Summary
Protokollet presenterar de optimerade parametrarna för att förbereda termokänsliga liposomer med hjälp av den förskjutna sillbensmikromixerns mikrofluidiksenhet. Detta gör också co-inkapsling av doxorubicin och indocyanin grön i liposomer och fototermisk-utlöst release av doxorubicin för kontrollerad / utlöst drog release.
Abstract
Det presenterade protokollet möjliggör en kontinuerlig förberedelse av lågtemperaturkänsliga liposomer (LTSLs), som kan ladda kemoterapeutiska läkemedel, såsom doxorubicin (DOX). För att uppnå detta injiceras en mikrofluidisk anordning för etanollipidoch ammoniumsulfat i en förskjuten sillbensmikromixer (SHM). Lösningarna blandas snabbt av SHM, vilket ger en homogen lösningsmedelsmiljö för liposomer självmontering. Samlade liposomer är först glödde, sedan dialyzed att ta bort kvarvarande etanol. En ammoniumsulfatpatgradient upprättas genom buffertutbyte av den externa lösningen genom att använda storleksuteslutningkromatografi. DOX laddas sedan på distans i liposomerna med hög inkapsling effektivitet (> 80%). Liposomerna erhålls är homogena i storlek med Z-genomsnittlig diameter på 100 nm. De kan temperaturutlöst burst release av inkapslade DOX i närvaro av mild hypertermi (42 °C). Indocyanin grön (ICG) kan också co-loaded i liposomerna för nära infraröd laser-utlöst DOX release. Den mikrofluidiska metoden säkerställer hög genomströmning, reproducerbar och skalbar beredning av LTSL.
Introduction
LTSL formulering är en kliniskt relevant liposomal produkt som har utvecklats för att leverera kemoterapi läkemedel doxorubicin (DOX) och möjliggör effektiv burst läkemedelsrelease på kliniskt uppnåelig mild hypertermi (T ≈ 41 °C)1. LTSL-formuleringen består av 1,2-dipalmitoyl- sn-glycero-3-fosphocholine (DPPC), lysolipid 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosfatidylcholine(MSPC; M står för "mono") och PEGylated lipid 1,2-distearoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[metoxi(polyetenglykol)-2000] (DSPE-PEG2000). Vid att nå fasen övergångstemperaturen (Tm ≈ 41 °C), lysolipidoch DSPE-PEG2000 tillsammans underlätta bildandet av membranporer, vilket resulterar i en bristning release av läkemedlet2. Beredningen av LTSLs använder främst en bulk top-down strategi, nämligen lipidfilm hydrering och extrudering. Det är fortfarande utmanande att reproducera stora partier med identiska egenskaper och i tillräckliga mängder för kliniska tillämpningar3.
Microfluidics är en framväxande teknik för att förbereda liposomer, som erbjuder avstikanlig nanopartikelstorlek, reproducerbarhet och skalbarhet3. När tillverkningsparametrarna är optimerade kan dataflödet skalas upp genom parallellisering, med egenskaper som är identiska med dem som bereds på bänkskala3,4,5. En stor fördel med mikrofluidik över konventionella bulktekniker är förmågan att hantera små vätskevolymer med hög kontrollerbarhet i tid och rum genom miniatyrisering, vilket möjliggör snabbare optimering, samtidigt som den arbetar på ett kontinuerligt och automatiserat sätt6. Produktion av liposomer med mikrofluidiska enheter uppnås genom en bottom-up nanoprecipitation strategi, vilket är mer tid och energieffektiva eftersom homogenisering processer såsom extrudering och ultraljudsbehandling är onödiga7. Typiskt, en organisk lösning (t.ex. etanol) av lipider (och hydrofoba nyttolast) blandas med en okhärbar icke-lösningsmedel (t.ex. vatten och hydrofil nyttolast). Eftersom det organiska lösningsmedlet blandas med icke-lösningsmedel reduceras lösligheten för lipiderna. Lipidkoncentrationen når så småningom en kritisk koncentration där nederbördsprocessen utlöses7. Nanoprecipitates av lipider växer så småningom i storlek och nära till en liposom. De viktigaste faktorerna som styr liposomernas storlek och homogenitet är förhållandet mellan icke-lösningsmedel och lösningsmedel (dvs. vatten- och organiskt flödesförhållande. FRR) och homogeniteten i lösningsmedelsmiljön under självmontering av lipider till liposomer8.
Effektiv vätskeblandning i mikrofluidik är därför avgörande för beredningen av homogena liposomer, och olika mönster av blandare har använts i olika tillämpningar9. Staggered sillben mikromixer (SHM) representerar en av de nya generationerna av passiva blandare, vilket möjliggör hög genomströmning (inom mL/min) med en låg utspädningsfaktor. Detta är överlägsen traditionella mikrofluidiska hydrodynamiska blandningsanordningar8,10. SHM har mönstrade sillben spår, som snabbt blanda vätskor genom kaotisk advection9,11. Den korta blandningstidsskalan för SHM (< 5 ms, mindre än den typiska aggregeringstidsskalan på 10–100 ms) gör att lipidsjälvmontering kan ske i en homogen lösningsmedelsmiljö, vilket producerar nanopartiklar med enhetlig storleksfördelning3,12.
Beredningen av LTSLs med mikrofluidik är dock inte lika enkelt jämfört med konventionella liposomala formuleringar på grund av bristen på kolesterol8, utan vilka lipidbilager är mottagliga för etanol-inducerad interdigitation13,14,15. Hittills har effekten av restetanol presenterar under den mikrofluidiska produktionen av liposomer inte har förståtts väl. Majoriteten av de rapporterade formuleringarna är i sig resistenta mot interdigitation (som innehåller kolesterol eller omättade lipider)16, som till skillnad från LTSLs är både mättade och kolesterolfria.
Protokollet som presenteras häri använder SHM för att förbereda LTSL för temperatur utlöst frisättning drogleverans. I den presenterade metoden såg vi till att de mikrofluidiska it-ltslärna är nanostora (100 nm) och enhetliga (spridning < 0,2) genom dynamisk ljusspridning (DLS). Dessutom inkapslade vi DOX med transmembraneammoniumsulfatgradientmetoden (även känd som fjärrbelastning)17 som en validering av integriteten hos LTSL lipidbilayer. Fjärrbelastning av DOX kräver liposomen för att upprätthålla en pH-gradient för att uppnå hög inkapsling effektivitet (EE), vilket är osannolikt att hända utan en intakt lipid bilayer. I denna presenterade metod, särskiljande från typiska mikrofluidiska liposom preparatprotokoll, krävs ett glödgningssteg innan etanolen tas bort för att möjliggöra fjärrladdningskapacitet; dvs. för att återställa lipidbilagrets integritet.
Som tidigare nämnts kan hydrofila och hydrofoba nyttolaster också introduceras till de ursprungliga lösningarna för samtidig inkapsling av nyttolaster under bildandet av LTSL. Som ett proof-of-concept, indocyanin grön (ICG), en FDA-godkänd nära infraröd fluorescerande färgämne, som också är en lovande fototermisk agent, introduceras till den ursprungliga lipidblandningen och framgångsrikt co-loaded i LTSLs. En 808 nm laser används för att bestråla DOX / ICG-laddade LTSLs och framgångsrikt inducera fototermisk uppvärmning-utlöst burst release av DOX inom 5 min.
Alla instrument och material är kommersiellt tillgängliga, färdiga att använda, och utan behov av anpassning. Eftersom alla parametrar för att formulera LTSL har optimerats, enligt detta protokoll, forskare utan förkunskaper om mikrofluidik kan också förbereda LTSLs, som fungerar som grund för en termostal läkemedel leveranssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Installation av utrustning
- Montera sprutpumparna och SHM enligt följande.
- Anslut den sekundära sprutpumpens "Till dator"-port (pump 02, för vattenlösning) till huvudsprutapumpens "To Network"-port (pump 01, för etanollipidlösning) med pump till pumpnätverkskabel(bild 1,gul).
- Anslut huvudpumpens "Till dator"-port till porten "RS232 Serial" på datorn med hjälp av pc för att pumpa nätverkskabel(bild 1,blå).
- Anslut slangar till var och en av shm-inloppen och uttagen med en mutter och ferrule. Konvertera slangens terminal för både inlets till kvinnliga Luer med en annan mutter och ferrule och en unionförsamling. Längre slangar av inloppen gör det lättare att fästa sprutorna(figur 2).
- Ställ in pumpstyrningsprogrammet.
- Tilldela adressen till huvudsprutan och sekundär sprutpump till "Ad:01" respektive "Ad:02", med hjälp av sprutpumpens "Setup"-knapp. Detta behöver bara göras för första gången.
- Öppna pumpstyrningsprogramvaran på datorn. De två sprutpumparna ska detekteras automatiskt, följt av ett pipande ljud. Annars klickar du på Pumpar och Sök efter pumpar för att uppdatera anslutningen. (Figur 3).
- Tilldela diameter till 12,45 (mm) genom att välja "HSW Norm-Ject 5 cc (Dia=12.45)".
- Tilldela hastighet till 0,25 ml/min för pump 01 (etanollipidlösning) och 0,75 ml/min för pump 02 (vattenlösning). Flödeshastigheterna motsvarar en total flödeshastighet (TFR) på 1 ml/min och vattentäckningsgraden (FRR) på 3.
- Tilldela volym till alla värden över 5 ml.
OBS: Den riktade infusionsvolymen är större än den laddade vätskevolymen med tanke på slangens tomrumsvolym. - Välj INF-läge (infusion) för båda pumparna.
- Tryck på Ange för att bekräfta inställningarna.
2. Förbereda LTSL
- Förbered en LTSL10 eller LTSL10-ICG lipidblandning (se tabell 1).
- Dra tillbaka 1 ml lipidblandning och minst 3 ml (NH4)2SO4-lösning med två 5 ml Luer-låssprutor.
- Montera sprutars två sprutor på sprutarpumparna i upprätt läge genom att skjuta sprutans pipfläns till pumpens sprutahållare och sprutans kolvfläns på pumpens matarblock (bild 4).
- Linda änden av värmetejpen till sprutan med vattenlösning. Linda termostatens andra ände av värmetejpen och temperatursonden runt sprutan med lipidlösningen. Det är bra att öva detta steg med tomma sprutor på plats för att underlätta monteringsprocessen(figur 5A).
- Anslut de två sprutorna till de kvinnliga Luer-adaptrarna i motsvarande inlopp i SHM. Se till att sprutorna som innehåller lipidblandningen och (NH4)2SO4-lösningar är anslutna etanolinlopp och vattenhaltiginlopp. Justera kolvläget för att ta bort luftbubblor från sprutorna(bild 5B).
Obs: Se till att sprutorna fortfarande är ordentligt placerade på pumparnas spruthållare. - Värm upp sprutorna till över 51 °C med hjälp av värmetejpen med en uppvärmningssession på 10 s. Låt termostaten uppdatera sprutornas temperatur. Upprepa detta steg i följande steg för att bibehålla temperaturen under infusionen.
VARNING: Stäng av värmetejpen efter 10 s för att förhindra att temperaturöverskridsningen och låt termostaten uppdatera den faktiska temperaturen. Värmetejpen bör också hanteras med försiktighet när temperaturen stiger mycket snabbt. Uppvärmning kan kontinuerligt skada utrustningen och sprutorna på grund av termostatens tidsfördröjning för uppdatering av den uppmätta temperaturen. - När temperaturen är över 51 °C kör du sprutpumparna genom att trycka på Kör allt i pumpstyrningsprogrammet ( bild3).
- Se till att vätskeflödet är fritt från luftbubblor och eventuella läckage. Kassera den ursprungliga volymen (ca 0,5 ml) vätska från utloppet som avfall.
OBS: Denna ursprungliga avfallsvolym är inte bestämd och beror på den inre volymen av installationen, vilket är volymen för vätska att färdas från sprutorna genom slangen och SHM till utloppet. - Samla resten av vätskan som liposom prover i ett mikrocentrifugrör eller bijou injektionsflaskan.
- Pausa/stoppa infusionen när vätskan i någon av sprutorna är nästan tom.
OBS: Pumparna bör stoppas manuellt, eftersom pumparna kanske inte exakt känner av läget när sprutorna är tomma. - Placera de samlade liposome lösningari en 60 ° C vattenbad till anneal för 1,5 h.
OBS: Detta steg är viktigt för att möjliggöra droglastning i liposomerna. - Överför lösningarna till dialysrör. Dialyze lösningarna mot 1 L av 240 mM (NH4)2SO4 vid 37 °C för minst 4 h för att erhålla renade liposomer.
Protokollet kan pausas här. Liposomer på detta steg är på 5 mM av fosfolipid. Renade liposomer kan förvaras vid 4 °C. - För att rengöra SHM för upprepad användning, spola SHM sekventiellt med avjoniserat vatten, etanol och torka med kvävegas.
3. Fjärrbelastning av DOX i LTSL:er genom transmembranepgradient
- Byt ut extern buffert av LTSL:er till HEPES-buffrad koks (HBS) med hjälp av sec (size exclusion chromatography) för att upprätta en transmembranepgradient.
- Lägg till totalt 25 ml HBS högst upp i en SEC-kolumn för att förbereda kolumnen. Låt alla eluent elute genom kolonnen och kassera eluate.
- Lägg till 1 ml dialyzed liposomer, beredda från steg 2.12, till kolonnen och kassera elute.
- Lägg till 1,5 ml HBS i kolumnen och kassera elute.
- Lägg till 3 ml HBS i kolumnen och samla in tre ml elute.
Protokollet kan pausas här. Liposomer samlas in i detta steg och är på 1,67 mM fosfolipid. Buffertutbytta liposomer kan lagras vid 4 °C.
- Inkubera LTSLs med doxorubicin (DOX) och rena LTSLs.
- Lägg DOX lösning i 1:20 DOX-till-fosfolipid molar förhållandet i 1 ml buffert-utbytte liposomer lösning (1,67 mmol) som finns i en bijou injektionsflaskor. Detta kan uppnås genom att tillsätta 48,4 μl 1 mg/ml DOX-lösning (83,4 μmol).
- Placera bijou injektionsflaskan i ett vattenbad på 37 °C för 1,5 h för att dox-lasta i liposomerna.
- Blanda 10 μl av liposomerna med 170 μL HBS och 20 μL på 1% (v/v) Triton X-100 lösning i en svart 96-brunnsplatta. Upprepa för tre brunnar. Dessa brunnar motsvarar "före rening" DOX innehåll.
- Vid beredning AV LTSL10-ICG, blanda 40 μl av liposomerna med 160 μl DMSO i en klar 96-brunnsplatta. Upprepa för tre brunnar. Dessa brunnar motsvarar "före rening" ICG innehåll.
- Rena liposome lösningen som beskrivs i steg 3.1.
OBS: Om du vill återanvända kolumnen för framtida rening rengör du kolumnen från gratis DOX genom att först lägga till 1 ml utspädd 0,5 M NaOH-lösning innan du utför steg 3.1.1. Gratis DOX i rött kommer att bli violett-blå och elute genom kolumnen snabbt. - Blanda 30 μl av den renade liposomlösningen med 150 μL HBS och 20 μL på 1% (v/v) Triton X-100 lösning i en svart 96-brunnsplatta. Upprepa för tre brunnar. Dessa brunnar motsvarar "efter rening" DOX innehåll.
- Vid LTSL10-ICG, blanda 40 μl av den renade liposomerlösningen med 160 μL DMSO i en klar 96-brunnsplatta. Upprepa för tre brunnar. Dessa brunnar motsvarar "efter rening" ICG innehåll.
- Mät DOX-fluorescensintensiteten för brunnarna före (steg 3.2.3) och efter (steg 3.2.5) rening, med hjälp av en mikroplattläsare (λex = 485 nm, λem = 590 nm).
- Beräkna inkapslingseffektiviteten hos DOX (DOX EE) genom att ta förhållandet mellan fluorescensintensiteterna före och efter rening.
- Mät ICG-absorbansen av brunnarna före och efter rening, med hjälp av en mikroplattaläsare (600 till 1000 nm).
- Beräkna inkapslingseffektiviteten hos ICG (ICG EE) genom att ta förhållandet mellan absorbansen vid 792 nm före och efter rening, med beaktande av utspädningsfaktorn (3 gånger) under reningen.
4. Dynamisk ljusspridning (DLS)
- Tillsätt 50 μl liposomerlösning (steg 2.12) till 450 μl avjoniserat vatten.
- Placera cuvett inuti DLS-instrumentet och utför mätningen enligt tillverkarens anvisningar.
- Registrera genomsnittlig Z-genomsnittlig diameter och spridning av tre mätningar för varje prov.
5. Differentiell skanningscalorimetri (DSC)
- Koncentrera 1 ml av liposomernaprover (steg 2.12) med en centrifugalfilterenhet till 0,5 ml (slutlig lipidkoncentration på 10 mM). Snurra vid 7500 x g med en rotor med fast vinkel i ca 15 min.
- Överför 20 μl (NH4)2SO4-lösning och liposomer prover till två respektive DSC pannor. Täta kastrullerna med DSC hermetiska lock med hjälp av DSC provpresskit.
- Mät provet från 30 °C till 60 °C med en uppvärmningshastighet på 1 °C/min med hjälp av en differentialskanningskylmeter.
- Analysera data med lämplig programvara. Ta fasövergångstemperaturen (Tm)som början av fasövergången (smälttoppen), som mäts med x-skärningspunkten av tangenten för den maximala lutningspunkten.
6. Doxorubicin release
- Förvärm HBS vid bestämd temperatur (37 eller 42 °C) med hjälp av ett vattenbad. Förbered ett isvattenbad för att släcka proverna.
- Tillsätt 100 μl renade DOX-laddade liposomer (steg 3.2.5) i 1,9 ml HBS i ett mikrocentrifugrör. Placera röret i vattenbadet av den angivna temperaturen.
- Dra omedelbart tillbaka 200 μl prover från röret och placera den snabbt i isvattenbadet för att släcka eventuella efterföljande läkemedelsutsläpp. Det här exemplet motsvarar den ursprungliga (t = 0) tidspunkten.
- Dra tillbaka 200 μL prover vid efterföljande tidpunkter (t = 5, 10, 15, 30, 60 min) och placera den snabbt i isvattenbadet för att släcka eventuella drogutsläpp.
- Blanda 50 μl prov av varje gångpunkt med 150 μl HBS i en svart 96-brunnsplatta. Mät DOX-fluorescensintensiteten med en plattläsare.
- Tillsätt 20 μL på 1% (v/v) Triton X-100 i slumpmässiga utvalda brunnar beredda i steg 6.5. Mät DOX fluorescensintensiteten hos dessa brunnar med hjälp av en plattläsare. Dessa värden motsvarar den helt frigjorda (t = ∞; 100% release) tidspunkten.
- Beräkna och rita in procentandelen DOX som frigörs genom att interpolera fluorescensintensiteten för varje gångpunkter (I(t)), jämfört med den ursprungliga (I(0)) och helt släppt (I(∞)), värde.
7. Laseruppvärmning och utlöst frisättning
- Ställ in vattenbadtemperaturen till 37 °C och låt temperaturen stabiliseras.
- Tillsätt 200 μl DOX-lastad LTSL10-ICG ([ICG] = 10 μg/ml) till en klar 96-brunnsplatta, placera den sedan i vattenbadet, håll botten nedsänkt i vatten.
- Ställ in lasersystemets ström till 2,27 A. Placera lasersystemets kollimator på 5 cm vertikalt ovanför ytan på 96-brunnsplattan, vilket motsvarar ett energiflöde på 0,5 W/cm2 [Figur 6].
VARNING: Lasersystemet bör användas i enlighet med relevanta lasersäkerhetsåtgärder. - Slå på lasern och övervaka temperaturen varje minut med hjälp av en fiberoptisk temperatursond.
- Vid 5 och 10 min, dra tillbaka 10 μl laserbestrålade liposomer från den klara 96-brunnsplattan vid och blanda med 190 μL HBS för tre brunnar i en svart 96-brunnsplatta.
- Blanda 10 μl liposomer med 170 μL HBS och 20 μL på 1% (v/v) Triton X-100 lösning för tre brunnar i en svart 96-brunnsplatta. Dessa brunnar motsvarar "100% släppt" DOX innehåll. Mät DOX-lysrörsintensiteten och beräkna DOX-versionen enligt beskrivningen i steg 6.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrofluidikens beredning av LTSL:er kräver lipidsammansättningen av DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, molar-förhållande; LTSL10). Figur 7A (till vänster) visar utseendet på så förberedda LTSL10 från steg 2.9, som en klar och icke-viskös vätska. LTSL10 formulering en form av konventionell formulering, LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86/10/4, molar ratio) eftersom LTSL4 bildar en gel-liknande viskös prov, vilket framgår av den stora mängden luftbubblor fångade i provet(figur 7A; höger).
DLS-mätningen av LTSL10(figur 7B,röd) visade att Z-genomsnittet sens lutistor 95,28 ± 7,32 nm respektive 0,100 ± 0,022, vilket indikerar experimentets framgång. Figur 7B (grå) visar också ett suboptimalt prov, som bereds vid 20 °C, där större och mer spridda liposomer erhölls.
Figur 7C visar att DOX EE av LTSL10. DOX EE bör vanligtvis vara runt 80%. LTSLs som utarbetats av den konventionella metoden för lipidfilmåterfuktning med extrudering (LF) ingår för jämförelse, beredda som beskrivs på andra håll18. DOX EE av LTSL4 (LF) och LTSL10 (LF) visade anständig DOX lastning på cirka 70% och 50%, respektive. Glödgning av så förberedda LTSL10 (steg 2.11) är avgörande för att möjliggöra DOX-lastning. I avsaknad av glödgning sett, låg DOX EE (< 20%) var ihållande, oavsett inkubationstemperatur (20 °C till 42 °C) och varaktighet (1–24 h). Detta indikerade fel på LTSL10 för att upprätthålla en genomskinlig pH-gradient, där DOX i stället lästes in passivt eller av adsorption. Genom att annea den as-förberedda LTSL10, DOX EE ökade betydligt till ett medelvärde på 85%, vilket indikerar framgången för fjärrlastning av DOX och förekomsten av transmembrane pH gradient.
Bild 7D visar DOX-utgivningsprofilen för LTSL10. Vid 37 °C var utsläppet av inkapslade DOX över 60 min ca 10%. Vid 42 °C släpptes däremot alla inkapslade DOX inom 5 minuter, vilket visade ltsl10:s temperaturkänslighet. Liknande resultat observerades med LTSL10 (LF) som en kontroll.
Figur 8 visar fasövergångstemperaturen (Tm)av LTSL10 som kännetecknas med hjälp av differentialskanningscalorimetri (DSC). Prickade linjer som tangent en punkt för maximal lutning, tillsätts som ett visuellt hjälpmedel av den inställda fasen övergångstemperatur (x-avlyssna av tangentlinjen). LTSL10 har en relativt bred fas övergång med debut på 41,6 °C och topp vid 42,6 °C. Liknande resultat observerades med LTSL10 (LF), vilket tyder på en mindre skillnad mellan beredningsteknikerna. Som jämförelse har LTSL4 (LF) en lägre och skarpare fas övergång, i samförstånd medlitteratur1.
Bild 9 visar karakteriseringen av LTSL10-ICG. Effekten av den ursprungliga ICG-koncentrationen på storlek(figur 9A)och laddningseffektivitet av DOX och ICG(figur 9B)kategoriseras i tre koncentrationsområden. Vid låg IKG-koncentration (ICG-till-lipid molar förhållandet 0,003; initial koncentration av 60 μM ICG och 20 mM lipid), Z-genomsnittet, spridning och DOX EE liknade LTSL10 utan ICG lastning; ICG EE var cirka 75%. Effektiv sambelastning av DOX och ICG till LTSL10 kan uppnås vid denna ICG-koncentration. Vid mellanliggande IKG-koncentrationer, medan storleken och spridningav proverna var tillfredsställande, minskade både DOX och ICG EE. I synnerhet indikerade minskningen av DOX EE störningen av liposomalmembranet och därmed pH-gradienten. Vid höga ICG koncentrationer, prover var igen gelled; DOX och ICG EE minskade båda avsevärt.
LTSL10-ICG bestrålades med nära infraröd laser (avsnitt 7) för att inducera fototermisk uppvärmning och utlöste frisättningen av DOX(figur 10). Vid laserbestrålning värmdeprovet först upp till 49,7 °C med en gradvis temperatursänkning. Efterföljande laserbestrålning ökade temperaturen till 36,7 °C. Kvantifieringen av den frisläppta DOX indikerade att en fullständig burst release av inkapslade DOX uppnåddes efter den första uppvärmningscykeln. Detta var som förväntat sedan temperaturen nådde över 42 °C, i samförstånd med DOX release profilen visas i figur 7D. LtSL10 utan ICG kan däremot inte ge fotovärme, och släppte därför inte DOX vid laserbestrålning.
Bild 1: Foto av sprutpumparnas inställning. Befälhavarenpumpens "To Network"-port (Pump 01) är ansluten till den sekundära pumpens "Till-dator"(Pump 02; gul); befälhavarens port "Till dator" är ansluten till datorns RS-232-port (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Foto av SHM-installationen. (A)Monterad vy över SHM-installationen. (B)Sprängvy över SHM-installationen. SHM:s vikar och försäljningsställen är anslutna till slangar med hjälp av en mutter och en ferrule. Slangen av båda inlets en längre slang med mutter och ferrule på varje ände, avslutas av en kvinnlig Luer adapter med hjälp av en union montering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Gränssnitt för pumpkontroll programvara. De två sprutpumparna ska upptäckas automatiskt när programvaran initieras. annars klickar du på Pumpar på det övre vänstra hörnet och Sök efter pumpar. Parametrar som ska konfigureras markeras i röda rutor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Foto av sprutpumparna och installation av en spruta. A)Spruthållare fäste och spruta hållare tumskruv (2, en på varje sida) av sprutan pumpen (gul låda). Tryckblocket, justeringstumskruven och knappen drivmutter (vit knapp till vänster) på sprutapumpen (grön låda). (B)Placering av en installerad spruta på sprutpumpen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Foto av montering av sprutor, värmeelement och SHM. A)Montering av sprutor, värmetejp och termostat. (B)Montering av sprutor, värmetejp, termostat och SHM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Foto av laserinstallationen. (A)Fotografi av fiberkopplat lasersystem under drift. (B)Collimatorens position 5 cm ovanför 96-brunnsplattan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 7: Karakterisering av LTSL10. (A) Fotografi av (vänster) LTSL10 och (höger) LTSL4, före dialys. LTSL10 verkade som klar och icke-viskös vätska, medan LTSL4 var gel-liknande och viskös. B) Z-genomsnittlig diameter och spridning på 10 mM LTSL10 som är beredd vid 20 och 51 °C. Fasta stänger och öppna cirklar (○) indikerar Z-genomsnittlig diameter respektive spridning. (C)DOX EE av LTSL4 (LF; vit), LTSL10 (LF; vit) och LTSL10 före (grå) och efter glödgning (röd). D)DOX-utsläpp av LTSL10 (cirkel) och LTSL10 (LF; kors) vid 37 °C (svart) och 42 °C (röd). Uppgifterna representerar medelvärde ± SD av minst tre oberoende experiment. p < 0,001; tvåstjärtade icke-parade t-tester. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 8: Termiska egenskaper LTSL10. Termografer av LTSL4 (LF), LTSL10 (LF) och LTSL10 kännetecknas av DSC. Prickade linjer läggs till som ett visuellt hjälpmedel för den inställda fasen övergångstemperatur. Data representerar medelvärdet av minst tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 9: Karakterisering av LTSL10-ICG. A) Z-genomsnittlig diameter (röd) och spridning (blå) av ICG-laddade LTSL10. (B)DOX EE (röd) och ICG EE (grön) av ICG-laddade LTSL10. Uppgifterna representerar medelvärdet ± SD för minst tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: Laserinducerad fotovärme utlöste frisättningen av DOX-lastad LTSL10 och LTSL10-ICG. (A)Temperaturen på bestrålade prover och (B)DOX-frisättning av DOX-lastad LTSL10 (blå) och LTSL10-ICG (röd) under laserinducerad fototermisk uppvärmning. Uppgifterna representerar medelvärdet ± SD för minst tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Lipidblandningar, buffertar och lagerlösningar.
| 20 mM LTSL10 lipidblandning (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000; 80/10/10, molar-förhållande) |
För 1 ml av 20 mM LTSL10 lipidblandning: Lös upp 11,75 mg DPPC med 210 μl MSPC etanollager (5 mg/ml), 558 μL DSPE-PEG2000 etanollager (10 mg/mL) och 232 μL etanol. Alternativt kan motsvarande mängd MSPC (1,05 mg) och DSPE-PEG2000 (5,58 mg) tillsättas som pulver. |
| 20 mLTSL10-ICG lipid blandning (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000; 80/10/10, molar-förhållande; ICG-till-lipid molar förhållande = 0,003) |
För 1 ml 20 mM ICG-laddad LTSL10 lipidblandning: Lös upp 11,75 mg DPPC med 210 μl MSPC etanollager (5 mg/ml), 558 μL DSPE-PEG2000 etanollager (10 mg/mL) och 46,5 μl etanollager i CG (1 mg/mL) och 185,5 μL etanol. Alternativt kan motsvarande mängd MSPC (1,05 mg) och DSPE-PEG2000 (5,58 mg) tillsättas som pulver. Innehåller 60 μM ICG och 20 mM lipid. |
| 240 mAmmoniumsulfatlösning (NH4)2SO4,pH 5,4 | Lös 31,71 g (NH4)2SO4 per L av avjoniserat vatten. Lösningens pH-värdet är inbyggt 5,4, ytterligare pH-justering krävs inte. |
| Doxorubicinlösning (DOX), 1 mg/mL | Lös upp 1 mg DOX per ml av avjoniserat vatten. |
| DSPE-PEG2000 etanollager, 10 mg/ml | Lös upp 10 mg DSPE-PEG2000 per ml etanol. |
| HEPES-buffrad koks (HBS), pH 7,4 | Lös 8,0 g NaCl och 4,766 g HEPES per L av avjoniserat vatten. Justera pH till 7,4 med 2,5 M NaOH-lösning. |
| Etanollager för ICG, 1 mg/mL | Lös upp 1 mg ICG per ml etanol. |
| MSPC etanollager, 5 mg/mL | Lös upp 5 mg DPPC per ml etanol. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det presenterade protokollet beskriver beredningen av lågtemperaturkänsliga liposomer (LTSLs) med hjälp av en förskjuten fiskbensmikromixer (SHM). LTSL10-formuleringen möjliggör temperaturutlöst burst release av doxorubicin inom 5 minuter vid en kliniskt uppnåelig hypertermisk temperatur på 42 °C. Indocyanin grön (ICG) kan också co-loaded för fotovärme utlöste utsläpp av DOX. Metoden bygger på: i) självmontering av fosfolipider i liposomer under en homogeniserad lösningsmedelsmiljö som tillhandahålls av den snabba, kaotiska blandning av etanol och ammoniumsulfatlösning i SHM11; ii) glödgning av liposomerna för att bevara integriteten hos lipidbilayer som är väsentliga för DOX lastning, och iii) fjärrbelastning av DOX i LTSL:er med ammoniumsulfat pH-lutning17. Eftersom den utrustning som används i detta protokoll är kommersiellt tillgänglig off-the-shelf och parametrarna är optimerade, är detta tillvägagångssätt hanterbarför användare utan förkunskaper eller mikrofluidik erfarenhet.
Ett av de mest kritiska stegen i protokollet är att se till att hela enheten är ordentligt fastsatt och vätska kan infunderas ordentligt (steg 2.5). Eftersom reproducerbarheten av självmonteringav liposomer bygger på en homogeniserad lösningsmedelsmiljö, kommer all instabilitet, såsom uppbyggnad av sprutor eller införande av luftbubblor, att störa stabiliteten i vätskeflödet och resultera i suboptimala liposome storlek och spridning. Detta är också logiken bakom steg 2.8, där volymen, som består av vätskan som ursprungligen upptar kanalen och innan ett stabilt flöde nås, bör kasseras.
Ett andra kritiskt steg för ett lyckat experiment är glödgningssteget, för att möjliggöra hög DOX EE (steg 2.11). I kolesterolfria liposomer, micelle-bildande membran komponenter (dvs MSPC och DSPE-PEG2000)kommer att ackumuleras vid säd gränser med en hög grad av defekter för att rymma en hög membran krökning2. Dessa arrangemang termodynamiskt gynna bildandet och stabilisera membranporer, öppnade liposomer, eller bilayer skivor. Den låga DOX EE av LTSL10 utan glödgning föreslog att porösa strukturer fanns även under Tm,vilket resulterar i avsaknad av pH lutning krävs för DOX lastning(figur 7C). Den för tidiga bildandet av porer under Tm observerades inte för LTSL som utarbetats av lipidfilm (LTSL4 (LF) och LTSL10 (LF)), där glödgning inte krävs. Dessutom kräver kolesterolhaltiga formuleringar som utarbetats av mikrofluidik inte heller glödgning8. Det spekuleras därför att den för tidiga bildandet av porer är en kombinerad effekt av förekomsten av etanol under beredningen och bristen på kolesterol i lipidbilayer. Strukturella defekter inom bilayer membranet har rapporterats elimineras genom glödgning liposomerna ovanför Tm,vilket gör att lipidmolekyler att omfördela homogent och defekter som skall korrigeras19. Dessutom är glödgningsprocessen en oåterkallelig process där glödgna liposomer återvänder till en temperatur under Tm inte återskapa läckande vesicles19, i samförstånd med glödgitet LTSL10.
Arten av mikrofluidisk beredning av liposom är en nanoprecipitationprocess, som kräver två fördelade lösningsmedel med särskiljande löslighet för lipiderna: typiskt etanol (som lipidlösning) och vattenlösning (som en lipid icke-lösningsmedel). Således är förekomsten av etanol oundviklig. Därför, formuleringar som är känsliga eller benägna att alkohol-inducerad interdigitation13, såsom kolesterolfria liposomer20,kan kräva ändring av formuleringen eller återoptimering av protokollet. Som framgår av beredningen av LTSL4 erhölls den mycket viskösgelen, (figur 7A), vilket sannolikt berodde på bildandet av en fördelad gelfas15. Å andra sidan, LTSL10, med sin högre polymer koncentration som förhindrar interdigitation21, bereds framgångsrikt. Följaktligen måste ett förfarande för avlägsnande av etanol också utföras. här togs den bort helt enkelt av dialys. Medan kontinuerlig reningsteknik på chip som tangentiell flödesfiltrering (som kan både etanolborttagning och buffertutbyte) har utvecklats22,23,är deras genomförande (som ett chip eller modulärt) bortom syftet med detta protokoll. Icke desto mindre, i framtiden förväntar vi oss att dessa modulära eller standardiserade mönster optimeras och ökas i tillgänglighet, effektivisera den mikrofluidiska produktionsprocessen.
En annan begränsning av protokollet är provförlusten på grund av flytandeflytandes resavstånd, nämligen den ursprungliga avfallsvolymen (steg 2.8) samt den sista delen av lösningar som skulle injiceras men inte skulle nå utloppet. Dessa provförluster är nästan oundvikliga och kan bidra till en betydande del av beredningsvolymen vid tillverkning i bänkskala, särskilt när en liten volym eller värdefulla prover skall beredas. Vid behov kan lipidåtervinningen kvantifieras genom högpresterande vätskekromatografi-avdunstningsdetektormetod som möjliggör snabb kvantifiering av lipidkoncentrationer24. Men när processen är optimerad och skalas upp, till exempel genom att använda en större spruta eller vätskebehållare, kan genomflödet skalas upp ytterligare och provförluster skulle vara mindre betydande.
Den största skillnaden mellan denna metod och den befintliga beredningsmetoden är att liposomer är självmonterade i en kontrollerbar lösningsmedelsmiljö på ett höggenomströmningssätt, kontinuerligt sätt. Lipidfilmmetoden är en batchtillverkningsprocess och kräver storlekshomogenisering. Även mycket möjligt på en bänk-skala, är det fortfarande utmanande att skala upp för klinisk produktion. Inom befintliga mikrofluidiska tekniker erbjuder shm till exempel en kortareblandningstidsskala 11 och ett större genomströmningsflöde (inom mL/min) med lägre utspädningsfaktor. Trots att preparatet av LTSL hittills inte har rapporterats med andra mikrofluidiska enheter. Den största fördelen med vårt tillvägagångssätt är hög genomströmning, skalbar produktion av termokänsliga liposomer.
Hittills erbjuder vårt mikrofluidic protokoll kontinuerlig produktion av LTSL10 med droglastning kapacitet. Andra nytt nytt än DOX och ICG är också livskraftiga. Etanolborttagning genom dialys, fjärrbelastning och rening av läkemedel efter SEC kvarstår dock som batchprocesser och är flaskhalsarna i den övergripande formuleringsprocessen. Framtida utveckling skulle kunna fokusera på att utnyttja mikrofluidiska metoder (såsom tangentiell flödesfiltrering) för att förbättra genomströmningen av dessa nedströmsprocesser och öka skalbarheten i protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship), och Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) för finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer - Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
References
- Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin. Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).
- Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).
- Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
- Chen, D., et al. Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).
- Forbes, N., et al. Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring. International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).
- Dittrich, P. S., Manz, A.
- Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).
- Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content. International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).
- Suh, Y. K., Kang, S. A.
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Stroock, A. D.
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Patra, M., et al. Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers. Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).
- Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine. Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).
- Lu, J., Hao, Y., Chen, J. Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary. Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).
- Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes. Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).
- Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).
- Sadeghi, N., et al. Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).
- Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).
- Komatsu, H., Okada, S. Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes. BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation. Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).
- Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions. Pharmaceutical Research. , (2005).
- Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes. Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).
- Kim, S. -H., Kim, J. W., Kim, D. -H., Han, S. -H., Weitz, D. A. Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device. Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).
