соотношения абсорбции на уровне 792 нм до и после очистки, принимая во внимание фактор разбавления (3 раза) во время очистки.
4. Динамическое рассеяние света (DLS)
- Добавьте 50 л раствора липосом (шаг 2.12) к 450 л деионизированной воды.
- Поместите кювет внутри прибора DLS и выполните измерение в соответствии с инструкциями производителя.
- Запишите средний диаметр и дисперсию по трем измерениям для каждого образца.
5. Дифференциальная сканирующая калория (DSC)
- Концентрата 1 мл образцов липосом (шаг 2.12) с центробежным фильтром до 0,5 мл (окончательная концентрация липидов 10 мМ). Используя ротор с фиксированным углом, вращайтесь при 7500 х г в течение примерно 15 мин.
- Передача 20 qL (NH4)2SO4 раствора и липосомы образцов на две соответствующие кастрюли DSC. Печать кастрюли с DSC герметичные крышки с помощью образца пресс-кит DSC.
- Измерьте образец от 30 до 60 градусов по Цельсию при скорости нагрева 1 кв/мин с помощью дифференциального сканирования калориметра.
- Анализ данных с помощью соответствующего программного обеспечения. Возьмем фазовую температуру перехода (Tm)в качестве начала фазового перехода (пика плавления), который измеряется x-перехватом касательной точки максимального наклона.
6. Доксорубицин релиз
- Разогреть HBS при заданной температуре (37 или 42 градусов по Цельсию) с помощью водяной ванны. Приготовьте ледяную водяную ванну для закалки образцов.
- Добавьте 100 л очищенных DOX-загруженных липосом (шаг 3.2.5) в 1,9 мл HBS в микроцентрифуговой трубке. Поместите трубку в водяную ванну с заданной температурой.
- Немедленно выняйте 200 л образцов из трубки и быстро поместите его в льдовую водяную ванну, чтобы утолить любое последующее высвобождение препарата. Этот образец соответствует начальной (т 0) временной точке.
- Снимите 200 л проб в последующие временные точки (т No 5, 10, 15, 30, 60 мин) и быстро поместите его в ванну с ледяной водой, чтобы утолить любой выброс препарата.
- Смешайте 50 зл и образец каждой временной точки с 150 зл ИФ HBS в черной 96-хорошей пластине. Измерьте интенсивность флуоресценции DOX с помощью считывателя пластин.
- Добавьте 20 КЛ 1% (v/v) Triton X-100 в случайные выбранные скважины, подготовленные в шаге 6.5. Измерьте интенсивность флуоресценции DOX этих скважин с помощью считывателя пластин. Эти значения соответствуют полностью выпущенной (т й й 100% релиз) временной точки.
- Рассчитайте и назначайте процент DOX, выпущенный интерполяцией интенсивности флуоресценции каждого времени (I(t)), по сравнению с начальным (I (0)), и полностью выпущенным значением (I (я)).
7. Лазерное отопление и спуск выпуска
- Установите температуру водяной ванны до 37 градусов по Цельсию и дайте температуре стабилизироваться.
- Добавьте 200 л ЗАКСа, загруженного LTSL10-ICG («ICG» 10 мкг/мл) к прозрачной 96-хорошей пластине, затем поместите ее в водяную ванну, держите дно погруженным в воду.
- Установите ток лазерной системы до 2.27 A. Поместите коллиматор лазерной системы на 5 см вертикально над поверхностью 96-угольной пластины, что соответствует энергетическому потоку 0,5 Вт/см2 -Рисунок 6.
ПРЕДЕКТО: Лазерная система должна работать в соответствии с соответствующими мерами лазерной безопасности. - Включите лазер и контролировать температуру каждую минуту с помощью волоконно-оптического зонда температуры.
- На 5 и 10 мин, снять 10 зЛ лазерно облученных липосом из ясной 96-ну пластины на и смешать с 190 Л HBS для трех скважин в черной 96-хорошо пластины.
- Смешайте 10 зл липосом с 170 зл HBS и 20 зл 1% (v/v) Triton X-100 раствор для трех скважин в черной 96-хорошей пластине. Эти скважины соответствуют "100% выпущен" DOX содержание. Измерьте интенсивность флуоресцентных doX и вычислите релиз DOX, описанный в шаге 6.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для подготовки ЛТЛ с помощью микрофлюиди требуется липидный состав DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, соотношение моляров; LTSL10). На рисунке 7А (слева) показан опорожнение как подготовленного LTSL10 со ступени 2.9, как прозрачной и невязкийой жидкости. Формулировка LTSL10 разработана из обычной формулировки LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000,86/10/4, молярное соотношение), так как LTSL4 образует гелеобразный вязкий образец, о чем свидетельствует большое количество пузырьков воздуха, захваченных в образце(рисунок 7A; справа).
Измерение LTSL10(рисунок 7B, красный) показало, что диаметр и рассеиваемость LTSL10 составили 95,28 и 7,32 нм и 0,100 и 0,022, соответственно, что свидетельствует об успехе эксперимента. На рисунке 7B (серый) также показан неоптимальный образец, который был подготовлен при 20 градусах Цельсия, где были получены более крупные и более рассеянные липосомы.
Рисунок 7C показывает, что DOX EE LTSL10. DOX EE обычно должна быть около 80%. LTSLs, подготовленные обычным методом гидратации липидной пленки с экструзией (LF), включены для сравнения, подготовленные как описано в другом месте18. DOX EE LTSL4 (LF) и LTSL10 (LF) показали достойную загрузку DOX около 70% и 50%, соответственно. Аннеалинг как подготовленный LTSL10 (шаг 2.11) имеет важное значение для обеспечения загрузки DOX. В отсутствие аннулированного шага, низкий DOX EE (злит; 20%) был стойким, независимо от температуры инкубации (от 20 до 42 градусов по Цельсию) и продолжительности (от 1 до 24 ч). Это указывает на неспособность LTSL10 поддерживать трансмембранный градиент рН, где DOX вместо этого загружается пассивно или путем адсорбции. По аннулированию как подготовленный LTSL10, DOX EE значительно увеличился до среднего 85%, что свидетельствует об успехе удаленной загрузки DOX и наличии трансмембранного градиента pH.
На рисунке 7D показан профиль релиза DOX LTSL10. При выпуске инкапсулированных DOX на 60 мин было около 10%. В отличие от этого, при температуре 42 градусов по Цельсию, все инкапсулированные DOX был выпущен в течение 5 минут, демонстрируя температуру чувствительности LTSL10. Аналогичные результаты наблюдались с LTSL10 (LF) в качестве элемента управления.
На рисунке 8 показана температура фазового перехода (Tm) LTSL10, характеризующаяся с помощью дифференциальной сканирующей калории (DSC). Пунктирные линии как касательные точки максимального наклона, добавляются в качестве визуального подсобного эффекта температуры перехода фазы начала (x-перехват касательной линии). LTSL10 имеет относительно широкий фазовый переход с началом на уровне 41,6 градуса по Цельсию и пиком на уровне 42,6 градусов по Цельсию. Аналогичные результаты наблюдались с LTSL10 (LF), что свидетельствует о незначительной разнице между методами приготовления. Для сравнения, LTSL4 (LF) имеет более низкий и более резкий переход фазы, в согласии с литературой1.
На рисунке 9 показана характеристика LTSL10-ICG. Влияние первоначальной концентрации МКГ на размер(рисунок 9А)и эффективность загрузки DOX и ICG(рисунок 9B) классифицируются на три диапазона концентрации. При низкой концентрации МКГ (коэффициент МКГ к липидным молярным данным 0,003; начальная концентрация 60 МКм МКГ и липид ный) в среднем, дисперсия и DOX EE были аналогичны LTSL10 без загрузки ICG; ICG EE составила около 75%. Эффективная созагрузка DOX и ICG в LTSL10 может быть достигнута при такой концентрации ICG. При промежуточных концентрациях МКГ, хотя размер и рассеиваемость проб были удовлетворительными, как DOX, так и ICG EE были уменьшены. В частности, снижение DOX EE указывает на нарушение липосомальной мембраны и, таким образом, рН-градиента. При высоких концентрациях МКГ образцы снова были гелеобразуется; DOX и ICG EE значительно сократились.
LTSL10-ICG был облучены ближнего инфракрасного лазера (раздел 7), чтобы вызвать фототермическое отопление и вызвал выпуск DOX (Рисунок 10). При лазерном облучении образец сначала нагревается до 49,7 градусов по Цельсию с постепенным снижением температуры. Последующее лазерное облучение повысило температуру до 36,7 градуса Цельсия. Количественная оценка выпущенного DOX показала, что полный выброс инкапсулированных DOX был достигнут после первого нагреватого цикла. Это было, как и ожидалось, так как температура достигла выше 42 градусов по Цельсию, в согласии с профилем релиза DOX показано на рисунке 7D. В отличие от этого, LTSL10 без ICG не может обеспечить фототермическое отопление, и, таким образом, не выпустилDOX при лазерном облучении.
Рисунок 1: Фотография установки шприцевых насосов. Порт "К сети" главного насоса (Pump 01) присоединен к "Компьютеру" вторичного насоса (Pump 02; желтый); порт "К компьютеру" главного насоса присоединен к порту RS-232 компьютера (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Фотография установки SHM. (A) Собранный вид установки SHM. (B) Взорванный вид установки SHM. Входы и розетки SHM соединены с трубами с использованием гайки и ферруле. Трубка обоих входов продлевается более длинными трубками с гайкой и феррулем на каждом конце, прекращаемым женским адаптером Luer с помощью профсоюзной сборки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Интерфейс программного обеспечения для управления насосом. Два шприца насосы должны быть обнаружены автоматически при испуге программного обеспечения; в противном случае, нажмите насосы в левом верхнем углу и поиск насосов. Параметры, которые должны быть настроены, выделены в красных коробках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Фотография шприцевых насосов и установка шприца. (A) Шприц фиксатор кронштейн и шприц фиксатор thumbscrew (2, по одному с каждой стороны) шприца насоса (желтый ящик). Pusher блок, регулировка thumbscrew, и диск-орех кнопка (белая кнопка слева) шприц насос (зеленый ящик). (B) Позиция установленного шприца на насосе шприца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Фотография сборки шприцев, нагревательного элемента и SHM. (A) Сборка шприцев, отопительной ленты и термостата. (B) Сборка шприцев, отопительной ленты, термостата и SHM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Фотография лазерной установки. (A) Фотография волокна, связанного с лазерной системой во время работы. (B) Положение коллиматора на 5 см выше 96-колодца пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Характеристика LTSL10. (A) Фотография (слева) LTSL10 и (справа) LTSL4, до диализа. LTSL10 оказался прозрачной и невязкой жидкостью, в то время как LTSL4 был гелеобразным и вязким. (B)диаметр и дисперсия 10 мМ LTSL10, подготовленный при 20 и 51 градусов по Цельсию. Твердые бруски и открытые круги (яп. ) указывают на диаметр и рассеиваемость, соответственно. (C) DOX EE LTSL4 (LF; белый), LTSL10 (LF; белый) и LTSL10 до (серый) и после аннулирования (красный). (D) DOX релиз LTSL10 (круг) и LTSL10 (LF; крест) при 37 КК (черный) и 42 C (красный). Данные представляют собой среднее sD, по крайней мере, три независимых эксперимента. р Злт; 0,001; двуххвостые неспаренные т-тесты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Тепловые свойства LTSL10. Термографы LTSL4 (LF), LTSL10 (LF) и LTSL10, характеризующиеся DSC. Пунктирные линии добавляются в качестве визуального пособия температуры перехода фазы начала. Данные представляют собой среднее, по крайней мере, трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9: Характеристика LTSL10-ICG. (A)диаметр (красный) и дисперсия (синий) ICG-загруженного LTSL10. (B) DOX EE (красный) и ICG EE (зеленый) ICG-загруженный LTSL10. Данные представляют собой среднее sD, по крайней мере, три независимых эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 10: Лазерно-индуцированное фототермическое отопление спровоцировало выпуск DOX-загруженных LTSL10 и LTSL10-ICG. (A) Температура облученных образцов и (B) DOX релиз DOX-загруженных LTSL10 (синий) и LTSL10-ICG (красный) во время лазерного индуцированного фототермального нагрева. Данные представляют собой среднее sD, по крайней мере, три независимых эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Таблица 1: Липидные смеси, буферы и фондовые решения.
| Липидная смесь LTSL10 20 мМ (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000; 80/10/10, соотношение моляров) |
Для 1 мл 20 мм ЛИПидной смеси LTSL10: Растворите 11,75 мг DPPC с 210 л бульона ЭТАнола MSPC (5 мг/мл), 558 Л Л DSPE-PEG2000 этанола (10 мг/мл) и 232 л этанола. Кроме того, эквивалентное количество MSPC (1,05 мг) и DSPE-PEG2000 (5,58 мг) могут быть добавлены в качестве порошка. |
| Липидная смесь LTSL10-ICG 20 мМ (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000; 80/10/10, соотношение моляров; Соотношение МСГ к липидным молярным 0,003) |
Для 1 мл 20 мМ ICG-загруженной липидной смеси LTSL10: Растворите 11,75 мг DPPC с 210 л запасов этанола MSPC (5 мг/мл), 558 л DSPE-PEG2000 этанола (10 мг/мл) и 46,5 л запасов этанола ICG (1 мг/мл) и 185,5 л этанола. Кроме того, эквивалентное количество MSPC (1,05 мг) и DSPE-PEG2000 (5,58 мг) могут быть добавлены в качестве порошка. Содержит 60 МКМ МКГ и 20 мм липидов. |
| 240 мМ раствор сульфата аммония (NH4)2SO4, рН 5.4 | Растворите 31,71 г (NH4)2SO4 на l деионизированной воды. рН раствора является родным 5.4, дополнительная регулировка рН не требуется. |
| Раствор доксорубицин (DOX), 1 мг/мл | Растворите 1 мг DOX на мл деионированной воды. |
| DSPE-PEG2000 этанол, 10 мг/мл | Растворите 10 мг DSPE-PEG2000 на мл этанола. |
| HEPES-буферный солен (HBS), рН 7.4 | Растворите 8,0 г NaCl и 4,766 г HEPES на L деионизированной воды. Отрегулируйте pH до 7.4 с решением 2.5 M NaOH. |
| ICG этанол бульон, 1 мг/мл | Растворите 1 мг МГ на мл этанола. |
| MSPC этанол бульон, 5 мг/мл | Растворите 5 мг DPPC на мл этанола. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный протокол описывает подготовку низкотемпературно чувствительных липосом (LTSLs) с использованием ступенчатой елочки micromixer (SHM). Формулировка LTSL10 позволяет высвобождение доксорубицина с температурой в течение 5 минут при клинически достижимой гипертермической температуре 42 градусов по Цельсию. Индоцианин зеленый (ICG) также может быть совместно загружен для фототермального нагрева вызвало выпуск DOX. Метод опирается на: i) самосборку фосфолипидов в липосомы в гомогенизированной платежеспособной среде, обеспечиваемой быстрым, хаотичным смешиванием этанола и сульфата аммония в растворе SHM11; ii) аннулирование липосом для сохранения целостности липидного двухслойного слоя, необходимого для загрузки DOX; и iii) удаленная загрузка DOX в LTSLs сульфатом аммония рН-градиент17. Поскольку оборудование, использованное в этом протоколе, является коммерчески доступным в наличии и параметры оптимизированы, этот подход является управляемым для пользователей без предварительного знания или микрофлюитики.
Одним из наиболее важных шагов в протоколе является обеспечение правильной защиты всей сборки и правильного влитого жидкости (шаг 2.5). Поскольку воспроизводимость самосборки липосом опирается на гомогенизированную платежеспособную среду, любая нестабильность, такая как вытеснение шприцев или введение пузырьков воздуха, нарушит стабильность потока жидкости и приведет к неоптимальным липосомного размера и дисперсии. Это также обоснование за шагом 2.8, где объем, состоящий из жидкости, первоначально занимающей канал и до достижения стабильного потока, должен быть утилизирован.
Вторым важным шагом для успешного эксперимента является этап аннулирования, позволяющий повысить doX EE (шаг 2.11). В безхолестериновых липосомах, микель-образующих мембранных компонентов (т.е. MSPC и DSPE-PEG2000)будет накапливаться на границах зерна с высокой степенью дефектов для размещения высокой кривизны мембраны2. Эти механизмы термодинамически благоприятствуют образованию и стабилизации мембранных пор, открытых липосом или двухслойных дисков. Низкий DOX EE LTSL10 без аннулирования предположил, что пористые структуры существовали даже ниже Tм, в результате отсутствия градиента рН, необходимого для загрузки DOX (Рисунок 7C). Преждевременное образование пор ниже Tм не наблюдалось для LTSLs, подготовленного липидной пленкой (LTSL4 (LF) и LTSL10 (LF)), где аннулирование не требуется. Кроме того, холестеринсодержащие составы, подготовленные микрофлюидами, также не требуют аннулирования8. Поэтому предполагается, что преждевременное образование пор является комбинированным эффектом присутствия этанола во время препарата и недостатком холестерина в липидном двухслойном. Структурные дефекты в двухслойной мембране, как сообщается, будут устранены путем аннулирования липосом выше Tm,что позволяет липидным молекулам перераспределять однородно и дефекты, которые должны быть исправлены19. Кроме того, процесс аннулирования является необратимым процессом, когда annealed липосомы, возвращающиеся к температуре ниже Tм, не воссоздают вытекающие пузырьки19, в соответствии с annealed LTSL10.
Природа микрофлюидной подготовки липосомы является процессом нанопренции, который требует двух неверных растворителей с характерной растворительностью для липидов: как правило, этанола (как липидный растворитель) и вавного растворителя (как липидный нерастворитель). Таким образом, наличие этанола неизбежно. Таким образом, формулировки, которые чувствительны или склонны к алкоголю индуцированной межцифровой13, таких как холестерин липосомы20, может потребовать изменения формулировки или повторной оптимизации протокола. Как показано при подготовке LTSL4, был получен высоковязкий гель(рисунок 7А),что, вероятно, было связано с образованием межцифрового геля фазы15. С другой стороны, LTSL10, с его более высокой концентрацией полимера, что предотвращает межоцифровку21, был подготовлен успешно. Следовательно, процедура удаления этанола также должна быть выполнена; здесь он был удален просто диализом. В то время как на чипе непрерывной очистки методов, таких как тангенциальная фильтрация потока (способныкакыкак как удаление этанола и буфер обмена) были разработаны22,23, их реализация (как один чип или модульный) находятся за целью этого протокола. Тем не менее, в будущем, мы ожидаем, что эти модульные или стандартизированные конструкции будут оптимизированы и увеличены в доступности, оптимизация микрофлюидного производственного процесса.
Еще одним ограничением протокола является потеря образца из-за расстояния перемещения жидкостей, а именно первоначальный объем отходов (шаг 2.8), а также последняя часть растворов, которые будут введены, но не достигнет розетки. Эти потери образцов практически неизбежны и могут способствовать значительной части объема подготовки на производстве на скамейке, особенно в тех случаех, когда необходимо подготовить небольшой объем или драгоценные образцы. При необходимости, восстановление липидов может быть количественно высокой производительности жидкой хроматографии-испарительного света рассеяния детектор метод, который позволяет быстрой количественной концентрации липидов24. Однако после оптимизации и масштабирования этого процесса, например с помощью более крупного шприца или резервуара жидкости, пропускная связь может быть дополнительно масштабирована, а потери выборки будут менее значительными.
Основное различие между этим методом и существующим методом подготовки заключается в том, что липосомы самостоятельно собираются в контролируемой платежеспособной среде с высокой пропускной способностью, непрерывно. Метод липидной пленки представляет собой процесс серийного производства и требует гомогенизации размера. Хотя это и осуществимо на скамейке масштаба, она по-прежнему является сложной задачей для расширения для клинического производства. В рамках существующих микрофлюидных методов, например, микрофлюидной гидродинамической фокусировки, SHM предлагает более короткую шкалу времени смешивания11 и большую пропускную мощность (в диапазоне мл/мин) с более низким коэффициентом разбавления; несмотря на подготовку LTSLs не было сообщено с использованием других микрофлюидных устройств до сих пор. Основным преимуществом нашего подхода является высокопроизводительная, масштабируемая выработка термочувствительных липосом.
До сих пор наш микрофлюидный протокол предлагает непрерывное производство LTSL10 с возможностью загрузки лекарств. Полезные нагрузки, кроме DOX и ICG, также жизнеспособны. Однако удаление этанола с помощью диализа, дистанционной загрузки лекарств и очистки столбцей SEC остается в виде пакетных процессов и являются узкими местами общего процесса разработки. Дальнейшее развитие может быть сосредоточено на использовании микрофлюидных подходов (таких, как фильтрация касательного потока) для повышения пропускной способности этих процессов ниже по течению и повышения масштабируемости протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Рака предстательной железы Великобритании (CDF-12-002 стипендий), и инженерных и физических наук научно-исследовательский совет (EPSRC) (EP/M008657/1) для финансирования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer - Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
References
- Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin. Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).
- Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).
- Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
- Chen, D., et al. Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).
- Forbes, N., et al. Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring. International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).
- Dittrich, P. S., Manz, A.
- Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).
- Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content. International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).
- Suh, Y. K., Kang, S. A.
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Stroock, A. D.
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Patra, M., et al. Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers. Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).
- Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine. Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).
- Lu, J., Hao, Y., Chen, J. Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary. Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).
- Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes. Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).
- Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).
- Sadeghi, N., et al. Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).
- Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).
- Komatsu, H., Okada, S. Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes. BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation. Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).
- Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions. Pharmaceutical Research. , (2005).
- Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes. Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).
- Kim, S. -H., Kim, J. W., Kim, D. -H., Han, S. -H., Weitz, D. A. Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device. Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).
